Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide

2. Material und Methoden

2.2 Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide

Stammname relevanter Genotyp Referenz oder Quelle DHB4 F’lacI^q pro ∆(ara-leu)7697 araD139∆lacX74 JM-G2 JM101(supE thi-1 ∆(lac-proAB) [F’ traD36

proAB lacI^qZ∆M15] ) ptsG⁺ptsG-lacZ mlc::tet JM-G77 JM101(supE thi-1 ∆(lac-proAB) [F’ traD36

proAB lacI^qZ∆^{M15] )}

rpsL150 relA1deoC1 ptsF25 rbsR flbB5301

(27) TG1 ^F´[lacI^qlacZM15 proAB traD36] hsdD5

supE thi (lac-pro) (pro-lac) (26) DH5α ^F^- ^Θ80d ^lacZ ^∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169

recA endA1 hsdR17 (r_K^—m_K⁺) sup E44 λ^- thi-1 gyrA relA1

(56) ET104 araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rbsR relA1

rpsL150 ∆(argF-lac)U169 øP[(malT-lacZ) (λ placMu50)] ∆cya crp* ilv+ mlc::kan

(39)

ET25 MC4100; Φ(malT-lacZ) ∆cya crp* ilv+ (39)

KD413 MC4100; mlc::tet Katja Decker; Doktorarbeit, Uni-Konstanz

Bre2071 araD139 deoC1 flbB5301 θ(proV-lacZ) hyb2 (λ placMu15) osmZ200 ptsF25 rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169

Bremer, 1992

MV198 agn`-lacZ (agn=flu) (55)

SH10 F^- araC-lacZ leu^- str^-∆^{lac araD}^- Jennifer Ross, John Hopkins University

SE40 MC4100 trp-1 ssuE`-lacZ ∆ssuADCB (161) SE70 MC4100 Θ(tauC-lacZ) (λ^placMu9) ⁽¹⁶¹⁾ MC1061 hsdR mcrB araD139 ∆(araABC-leu)7679

∆lacX174 galU galK rpsL thi

(27) HA18 araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rpsL150

∆(argF-lac)U169 ∆(phoA20)

A. Hartmann, Diplomarbeit Uni-Konstanz

CH4 araD139 flbB5301 øP[malK-lacZ] ptsF25 rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169 ∆^cya

Christiane Braun Vertiefungskurs Uni-Konstanz

RD15 araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169 øP[(malT-lacZ)(λ placMu50)] ∆^cya::kan

Renate Dippel, Uni-Konstanz

DG102 HfrKL16 thi ∆ptsHIcrr Epstein, 1989

CV5200 MG1655 ∆^{lac X74 P}^sgrS^-lacZ ⁽¹⁶³⁾

SA1 MC4100 ptsG ::TN5(kan) diese Arbeit

SA2 KD413 ptsG ::TN5(kan) diese Arbeit

SA5 Bre2071 mlc::tet diese Arbeit

SA6 MV198 mlc::tet diese Arbeit

Stammname relevanter Genotyp Referenz oder Quelle

SA7 SH10 mlc::kan diese Arbeit

SA12 SE70 mlc::tet diese Arbeit

SA13 SE40 mlc::tet diese Arbeit

SA14 MC1061ptsG::TN5(kan) diese Arbeit

SA15 ET25 ptsG::TN5(kan) diese Arbeit

SA17 CH4 ptsG ::Tn5(kan) diese Arbeit

SA19 HA18mlc ::Tn10(tet) diese Arbeit

SA20 ^{SA19 araB}⁺ araB-phoA diese Arbeit

SA34 MC4100 araC-lacZ diese Arbeit

SA35 MC4100 tbpA⁺ tbpA-lacZ diese Arbeit

SA36 MC1061 ∆cya::kan diese Arbeit

Tabelle1. Bakterienstämme – Die Nomenklatur entspricht der von Bachman (1990).

Bei den Reportergenfusionen der Stämme SA20 bis SA35 handelt es sich um transkriptionelle Fusionen.

Phage Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz P1^vir transduzierender Phage Laborsammlung λInCH1 lytischer und lysogener Zyklus möglich;

homologe Berreiche zu pBR322;

ermöglicht das einfügen stabiler lacZ-Fusionen in die λatt-site von E. coli;

(18)

Tabelle 2. Phagen

Plasmid Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz pGDR11 pQE31 Derivat, lacI^q Ap (IPTG induzierbar;

Expressionsvektor; N-term. His-tag-Fusion)

(112)

pSL104 pGDR11 + orf: mlc (BamHI/PstI) (84)

pMlc410 pGDR11 + orf: mlc (BamHI/PstI) ∆18bp dieseArbeit pMlc401 pGDR11 + orf: mlc (BamHI/PstI) ∆36bp diese Arbeit pmlc110 entspricht pSL104; mlc∆Basen562-573 diese Arbeit; (103) pCS19 pQE60 Derivat, lacI^q, AP ; IPTG induzierbar; (150)

Plasmid Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz Expressionsvektor; C-terminale

His-tag-Fusion

pSL105 pCS19 + orf: mlc (NcoI/BamHI) (84)

pTSG11 ^Plac, lacI,AP^R, gesammter orf von ptsG (22) pTZ19R ^Plac, lacI, CAP binding site; bla;entwickelt aus

pUC19

GenBank/EMBL accession number Y14835

pTZ-Gp8 pTZ19 + Gp8 des Phagen M13

pTZ-Gp8-IIB pTZ19 + Gp8 des Phagen M13 + Sequenz der B-Domäne des Enzyms IIBC (PtsG);

entsprechend Aminosäure 391-477 pSA1 pQE60 Derivat, lacI^q, AP ; IPTG induzierbar;

Expressionsvektor;

diese Arbeit pTAC3575 ermöglicht transkriptionelle lacZ und

phoA-Fusionen; AP^R

(6) pSA2 pTAC3575 + potentielle Promotorregion 5`zu

yabN diese Arbeit

pSA3 pTAC3575 + potentielle Promotorregion 5`zu araC

diese Arbeit pSA4 pTAC3575 + regulatorische Region zwischen

araC und araB

diese Arbeit pSA5 pTAC3575 + potentielle Promotorregion 5`zu

tbpA

diese Arbeit pRS415 ermöglicht transkriptionelle lacZ-Fusionen;

AP^R

(147) pSA6 pRS415 + potentielle Promotorregion 5`zu

yeeR

diese Arbeit pBCP206 crr unter P_tac; lacI^q;AP^R (162) pJFBH ^ColE1ori ^{lacI P}tac, Sequenz kodierend für

Aminosäure 390-477 von ptsG in frame an tag kodierende Region (C-Terminaler His-tag)

(22)

pSA9 ^{pGDR11 +}crr (EIIA E.coli) diese Arbeit pBAD18 Expressionsvektor, Indukton durch Arabinose,

AP^R, araC, P_araB

(54)

pSA8 pBAD18 + cyaA diese Arbeit

Plasmid Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz pSA12 pBAD18 + cyaA (Adenylatcyclase E.coli);

katalytische Domäne (AS:0-535 von wt AC.) Expression mit Arabinose induzierbar

diese Arbeit pQE32 Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, P_tac,

AP^R ; N-term. His-tag-Fusion

(129)

pSA11 pQE32 + cyaA (Adenylatcyclase E.coli) diese Arbeit pSA16 pQE32 + cyaA (Adenylatcyclase E.coli);

regulatorische Domäne (AS:538-848 von wt AC.)

diese Arbeit pQE31 Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, P_tac,

AP^R ;N-term. His-tag-Fusion

(129) pSA13 ^{pQE31 +}cyaA (Adenylatcyclase E.coli);

katalytische Domäne (AS:87-535 von wt AC.);

diese Arbeit

pREP4 ^lacI^q^{, Kan}^R ⁽¹²⁹⁾

pHIHO101 =pREP4 Austausch von Kan^R gegen Spec^R Markus Hinderhofer; Uni-Konstanz

pQE60 Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, P_tac, AP^R ;

pmlc_wt pQE60 + Wildtyp mlc Kinga Gerber, Uni-Konstanz

pmlc_AYA pQE60 + mlc mit Austausch in

Metallbindestelle Cystein-Tyrosin-Cystein(AS:

257 – 259) nach Alanin-Tyrosin-Alanin

Kinga Gerber, Uni-Konstanz

pmlc_SYS pQE60 + mlc mit Austausch in

Metallbindestelle Cystein-Tyrosin-Cystein(AS:

257 – 259) nach Serin-Tyrosin-Serin

Kinga Gerber, Uni-Konstanz pTZ19R

pTZ-C9 pTZ19R + C9 (NagC-Bindesequenz) (118) pTZ-M26 pTZ19R + C9 (Mlc-Bindesequenz) (118) pTZ-M120 pTZ19R + C9 (Mlc-Bindesequenz mit

Ver-änderung dh. Negativkontrolle)

(118) Tabelle 3: Plasmide

Oligonukleotid Leserichtung Sequenz

BamHI_yab pSA2-for 5`- aaagaggcggatccagaaag-3´

HindIII_yab pSA2-rev 5`- ccagttcgttaagctttgtgt –3`

araC_PstI pSA3_for 5`- gtaaacccactgcagataccattc-3´

araC_BamHI pSA3-rev 5`-gcgtcaggtaggatccgctaatc–3`

BglII_ara pSA4_for 5`- cgacgctaagatctgcaagc-3

HindIII_ara pSA4-rev 5`-gtgagattgagaatataagctttcattcc–3`

XbaI_tbp pSA5_for 5`- cgccatcttctagagccacc-3´

SalI_tbp pSA5-rev 5`- caactaatctggtcgacttcgc–3 BamHI_yeeR pSA6_for 5`- aggggaggatccagcagacc-3´

EcoRI_yeeR pSA6-rev 5`-tttggcgaattcacctcatcc–3`

BamH1-mlc pMlc410-for 5´-cggatccgatggttgctgaaaaccagcc-3´

Oligonukleotid Leserichtung Sequenz

mlc-∆410-419-PstI pMlc410-rev 5´-aactgcagttaaccgttatacatcgcgtcttttacc-3´

BamH1-mlc pMlc401-for 5´-cggatccgatggttgctgaaaaccagcc-3´

mlc-∆401-419-PstI pMlc401-rev 5´-aactgcagttatgcacgcgcctgccatcgtgc -3´

crr_BglII pSA7-for 5`-gcaagaaagatctcttgatgcg -3´

crr_NcoI pSA7-rev 5`-ggagaagaccatgggtttgttc–3`

cyaA_KpnI pSA8-for 5`-gaaaagtggtaccggttacctttg -3´

crr-BamHI pSA9-for 5'-actgcttaggaggatcccatg-3' crr-PstI pSA9-rev 5'-catttttcactgcagcaagaattac-3'

SphI_cya pSA10-for 5'-CGATACGGCATGCACCTCTATATTG-3'

PstI_cya pSA10-rev 5'-GCTAAGACTGCAGGCCGGATAAG-3'

cyaA_KpnI pSA12-for 5'-GAAAAGTGGTACCGGTTACCTTTG-3' SphI_cya_katDom pSA12-rev 5'- tgtgcatgcaggtcagcgcag -3'

BamHI_cya_regDom pSA15-for 5'- gcacggatcccgaaggcgc -3' PstI_cya pSA15-rev 5'- gctaagactgcaggccggataag -3'

Tabelle4. Oligonukleotide

Die über die Oligonukleotide eingefügten Schnittstellen für Restriktionsenzyme wurden unterstrichen.

2.3 Medien und Wachstumsbedingungen

Im Dokument Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli (Seite 38-42)