EMSA – Electromobility Shift Assay

Im EMSA wird die Bindung von Protein an DNA sichtbar, indem ein an Protein gebundenes Operatorfragment im Vergleich zu freier DNA im Gel verzögert wird. Dazu wurden die Ansätze einmal im 1,5 % Agarose-Gel aufgetrennt und die DNA mit Ethidiumbromid gefärbt.

Zum anderen wurde die DNA mit [γ-³²P]-ATP markiert und im nativen 8 % Polyacrylamidgel aufgetrennt.

Die getesteten Operatorfragmente waren C9 (pTZ-C9), das einer NagC-Bindestelle entspricht, M26 (pTZ-M26), das eine Mlc-Bindestelle beinhaltet und M120 (pTZ-M120), eine Negativkontrolle. Die Fragmente wurden mit den oben genannten Plasmiden als Template und den Primern N14E und N15B (118) mittels PCR amplifiziert.

Für die im Ethidiumbromid gefärbten Gel aufgetrennten Ansätze wurde je 1 µg der Mlc-Varianten (MlcWT, Mlc∆9 und Mlc ∆18) mit 100 – 200 ng Operatorfragment und einer entsprechenden Menge von 2x Bindepuffer (25 mM HEPES; 100 mM Kaliumglutamat; 0,5 mg/ml BSA; pH 8,0) gemischt. Die Ansätze wurden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann 10 min bei 13 000 rpm (Minifuge, Eppendorf) abzentrifugiert. Die Proben wurden mit einer adäquaten Menge Probenpuffer (2x Bindepuffer in 40 % Glycerin) versetzt und auf das 1,5 % Agarosegel aufgetragen.

Zur Herstellung der ³²P-markierten DNA wurden die Operatorfragmente wie oben beschrieben amplifiziert und das Phosphat an das 5´-Hydroxyl-Ende angefügt. Die Markierungsreaktion erfolgte mittels [γ-³²P]-ATP und einer T4 Polynukleotidkinase (MBI Fermentas), die Reinigung der DNA-Fragmente mit den Mini Quick Spin Columns (Roche);

beides je nach Herstellerangabe. Die Operatorfragmente (7000 c.p.m), 500 ng der jeweiligen Mlc-Variante, 0,5 µg Poly dI dC (Roche) als Kompetitor-DNA und 5 µl 2x Bindepuffer wurden vermischt und mit Milliporewasser auf 10 µl aufgefüllt. Die Ansätze wurden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 10 min bei 13 000 rpm (Minifuge, Eppendorf) abzentrifugiert. Die Proben wurden wie oben mit Probenpuffer versetzt und mittels eines nativen 8 % Polyacrylamidgeles aufgetrennt. Um aufgetrennten Banden sichtbar zu machen wurde ein Röntgenfilm aufgelegt. Die Exposition erfolgte bei Raumtemperatur und über Nacht.

2.5 Biochemische Methoden

2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Proteine wurden unter denaturierenden Bedingungen über SDS-PAGE nach Laemmli, 1970 (82) aufgetrennt. Zur Orientierung wurde ein Gemisch von Proteinen bekannter Größe aufgetragen (Low molecular weight marker, Pharmacia: 94, 67, 43, 30, 20,1, 14,4 kDa).

Proteine wurden mit Coomassie Brilliant Blue G250 (Fluka) gefärbt und sichtbar gemacht (43, 146). Bei Ganzzellextrakten, beispielsweise Induktionskontrollen, wurde 1 ml Zellen abzentrifugiert, das Pellet in 2x Auftragepuffer (140 mM TrisHCl, 16 % ß-Mercaptoethanol, 4

% SDS, 0,1 % Bromphenolblau, 40 % Glycerin, pH6,8) gelöst und dabei eine OD von 13,5 eingestellt (146). Die Proben wurden für 10 min gekocht und je 20 µl auf das Gel aufgetragen.

Gereinigtes Protein bzw. Membranpräparationen wurden im Verhältnis 1:2 mit 2x Auftragepuffer vermischt.

2.5.2 Westernblot

Diese Methode ermöglicht den Nachweis bestimmter Proteine mittels polyklonaler Antikörper (138). Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden im Semi-Dry-Verfahren auf eine Polyvinyliden-Difluorid-Membran (PVDF von Pall mit einer Porengrösse von 0,2µm) geblottet. Die spätere Zuordnung der Signale ermöglichte ein vorgefärbter Proteinstandard (Precision Plus Protein Standard Biorad: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10 kDa). Die Membran wurde in TBS Puffer (10 mM Tris/HCl pH 7,5; 150 mM NaCl) gewaschen und in Puffer TBS-Tween/Triton (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,05 % [v/v] Tween; 0,2 % [v/v] Triton X-100) mit 2 % BSA geblockt. Der primäre Antikörper zur Bindung an das zu analysierende Protein wurde entsprechend den Herstelleranweisungen bzw. Qualität in der Blocking-Lösung verdünnt und 1h bis über Nacht mit dem Blot inkubiert.

Die Membran wurde zweimal in Tween/Triton Puffer gewaschen und in TBS-Tween/Triton mit 2% BSA und sekundärem Antikörper für mindestens 1h inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde Anti-Mouse bzw. Anti-Rabbit IgG mit gekoppelter Alkaliner Phosphatase (Sigma) verwendet. Dieser Antikörper wurde in Verdünnung 1:10000 zugesetzt.

Danach wurde die Membran dreimal in TBS-Tween/Triton Puffer und einmal in Puffer A

(100 mM Tris/HCl pH 9,5; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2) gewaschen. Die Farbreaktion erfolgt durch Zugabe einer Lösung von NBT (Nitro Blue Tetrazolium) und XP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat) in Puffer A. Zum Abstoppen der Farbreaktion wurde die Membran mit deionisiertem Wasser gewaschen (Methode verändert nach Qiagen (128)).

2.5.3 Bestimmen der Proteinkonzentration

Proteinkonzentrationen wurden mit dem Coomassie Protein Assay Reagent (Biorad) nach der Methode von Bradford (19) bestimmt.

2.5.4 Bestimmen der ββββ -Galaktosidase-Aktivität

Die β-Galaktosidase (LacZ) aus E. coli spaltet neben seinem natürlichen Substrat auch das Substratanalogon ONPG (Ortho-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid). Es wird Ortho-Nitrophenol abgespalten, das im alkalischen Milieu einen gelben Farbstoff mit Absorptsmaximum bei 405 nm ergibt. Ein promotorloses lacZ-Gen wurde an die potentielle Promotorregion zu analysierender Genes fusioniert. Die Gelbfärbung im Assay ist als Maß für die Expression dieses Genes unter Versuchsbedingung anzusehen.

Die Messungen wurden meist mit über Nacht-Kulturen (Wachstum für 18 +/- 1h) durchgeführt, aber auch Wachstumsphasenabhängig. Dafür wurden von der wachsenden Kultur alle 60 min 1ml Aliquots für den Assay entnommen. Die Zellen wurden in Minimalmedium A nach Miller (93) unter Zusatz verschiedener Kohlenstoffquellen (siehe Tabelle 6), falls nicht anders angegeben bei 37°C inkubiert. War die Induktion der Expression eines plasmidkodierten Genes erforderlich, wurden die Kulturen bis zu einer OD578 = 0,5 (+/- 0,05) angezogen, geteilt, nur einem Teil 10-100 µM IPGT zugegeben und über Nacht weiter inkubiert. Abweichungen zu dieser Standardprozedur werden je nach Experiment gesondert angegeben. Der Test erfolgte mit Veränderungen nach der Methode nach Miller (92). Das Pellet von 1ml Kultur wurde in 1ml Z-Puffer (Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM, KCl 10

mM, MgSO4 1 mM) resuspendiert und davon bzw. einer Verdünnung in Z-Puffer die OD bei 578 nm bestimmt. Zu 0,8 ml dieser Zellen wurden je 25 µl 0,1% SDS und Chloroform gegeben, für 10 sek. gevortext und für 10 min bei RT inkubiert. Zu den nun permeabilisierten Zellen wurde 140 µl ONPG (4 mg/ml in Z-Puffer) gegeben (= Start der Reaktion). War bei einem Ansatz eine leichte Gelbfärbung zu erkennen, wurde die Reaktion mit Na2CO3 (1M) abgestoppt. Die Zeit zwischen Start und Stop der Reaktion wurde gemessen. Der Ansatz wurde für 10 min. (14500 rpm, RT, Eppendorf Minifuge Plus) abzentrifugiert und von 1ml Überstand die Absorption bei 405 nm gemessen.

Die Enzymaktivitäten wurden wie folgt berechnet (11, 92):

- Menge an umgesetztem ONPG pro Zeit in U[µmol x min^-1]

- spezifische Aktivität (U bezogen auf die Menge an Protein im Ansatz = U x mg^-1)

Alle Messungen wurden mindestens zweimal mit voneinander unabhängigen Kulturen durchgeführt.

2.5.5 Bestimmen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase

Bakterienkulturen für diesen Test wurden analog denen in Kapitel 2.5.4 für den ß-Galaktosidase-Test kultiviert. 0,2 ml einer Kultur wurden mit 0,8 ml TN-Puffer (10 mM Tris/HCl pH8,0; 150 mM NaCl) vermischt. Die Verdünnung wurde abzentrifugiert ( 1 min, RT, 14500 rpm, Ependorf Minifuge Plus) und zweimal in 1 ml TN-Puffer gewaschen. Das Pellet wurde erneut in 1 ml TN-Puffer resuspendierd. 900 µl wurden zur Bestimmung der OD bei 600 nm herangezogen, 100 µl wurden mit 900 µl Puffer2 (1 M Tris/HCl pH8,0; 0,1 M ZnCl2) verdünnt und in den Test eingesetzt. Die Zellen wurden durch Zugabe von je 25 µl 0,1

% SDS und Chloroform, 10 sek vortexen und 10 minütiger Inkubation bei RT permeabilisiert.

Der folgende Enzymtest wurde bei 28°C durchgeführt. Zum starten der Reaktion wurde 100 µl des Substrates pNPP (para-Nitrophenyl Phosphat; 0,4 %) zugegeben und gevortext. Bei Eintreten einer leichten Gelbfärbung wurde die Reaktion durch Zugabe von 120 µl 2,5 M K2HPO4 gestoppt. Die Zeit zwischen Start und Stop der Reaktion wurde gemessen. Der Ansatz wurde für 10 min bei 14500 rpm, RT zentrifugiert und danach 1 ml zum Bestimmen der OD bei 405 nm abgenommen.

Die Azymaktivität wurde in Miller Units und wie folgt berechnet (92):

2.5.6 Reinigung von Protein

Die Proteine Mlc, EIIA^Glc und IIB^Glc wurden unter nativen Bedingungen mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration gereinigt.

E. coli DHB4 wurde mit den in Tabelle 7 genannten Plasmiden transformiert und je nach Effektivität der Überproduktion in 1-8 l LB- bzw. NZA-Medium bei 28°C bzw. 37°C angezogen. Bei allen Plasmiden handelt es sich um Derivate von pQE-Vektoren der Firma Qiagen, denen das lacI^q-Gen, das für den Lamda-Repressor kodiert, eingefügt wurde (siehe Tabelle 3). Die Überexpression wurde durch Zugabe von IPTG (10-100 µM/ml) zum in Tabelle 7 genannten Zeitpunkt induziert. Nach weiteren 3 –5 h wurden die Kulturen geerntet (4000 x g; 10 min; 4°C) und die Pellets bei –70°C eingefroren.

Plasmid überproduziertes Protein Induktion bei OD578 =

Wachstum bei x°C

pSL104 Mlc mit N-terminalem His-tag 0,8 37

pMlc410 Mlc mit einer Deletion von 9 AS am C-terminalem Ende; mit N-C-terminalem His-tag

0,8 37 pMlc401 Mlc mit einer Deletion von 18 AS am

C-terminalem Ende; mit N-C-terminalem His-tag

0,8 37 pSA9 EIIA^Glc mit N-terminalem His-tag 1,0 28

pJFBH IIB^Glc mit C-terminalem His-tag 0,8 28

Tabelle 7. Plasmide - Überproduktion von Protein

2.5.6.1 Affinitätschromatographie

Die mit einem His-tag fusionierten Proteine wurden durch Ni²⁺-Affinitätschromatographie gereinigt. Dazu wurde einerseits die Biorad Workstation und Säulen mit 2 – 5 ml Ni-NTA-Superflow-Resin (Qiagen, Hilden) benutzt, anderseits der Äkta Purifier (Pharmacia) und 1ml bzw. 5 ml HiTrap Chelating^HP-Säulen (Ammersham Pharmacia, Freiburg). Diese Säulen wurden vor der Reinigung mit Ni²⁺,in Form von einem Säulenvolumen 0,1M NiSO4, beladen.

Die gefrorenen Zellpellets (siehe 2.5.6) wurden in 10 – 15 ml Lysispuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) gelöst und die Zellen mit Hilfe der French Pressure Cell (20K) aufgeschlossen. Zellbruchstücke wurden bei 27000 x g, 45min und 4°C abzentrifugiert. Die Überstände wurden daraufhin filtriert (Porengröße 0,45 µm) oder nochmals mit der Ultrazentrifuge mit 100000 xg, 30min, 4°C abzentrifugiert . Die Überstände mit löslichem Protein wurden dann auf die Säule geladen.

Die Säulen wurden zuvor mit 5 Säulenvolumen Millipore-Wasser gewaschen und mit 5 Säulenvolumen Lysispuffer äquillibriert. Nach dem Laden der Zellextrakte wurde mit Waschpuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) nicht gebundenes Protein von der Säule gewaschen bis die Absorption bei 280 nm unter 20 mAU (Milli-Absorption-Units) sank. An der Biorad Workstation wurde das gebundene Protein mit verschiedenen Elutionspuffern mit steigendem Imidazolanteil eluiert:

Elutionspuffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

+ Elutionspuffer1 Elutionspuffer2 Elutionspuffer3 50 mM Imidazol 250 mM Imidazol 500 mM Imidazol jeweils 3 – 5 Säulenvolumen

Am Äkta Purifier wurde durch Mischen des Wasch- und des Elutionspuffers (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol) ein ansteigender Imidazolgradient erzeugt.

Die Flussrate betrug 1 ml/min und wurde bei sehr zähflüssigen Zellextrakten entsprechend reduziert. Während des Ladens und Waschens wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt, während der Elution 0,5 ml-Fraktionen. Aliquots (10 – 15 µl) der Elutionsfraktionen wurden auf SDS-Gele aufgetragen und analysiert.

2.5.6.2 Gelfiltration

Elutionsfraktionen, die das gesuchte Protein enthielten, wurden vereinigt und weiter durch Gelfiltration gereinigt. Dabei wurden die Proteine entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und damit konnten Proteine, die zuvor unspezifisch an die Ni-Säule gebunden hatten, abgetrennt werden. Ein positiver Nebeneffekt ist, dass das Protein dabei umgepuffert und entsalzt wird.

Verwendet wurden die Biorad Workstation mit der Säule Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia, Freiburg) und der Äkta Purifier mit den Säulen Superdex 200 HR 10/30 und HiLoad Superdex 200 HR 16/60 (Pharmacia, Freiburg). Die Säulen wurden mit 1 Säulenvolumen Millipore-Wasser und 1 Säulenvolumen 0,5 M NaOH regeneriert und mit 1,5 Säulenvolumen Laufpuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 7,5) äquillibriert. Die Säule Superdex 200 HR 10/30 wurde mit bis zu 250 µl beladen, die Säule HiLoad Superdex 200 HR 16/60 mit bis zu 5 ml Proteinlösung. Die Elution erfolgte über weitere 1,5 Säulenvolumen mit Laufpuffer. Dabei wurden Fraktionen von 1,0 – 1,2 ml gesammelt. Fraktionen mit erhöhter Absorption bei 280 nm wurden mittels SDS-PAGE analysiert.

2.5.7 Bestimmen des Oligomerisierungsgrades von Mlc und YeeI mittels Gelfiltration (4)

Die Methode der Gelfiltration (Größenausschlußchromatographie) kann verwendet werden um das Molekulagewicht und die Größe eines Proteins abzuschätzen. Bei der Verwendung vergleichbarer Moleküle mit unterschiedlicher Größe besteht eine Verbindung zwischen dem Elutionsvolumen bzw. verschiedenen Elutionsparametern wie der Diffusionskonstanten Kav

und dem Logarithmus der Molekulargewichte. Dabei werden größere Moleküle weniger leicht in der Säule zurückgehalten und eluieren vor kleineren Molekülen. Um einen möglichst korrekte Bestimmung der Molkulargewichte der zu untersuchenden Proteine zu erhalten, sollten die Vergleichssubstanzen, also die Proteine, mit denen die Säule geeicht wird, eine vergleichbare Relation zwischen Molekulargewicht und molekularer Größe aufweisen. Da dies gerade bei dem Vergleich von Proteinen unter nativen Bedingungen nicht immer der Fall ist, liegt hierin eine gewisse Ungenauigkeit der Methode begründet.

Um das Molekulargewicht und den Polymerisierungsgrad von Mlc und YeeI unter nativen Bedingungen zu bestimmen wurde wiederum die Methode der Gelfiltration wie oben beschrieben angewandt. Es wurde der Äkta Purifier mit der Säule Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia; Säulenvolumen = 23,56 ml) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit Standardproteinen des HMW und LMW Calibration Kits (Pharmcia, Freiburg) geeicht. Das Leervolumen der Säule wurde mit der Substanz Blue Dextran 2000 (2000 kDa) bestimmt.

Unter Einbeziehen des Elutionsvolumens, des Säulenvolumens und des Leervolumens wurde für jedes Protein die entsprechende Diffussionskonstante Kav ermittelt. Aus den Molekulargewichten (y-Achse, logarithmische Skalierung) und Diffusionskkonstanten (x-Achse, lineare Skalierung) der Calibration Kit Proteine wurde eine Eichgerade erstellt. Das zu untersuchende Protein wurde unter gleichen Bedingungen auf der Säule analysiert. Über das Elutionsvolumen wurde der Kav-Wert berechnet und mit diesem und der Eichgerade das Molekulargewicht des zu untersuchenden Proteins abgeschätzt.

2.5.8 Reinigen des Komplexes aus Mlc und IIB

^Glc

(Koelution)

Die Reinigung der B-Domäne (IIB^Glc) von PtsG mit C-terminalem His-tag erfolgte wie in Kapitel 2.5.6 beschrieben. Eingesetzt wurden Zellen aus 8 l Bakterienkultur, was einen Zellpellet von etwa 5 g entsprach. Das Protein wurde zwischen Affinitätschromatographie und Gelfiltration mit einem 3 kDa-Filter konzentriert.

Zur Herstellung von Zellextrakten mit überproduziertem Mlc ohne His-tag wurde Stamm IT1168 (ptsG::kan) transformiert mit Plasmid pSA1 verwendet. Die Zellen wurden in 2 l LB-Medium (Amp100µg/ml) bei 37°C inkubiert. Bei einer OD578 von 0,7 wurde mit 100 µM IPTG induziert und anschließend für weitere 5 h inkubiert. Die Zellen wurden bei 4000 x g, 4°C, 10

min geerntet und die Pellets bei –70°C eingefroren. Für den Test wurden die Zellen in 10 ml Lysispuffer (20 mM HEPES, 0,8 mM NaH2PO4, 5 mM KCl, 137 mMNaCl, pH 7,0) resuspendiert und mittels French Pressure Cell (20K) aufgeschlossen.

Die Koelution wurde am Äkta Purifier (Amersham, Pharmacia, Freiburg) mit der 5 ml HiTrap Chelating^HP-Säule durchgeführt. Gereingtes IIB^Glc wurde erneut über den His-tag an die Säule gebunden. Dies geschah bei niedrigen Flussraten von 0,1 – 0,3 ml/min. Der Durchfluss wurde nochmals geladen um auch noch Reste von IIB^Glc an die Säule zu binden. Danach wurde der Mlc Zellextrakt, ebenfalls bei niedrigen Flussraten (0,1 – 0,3 ml/min) geladen. Der Durchfluss wurde noch zweimal wieder über die Säule gegeben um den im Zellextrakt enthaltenen Mlc die Möglichkeit zu geben an das an der Säule gebundene IIB^Glc zu binden. Dem Laden der Proteine folgte das Auswaschen von nicht gebundenen Proteinen mit Waschpuffer (Lysispuffer mit 10 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Dies erfolgte solange bis die Absorption bei 280 nm unter 100 mAU (Milli-Absorption-Units) gesunken war. Durch Mischen von Waschpuffer und Elutionspuffer (Lysispuffer + 500 mM Imidazol) wurde ein steigender Imidazolgradient bis hin zu 500 mM Imidazol angelegt und damit die an der Säule gebundenen Proteine eluiert. Die Flussrate von 1 ml/min wurde beibehalten. Während des Ladens der Protein und des Waschens der Säule wurden 5 ml Fraktionen gesammelt, während der Elution Fraktionen von 0,5 ml. Fraktionen, die eine erhöhte Absorption bei 280 nm aufwiesen wurden mittels SDS-PAGE analysiert.

2.5.9 Bindetests zwischen Mlc und EIICB

^Glc

(PtsG)

Für die Bindetests zwischen Mlc und PtsG wurde Mlc mit N-terminalem His-tag und auch die Mlc-Varianten (Mlc∆9 und Mlc∆18) mit N-terminalem His-tag wie unter 2.5.6.1 und 2.5.6.2 beschrieben gereinigt.

Für die Herstellung der invertierten Membranvesikel, die überproduziertes PtsG oder die überproduzierten Fusionsproteine aus Gp8 und der IIB-Domäne von PtsG bzw.Gp8-IIB-Varianten mit Punktmutationen, enthielten wurde folgende Methode angewandt. Der Stamm IT1168 (ptsG::Tn5(kan)) oder Stamm JM-G77 (∆ptsG ∆ptsHIcrr) wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert (siehe Tabelle 8). Die Zellen wurden in MMA 0,4 %

Glycerin bei 37°C angezogen. Die Induktion mit 50 – 100 µM IPTG erfolgt bei OD578 = 0,5 (+/- 0,05) und über Nacht. Die Zellen wurden geerntet (4000 x g; 4°C; 10 min) und die Pellets bei –70°C eingefroren.

Die Zellen wurden zweimal mit 0,9 % NaCl gewaschen, und ein Pellet aus 500 ml Zellkultur wurde in 5 ml Bindepuffer (20 mM HEPES, 0,8 mM Na2HPO4, 5 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,0) resuspendiert. Die Zellen wurden mittels French press aufgebrochen und Zellbruchstücke bei 27000 xg, 4°C, 15 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, auf Eis aufbewahrt und die Proteinkonzentration nach Bradford bestimmt. Die Menge an Überstand, die 2 mg an Gesamtprotein enthielt, wurde bestimmt und in 170 µl – Schritten mit der Airfuge (Beckmann) bei 132000 x g; RT; 1 min abzentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Dieser Ansatz enthält nun Membranen, jedoch keine löslichen Proteine. Enthielten die Membranen PtsG gesamt wurde 2 µg gereinigtes Mlc zugegeben, enthielten sie die IIB-Domäne; versehen mit einem Membrananker, wurde 1 µg Mlc zugegeben. Die Ansätze wurden 10 min bei RT inkubiert und darauf nochmals für 1 min, RT, 132000 x g abzentrifugiert. Die Überstände, die lösliches Protein, folglich auch nicht gebundenes Mlc, enthielten, wurden abgenommen und auf Eis aufbewahrt. Die Pellets, die Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine (auch an PtsG gebundenes Mlc) enthielten, wurden erneut in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Je 5 – 10 µl der Pellet und Überstandsfraktionen wurde auf 12 %ige SDS-PAA-Gele aufgetragen und anschließend mittels Westernblots mit IIB, Mlc oder Anti-Penta-His-Antikörpern analysiert.

Als Negativkontrolle dienten Membranpräparationen von Stamm IT1168 oder von JM-G77, die mit keinem Plasmid transformiert waren.

Plasmid klonierte EIIB-Variante

pTZ-Gp8 Gp8-Protein des Phagen M13

pTZ-Gp8-IIB Gp8 + Sequenz der B-Domäne des Enzyms IIBC (PtsG) des Glukose PTS (Phosphotransferasesystem); entsprechend Aminosäure 391-477 pTZ-Gp8-IIB(Cys421Asp) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Cystein421 zu Aspartat) pTZ-Gp8-IIB(Arg424Ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu Ala)

pTZ-Gp8-IIB(Arg424His) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu His)

Plasmid klonierte EIIB-Variante

pTZ-Gp8-IIB(Arg424Lys) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu Lys) pTZ-Gp8-IIB(Arg426Ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg426 zu Ala) pTZ-Gp8-IIB(Asp419Ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Asp419 zu Ala) pTZ-Gp8-IIB(Cys421Ser) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Cys421 zu Ala)

pTSG11 PtsG gesamt

Tabelle 8. Plasmide für die Überproduktion von EIIBC^Glc und IIB-Varianten

Die Plasmide mit den kodierenden Sequenzen der Gp8-IIB-Varianten wurden von J.

Plumbridge (Institut de Biologie Physico-Chimique; Paris) bereitgestellt.

2.5.10 Bindetests zwischen Mlc und YeeI (Surface Plasmone Resonace) (13, 14)

Um zu testen ob eine Bindung zwischen Mlc und YeeI möglich ist wurde die Methode der Messung der Oberflächenplasmonresonanz angewandt. Verwendet wurde dafür die BiacoreX (Pharmacia) und der CM5 Sensorchip. Bei dem optischen Biosensor handelt es sich um einen Basis-Chip mit einer 50 nm dicken Goldfolie auf einer Glasplatte, an deren Oberfläche eine Carboxylierte Dextranmatrix aufgebracht ist. Proteine können über eine Amidbindung direkt an die Carboxygruppen gekoppelt werden. Nicht gebundene Carboxygruppen werden mit Ethanolamin abgesättigt. Im Gerät ergeben sich über dem Chip zwei von einander unabhängige Flusszellen, die Rerferenzzelle (Flusszelle 1/F1) und die Messzelle (Flusszelle 2/F2). Das ermöglicht die Bindung eines Kontrollproteins in F1. Hier sollte ein später zugegebener Analyt nicht binden. Der zu untersuchende Ligand wird in Flusszelle 2 gekoppelt. Der potentielle Bindepartner (=Analyt) des gebundenen Liganden wird in HBS-EP-Puffer (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % Polysorbat) gelöst. Der pH-Wert des Puffer sollte dabei eins unter dem theoretisch ermittelten pI des Analyten liegen.

Der Analyt wird mit konstanter Flussgeschwindigkeit durch beide Flusszellen geleitet. Die Bindung eines Proteins, sei es die Kopplung des Liganden oder die Bindung des Analyten,

entspricht einer Massenzunahme auf dem Chip, die mittels einer optischen Einheit detektiert wird und in Responseunits (RU) angegeben wird. 1000 RU entsprechen 1 ng Massenzunahme. Indem die erhaltene Signalhöhe der Referenzzelle, von der der Messzelle abgezogen wird, erhält man ein Differenzsensorgramm, in welchen die möglicherweise unspezifischen Bindungen des Analyten berücksichtigt sind. Im Differenzsensorgramm erkennt man die Injektion des Analyten durch einem Anstieg der Signalhöhe, der Assoziationskurve, und das Ende der Injektion in einem Abfall der Signalhöhe, die Dissozialtionskurve (siehe Kap.3.2.1). Die verwendeten Proteine und Flussraten werden zu den jeweiligen Experimenten in Kapitel 3.2.1 genannt.

2.5.11 Bindetests zwischen EIIA

^Glc

und CyaA (Adenylatcyclase)

Dieser Test wurde vergleichbar dem Bindetest zwischen EIICB^Glc und Mlc durchgeführt (Kapitel 2.5.9). Es wurde davon ausgegangen, dass eine ausreichende Menge Adenylatcyclase membranassoziert war. Von Stämmen, die die Adenylatcyclase oder deren Domänen überproduziert hatten wurden Membranen präpariert, die unter in vitro Bedingungen invertierte Membranvesikel bildeten. Die Membranen wurden mit gereinigtem EIIA^Glc oder mit Zellextrakten, die überproduziertes EIIA^Glc enthielten inkubiert. Die Ansätze wurden 10 min bei RT inkubiert und darauf für 1 min, RT, 132000 x g abzentrifugiert. Die Überstände, die lösliches Protein, folglich auch nicht gebundenes EIIA^Glc enthielten, wurden abgenommen und auf Eis aufbewahrt. Die Pellets, die Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine enthielten, wurden erneut in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Ein Unterschied zum voherigen Test bestand darin, dass die Membranpellets P1 des ersten Zentrifugationsschrittes nach der Inkubation der Membranen mit EIIA^Glc nochmals in 100 µl Bindepuffer gelöst und wieder abzentrifugiert wurden. Daraus hervor gingen Membranpellet 2 (P2) und Überstand 2 (S2). Für die Membranpräparationen wurden die Stämme (SA14; SA17; SA36) ohne Adenylatcyclase (∆cyaA) bzw. ohne PtsG (∆ptsG) mit Plasmiden transformiert, die entweder die Sequenz für die gesamte Adenylatcyclase trugen oder für deren Domänen (siehe Tabelle 9). Die Stämme wurden in MMA mit 0,4 % Glycerin und 0,5 % CAA angezogen. Die Induktion der Expression mit 50 µM IPTG erfolgte sofort mit Beginn der Kultivierung der Zellen und dann für 2-3 h oder je nach Plasmid mit 0,2 % Arabinose (siehe Tabelle 9), dann bei OD578=0,8 und für 5h. Die Zellpellets wurden nach dem Waschen in einem modifizierten

Bindepuffer (siehe Kapitel 2.5.9, aber pH 8,5 und mit 5 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM ß-Mercaptoethanol) gelöst. Für den Bindetest wurde, je nach Qualität der Überproduktion, eine Menge an Überstand verwendet, die 5 – 6 mg Gesamtprotein enthält. Als Negativkontrolle dienten Membranpräparationen von Stamm SA15 (ptsG::TN5(kan), ∆cya crp*). Als Bindepartner wurde, wie unter 2.5.6.1 beschrieben, gereinigtes EIIA^Glc mit N-terminalem His-tag verwendet oder Zellextrakte, die überproduziertes EIIA^Glc ohne His-tag (Stamm DHB4/JJ3 ∆cya ∆crr bzw. DG102 ∆ptsHIcrr mit Plasmid pBCP206) enthielten. Membranen

Bindepuffer (siehe Kapitel 2.5.9, aber pH 8,5 und mit 5 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM ß-Mercaptoethanol) gelöst. Für den Bindetest wurde, je nach Qualität der Überproduktion, eine Menge an Überstand verwendet, die 5 – 6 mg Gesamtprotein enthält. Als Negativkontrolle dienten Membranpräparationen von Stamm SA15 (ptsG::TN5(kan), ∆cya crp*). Als Bindepartner wurde, wie unter 2.5.6.1 beschrieben, gereinigtes EIIA^Glc mit N-terminalem His-tag verwendet oder Zellextrakte, die überproduziertes EIIA^Glc ohne His-tag (Stamm DHB4/JJ3 ∆cya ∆crr bzw. DG102 ∆ptsHIcrr mit Plasmid pBCP206) enthielten. Membranen

Im Dokument Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli (Seite 52-0)