3. Ergebnisse
3.1 Mlc und PtsG – Analyse verschiedener Mlc- und EIIB Glc -Varianten
3.1.6 Bestimmen der Quartiärstruktur von Wildtyp Mlc und den Mlc-
Mlc bindet über das N-terminale HTH-Motiv an eine palindrome DNA-Bindesequenz. Dies ist nur möglich, wenn Mlc zumindest ein Dimer aus zwei Mlc Monomeren bildet, wobei jedes an eine Halbseite des Operators bindet (110). Die Bestimmung der Quartiärstruktur unter nativen Bedingungen ergab, dass MlcWT und die ∆9 AS Variante Tetramere bilden. Die ∆18 AS Variante von Mlc eluiert mit der Größe, die einem Dimer entspricht, von der Säule.
MlcH52, wurde unter verschiedenen Pufferbedingungen getestet. Auch für diese Variante konnte gezeigt werden, dass unter den meisten Pufferbedingungen eine Tetramerisierung stattfindet. In einem Puffer (0,8 M MgSO4) wie er für die Kristallisation von MlcH52 verwendet wurde (48), zeigen sich jedoch verschiedene Oligomerisierungszustände von MlcH52. Im Vergleich zu den Eichproteinen eluiert ein Teil des Proteins mit der Größe eines Tetramers, Trimers oder Dimers, während der Hauptteil mit der Größe eines Monomers eluiert.
Zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcWT und den Mlc-Varianten, wurde das Molekulargewicht von Mlc mittels Gelfiltration unter nativen Bedingungen, wie in Kapitel 2.5.7 beschrieben, bestimmt. Aus dem Elutionsvolumen (siehe Abb. 20) wurde die Diffusionskonstante Kav verschiedener Eichproteine ermittelt und gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen (siehe Abb. 21). Aus der damit erhaltenen Eichgerade und der für die Mlc-Varianten ermittelten Kav wurde das Molekulargewicht der Mlc-Varianten abgeschätzt (siehe Tab. 11). Das Monomer des gereinigten Mlc mit N-terminalem His-tag hat ein vorhergesagtes und mittels SDS-PAGE bestätigtes Molekulargewicht von 46 kDa. Geht man von maximal einem Tetramer aus hätte dieses ein Molekulargewicht von 184 kDa. Für Mlc WT ergab sich aus der Gelfiltration ein Molekulargewicht von 183 kDa und für Mlc∆9 eines von 173 kDa, was in beiden Fällen für ein Tetramer aus vier Mlc Monomeren spricht.
Mlc∆18 eluierte als ein Protein mit dem Molekulargewicht von 94 kDa, was in etwa der Größe eines Dimers entspricht (siehe Abb. 20 und Tab. 11). Dass Mlc unter nativen Bedingungen als Tetramer vorliegt, war auch schon von Nam et. al. (2001) (98) bestätigt worden.
Abb. 20: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur der Mlc-Varianten.
Gezeigt sind die Elutionsprofile (von oben nach unten) von Bluedextran2000, der Eichproteine Catalase, Albumin und ChymotrypsinogenA, der Eichproteine Aldolase und Ovalbumin, von MlcWT, Mlc∆9 und Mlc∆18. Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen ist in der Abbildung angegeben.
Abb. 21: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcWT und Mlc∆∆∆∆9, Mlc∆∆∆∆18.
Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen Molekulargewicht von 25 – 232 kDa geeicht (Vierecke/siehe Abb. 20 und Tab.11). Die aus dem Elutionsvolumen ermittelten Kav-Werte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen.
Die Molekulargewichte der Mlc-Varianten (Kreise) wurden mit Hilfe der Kav-Werte und der Eichgerade ermittelt. Die entsprechenden Werte sind in Tab. 11 aufgeführt.
Protein eingesetzte Menge
[mg/ml]
Elutionsvolumen Kav Molekulargewicht [kDa]
Catalse 5 10,673 0,1994 232
Aldolase 2 11,949 0,27867 158
Albumin 7 12,5 0,3129 67
Ovalbumin 7 13,39 0,3682 43
Chymotrypsinogen A 3 15,962 0,52798 25
MlcWT 2,56 10,9 0,21331 182,97
Mlc∆9 3 11,03 0,2214 172,88
Mlc∆18 2,3 12,4 0,3069 94,91
Tab. 11: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcWT, Mlc∆∆∆∆9 und Mlc∆∆∆∆18
MlcH52 ist die Mlc-Variante, die kristallisiert werden konnte. In einer Einheitszelle des Kristalls befinden sich zwei Mlc Dimere. Um zu klären, ob dieser Widerspruch, Dimer im Kristall und Tetramer in Lösung, durch die Mutation im HTH-Motiv dieser Variante oder durch den bei der Kristallisation verwendeten Puffer zustande kommt, wurde das Molekulargewicht von MlcH52 mit Hilfe der Gelfiltration mit unterschiedlichen Puffern untersucht. Zunächst wurde es unter nativen Bedingungen in Tris-Puffer wie MlcWT zuvor untersucht. Für MlcH52, dessen Monomer ein Molekulargewicht von 44 kDa hat, lies sich ein Molekulargewicht von 189– 193 kDa ermitteln und liegt ebenfalls als Tetramer vor (siehe Abb. 22 und Tab. 12). Gereinigtes MlcH52 wurde von K. Gerber (Uni-Konstanz) bereitgestellt.
Abb. 22: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris-Puffer.
Gezeigt sind die erste und zweite Größenbestimmung von MlcH52 unter nativen Bedingungen (Puffer: 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 300 mM NaCl). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.
Protein Elutionsvolumen [ml]
Kav Molekulargewicht [kDa]
Thyroglobolin 9,68 0,1114 669
Ferritin 11,08 0,201 440
Aldolase 12,92 0,3188 158
Albumin 14,24 0,4033 67
Ovalbumin 15,15 0,4616 43
MlcH52 12,35 0,2823 192,88 MlcH52 12,39 0,2849 188,84
Tab. 12: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Trispuffer
Das Experiment wurde wiederholt mit selbigem Puffer, der jedoch nun 10 mM ß-Mercaptoethanol enthielt. Damit wurden reduzierende Bedingungen geschaffen wie man sie im Zellinneren vorfindet. Das ermittelte Molekulargewicht von 203 kDa entsprach noch einem Tetramer. An der Oligomerisierung scheinen keine Cysteine beteiligt zu sein, da diese unter den Pufferbedingungen reduziert werden würden (siehe Abb. 23 und Tab. 13).
Abb. 23: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris-Puffer mit ß-Mercaptoethanol.
Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 unter reduzierenden Bedingungen (Puffer: 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 300 mM NaCl, 10 mM ß-Mercaptoethanol). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.
Protein Elutionsvolumen [ml]
Kav Molekulargewicht [kDa]
Ferritin 11,24 0,2113 440
Aldolase 12,82 0,3124 158
Albumin 14,16 0,3982 67
MlcH52 12,44 0,2881 202,6
Tab. 13: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 inTrispuffer mit ß-Mercaptoethanol
Als nächstes wurde das Laufverhalten von MlcH52 in dem Glycinpuffer getestet, in dem das Protein vor der Kristallisation gereinigt wurde. Das ermittelte Molekulargewicht von 246 kDa liegt zwischen einem Penta- und einem Hexamer (siehe Abb. 24 und Tab. 14).
Abb. 24: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Glycinpuffer.
Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 in Glycinpuffer (10 mM Glycin/NaOH, 50 mM NaCl; pH 9,5).
Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.
Protein Elutionsvolumen [ml]
Kav Molekulargewicht [kDa]
Ferritin 10,68 0,1755 440
Aldolase 12,82 0,3124 158
Albumin 14,41 0,4142 67
MlcH52 11,87 0,2516 245,7
Tab. 14: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Glycinpuffer
Zusätzlich wurde das Laufverhalten im Kristalisationspuffer überprüft. Im Elutionsprofil war eine Vielzahl an Peaks zu sehen, die zum Teil ineinander übergingen (siehe Abb. 25 und Tab.
15). Der zuerst erscheinende Peak bei einem Elutionsvolumen von 12,55 ml entspricht, verglichen mit den Eichproteinen, einem Mlc Tetramer mit einer Größe von 201 kDa, der größte Peak bei 15,74 ml einem Monomer der Größe von 46 kDa. Die Peaks mit einem Elutionsvolumen größer als 15,74 ml würden, im Vergleich mit den Eichproteinen, Proteine kleiner als ein Monomer ergeben (siehe Abb. 26 und Tab. 15). Trägt man jedoch Aliquots aus den gesammelten Fraktionen dieser Peaks auf ein SDS-PAA-Gel auf, erhält man stets ein Mlc Monomer mit einer Größe von 44 kDa. Es sind keine kleineren Banden zu erkennen, die auf einen Abbau des Proteins hinweisen würden (siehe Abb. 27). Eine möglich Erklärung wäre, dass Mlc in diesem Puffer leicht als Komplex ausfällt, wenn es konzentriert wird. Letzteres geschieht zunächst beim Laden des Proteins auf die Säule, und vermutlich kann deshalb nicht alles Protein, das geladen wurde, gleichzeitig in die Säule einlaufen. Dieses wurde dann nach und nach freigesetzt, so dass sich im Grunde verschiedene Elutionsprofile überlagern.
Deshalb ist es fraglich, ob man bei dem Lauf in diesem Puffer wirklich eine Mischung unterschiedlicher Oligomere erhalten hat.
Abb. 25: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Kristallisationspuffer.
Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 in Kristallisationspuffer (0,8 M MgSO4; 50 mM MES; 25 mM NaCl; pH 6,3). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Die ermittelte Elutionsvolumina und Molekulargewichte sind teilweise ist in der Abbildung angegeben (vgl. Tab. 15).
Abb. 26: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer.
Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen Molekulargewicht von 43 – 669 kDa geeicht (Vierecke/siehe Tab. 15). Die für die Eichproteine berechneten Kav -Werte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen. Die Molekulargewichte von MlcH52 (Kreise) wurden mit Hilfe der Kav-Werte und der Eichgerade ermittelt. Gezeigt sind die Werte für einige beispielhaft herausgegriffene Peaks (vgl. Abb. 25).
Protein Elutionsvolumen[ml] Kav Molekulargewicht [kDa]
Thyroglobulin 10,17 0,1428 669
Ferritin 10,46 0,1613 440
Aldolase 13,6 0,3624 158
Albumin 14,64 0,4289 67
Ovalbumin 15,83 0,5051 43
Peak 1 (MlcH52) 12,55 0,2951 201,2 - Tetramer
Peak 2 (MlcH52) 12,66 0,3022 191,2
Peak 3 (MlcH52) 12,9 0,3175 171,2
Peak 4 (MlcH52) 13,42 0,3508 134,7 - Trimer
Peak 5 (MlcH52) 15,6 0,4904 49,3
Peak 6 (MlcH52) 15,74 0,4994 46,2 - Monomer
Peak 7 (MlcH52) 17,74 0,6274 18,4
Peak 8 (MlcH52) 18,59 0,6818 12,4
Peak 9 (MlcH52) 19,54 0,7426 8,02
Peak 10 (MlcH52) 20,26 0,7887 5,75
Tab. 15: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52in Kristallisationspuffer.
Abb. 27: Analyse augewählter Peakfraktionen bei der Gelfiltration zur Bestimmung des Molekulargewichtes von MlcH52.
Analyse der Peakfraktionen, die zur Berechnung der Mlc-Molekulargewichte herangezogen wurden. Die dazugehörigen Chromatogramme sind in Abb. 22 (Puffer1/Tris), in Abb. 23 (Puffer2/Tris+ß-Mercaptoethanol), in Abb. 24 (Puffer3/Glycin) und in Abb. 25 (Puffer4/0,8 M MgSO4/Kristallisation) gezeigt. Alle ausgewählten Peaks enthalten Mlc, mit einer Größe von 44 kDa im 12% SDS-PAA-Gel.