Membranbindetests mit unterschiedlichen IIB Glc -Varianten und

Mlc wurde mit Mlc-Antikörpern detektiert. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen ist die 50 kDa Bande des Precision Plus All Blue Standardes von Biorad (std) in der ersten Spur und zur Kontrolle eine zu den Bindetests vergleichbare Menge gereinigtes Mlc ohne Zugabe von Membranpräparationen in der äußersten rechten Spur. Membranen wurden aus einem Volumen Zellextrakt präpariert, das 2 mg Gesamtprotein enthielt.

3.1.3 Membranbindetests mit unterschiedlichen IIB

-Varianten und MlcWT

Die Bindetests ergaben, dass die lösliche cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, um Mlc zu binden und die Derepression der Mlc regulierten Gene zu bewirken, aber nur wenn die B-Domäne mittels eines Membranankers an die Membran gebunden ist. Untersuchungen an IIB-Mutanten mit einem Aminosäureaustausch in der exponierten Oberfläche in und um das phosphorylierbare Cys421 zeigen, dass die Aminosäure Arg424 für die Bindung von Mlc essenziell ist.

Es war bereits bekannt, dass die lösliche IIB-Domäne von PtsG genügt, um Mlc zu binden (98). Dennoch wird Mlc in seiner Funktion als Repressor durch die Überproduktion der IIB-Domäne nicht inaktiviert und die Expression der Mlc regulierten Gene unterbleibt (84). Eine bereits in Kapitel 1.4.4 beschriebene deletierte Variante von PtsG vermittelt aber wieder beides, die Bindung von Mlc und die Derepression der Mlc regulierten Gene. Bei dieser Variante blieben Teile der C-Domäne von PtsG und der Linker zwischen B- und C-Domäne

erhalten. Eine Frage, die geklärt werden sollte, war, ob eine potentielle neunte Helix von PtsG und der Linker zur B-Domäne für die B-Domäne einen Membrananker darstellen und Mlc deshalb von der DNA abtitriert wurde, oder ob diese Sequenzen eine Erkennungssequenz für Mlc darstellen.

Um dies zu testen wurde die löslichen IIB-Domäne mit ihren N-Terminus an das Gp8 Protein des Phagen M13 fusioniert. Gp8 wird mittels einer Transmembranhelix in die Cytoplasmamembran von E. coli eingelagert. Die B-Domäne von PtsG erhält dadurch einen Membrananker, der keinerlei PtsG ähnliche Sequenzen enthält (50).

Die Bindetests mit dem Fusionsprotein ergaben, dass Mlc nur an die Membranen gebunden wurde, die mit PtsG oder dem Fusionsprotein Gp8-IIB angereichert waren, nicht an jene, die keines der Proteine oder nur den Membrananker enthalten. Das bedeutet: (I) Mlc bindet nicht unspezifisch an die Membran an sich oder den Membrananker Gp8. (II) Die IIB-Domäne von PtsG, ohne die ptotentielle neunte Helix und dem Linker, ist für die Bindung von Mlc ausreichend (siehe Abb. 11).

Abb. 11: Bindung von MlcWT an Gp8-IIB^Glc.

Die Membranen wurden aus Stamm JM-G77(∆ptsG ∆ptsHIcrr) präpariert, der aufgrund der Deletion der pts-Gene PtsG und EIIB^Glc nicht phosphorylieren konnte. Zu sehen sind die Bindetests mit Membranvesikeln, die kein überproduziertes Protein enthalten (----), PtsG (EIICB^Glc) von pTSG11, das Gp8-Protein des Phagen M13 (pTZ-Gp8) oder das GP8-IIB Fusionsprotein (pTZ-Gp8-IIB). Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit Antikörpern gegen IIB. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen sind die 37 und die 50 kDa Standardbande (oben) oder die im Bild benannten Standardbanden (unten).

Obwohl für die Membranpräparation gleiche Mengen an Zellextrakt verwendet wurden, ob nun EIICB^Glc oder das Fusionsprotein Gp8-IIB^Glc überproduziert wurde, ist im Falle des Gp8-IIB-Fusionsproteins eine sättigende Mlc Bindung früher erreicht, so dass nur 1 µg Mlc, statt wie bei Bindetests zu PtsG 2 µg, eingesetzt wurde. Die Kontrolle der Membranfraktionen mit gegen EIIB^Glc gerichteten Antikörpern zeigt ein Signal in den Spuren, in denen PtsG oder das Fusionsprotein enthaltende Membranpellets aufgetragen waren. Das Fusionsprotein Gp8-IIB wird in die Membran eingebaut und in etwa gleicher Menge gebildet wie PtsG, wobei dies, bedenkt man die Färbung der Blots mit Alkaliner Phosphatase, nur eine grobe Schätzung darstellt (siehe Abb. 11).

Mlc bindet nur an dephosphoryliertes PtsG, wie man es bei aktiven Transport von Glukose vorfindet. Es könnte sein, dass Mlc überlappend mit der Phosphorylierungsstelle von PtsG, dem Cystein421 im Bereich der B-Domäne, an PtsG bindet. In einer durch NMR Spektroskopie ermittelten Struktur der löslichen IIB-Domäne findet man das Cys421 innerhalb einer konvexen Oberfläche. Es ist Teil eines polaren Bereichs, der von hydrophoben Aminosäureresten und einem Halbkreis aus hydrophilen Aminosäureresten umgeben ist (25, 37). Es konnten weitere Aminosäuren ermittelt werden, die an der Stabilisierung des gebundenen Phosphates, sowie am Phosphattransfer beteiligt sind. Diese Aminosäuren befinden sich in der erwähnten Region um das Cys421 (25, 47). Deshalb wurden B-Domäne Varianten überprüft, die jeweils einen Aminosäureaustausch in oder um die Phosphorylierungsstelle enthielten.

Es sollte einerseits der Frage nachgegangen werden, ob Mlc möglicherweise die Thiolgruppe des Cys421 für die Bindung an PtsG nutzt. Deshalb wurde Cys421 durch Aminosäuren ohne Thiolgruppe ausgetauscht. Andererseits sollte überprüft werden, ob die negative Ladung, des an PtsG gebundenen Phosphates, die Bindung von Mlc verhindert. Der Austausch von Cys421 nach Serin(Ser) bzw. Aspartat(Asp) soll die dephosphorylierte und die phosphorylierte Spezies des Proteins imitieren. Dabei orientierte man sich an den Bacillus subtilis Proteinen HPr (170) und LicT (160). Bei den beiden Proteinen führte der Austausch von Serin (Ser/ bei HPr) oder His (bei LicT) nach Aspartat (Asp) dazu, dass die Proteine aufgrund der negativen Ladung des Aspartats die Charakteristika eines phosphorylierten Proteins besitzen. Mlc bindet jedoch nach wie vor an beide IIB-Varianten (siehe Abb. 12a).

Weder die zusätzlich negative Ladung, noch der Verlust der Thiolgruppe des Cysteins verhinderten die Bindung an die Gp8-EIIB^Glc-Varianten.

Die Bindung von Mlc an die IIB-Variante mit dem Austausch Asp419Ala konnte ebenfalls nachgewiesen werden (siehe Abb. 12a).

Für Argenin 424 und Argenin (Arg)426 von PtsG wurde postuliert, dass sie eine Stabilisierung der Phosphatbindung an PtsG bewirken, und dass sie für den Phosphattransfer von EIIB auf Glukose benötigt werden (83). Im Bindetest wurde Mlc nach wie vor an die IIB-Variante mit dem Austausch Arg426Ala gebunden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine Bindung von Mlc an die IIB-Variante mit dem Austausch Arg424Ala. Arg 424 scheint daher an der Mlc Bindung beteiligt zu sein (siehe Abb. 12 a).

Bei dem Austausch von Arg 424Ala oder Arg424 gegen Lysin (Lys) befand sich im Bindetest alles Mlc als lösliches Protein im Überstand. Wurde Arg424 hingegen durch Histidin (His) ausgetauscht blieb ein Rest von Bindungsaktivität erhalten. Diese Bindung war aber weniger stabil und lies sich durch nochmaliges abzentrifugieren und lösen des Membranpellets auswaschen, was vor allem in den S2- Fraktionen (Überstand 2, nach dem Waschen der Pellets) in Abbildung 12b zu sehen ist.

Die Bindetests wurden zudem mit Membranen aus Stamm IT1168 durchgeführt, in dem die PTS abhängige Phosphorylierung der IIB-Varianten möglich ist. Aufgrund der Kulturbedingungen (siehe Kap.2.5.9) kann man davon ausgehen, dass sowohl phosphorylierte, als auch dephosphorylierte IIB-Varianten in den Membranen vorhanden waren. Im Vergleich zu obigen Bindetests zeigte sich kein Unterschied in der Bindung von Mlc an die IIB-Varianten mit dem Cys421 und dem Arg424Ala Austausch. Die Bindung zu IIB ohne Mutation und dem Austausch Arg426Ala ist jedoch reduziert (siehe Abb. 13). IIB ohne Mutation wurde jedoch durch IT1168 weniger überproduziert als durch JM-G77, so dass hier vermutlich die zu geringe IIB Menge der Grund für die reduzierte Bindung ist (siehe Abb. 13).

Abb. 12: Bindung von MlcWT an die Gp8-IIB^Glc Varianten unter nicht phophorylierenden Bedingungen.

Die Membranen wurden aus Stamm JM-G77 (∆ptsG ∆ptsHIcrr) präpariert, der aufgrund der Deletion der pts-Gene PtsG und EIIB^Glc nicht phosphorylieren konnte. In a) sind die Bindetests mit Membranvesikeln gezeigt, die überproduzierte GP8-IIB Fusionsproteine enthalten, welche je einen im Bild gekennzeichneten Aminosäureaustausch besitzen. Die Überproduktion erfolgte mittels pTZ-Gp8-IIB mit der entsprechenden Mutation in IIB (siehe Tabelle 3 und Kap. 2.5.9). Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit Antikörpern gegen IIB.

Bei den Bindetests in b) wurde ein zusätzlicher Waschschritt der Membranpellets durchgeführt. Daraus resultieren die Fraktionen P2 (Pellet2) und S2 (Überstand2). Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S und der Standard (Precision Plus All Blue Standards von Biorad) mit std.

Abb. 13: Bindetests unter phosphorylierenden Bedingungen mit Membranen aus dem Stamm IT1168 und Mlc WT.

Bindetest mit Membranvesikeln, die überproduzierte GP8-IIB Fusionsproteine enthalten, welche je einen im Bild gekennzeichneten Aminosäureaustausch besitzen. Membranen wurden von Stamm IT1168 (ptsG::Tn5(kan)), transfomiert mit den entsprechenden Plasmiden, präpariert .In diesem Stamm ist die PTS abhängige Phosphorylierung der IIB-Varianten möglich. Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit Antikörpern gegen IIB. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen sind die 37 und die 50 kDa (oben) Bande und die im Bild benannten Banden (unten) des Precision Plus All Blue Standardes von Biorad(std).

Die Fähigkeit der IIB-Varianten Mlc zu inaktivieren wurde zudem durch Messung der ptsG-lacZ Reportergenfusion (ß-Galaktosidase Test) überprüft. Stamm JM-G77, der neben den Deletionen von ptsG und ptsHIcrr auch noch eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion besitzt, wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert. Da in diesem Stamm die PTS abhängige Phosphorylierung nicht stattfinden kann, liegen die IIB-Varianten dephosphoryliert vor. Die Bindung von chromosomal kodiertem Mlc sollte, sofern möglich, sehr effektiv erfolgen und einen deutlichen Anstieg der Expression von ptsG-lacZ bewirken. Zellen, welche jene IIB-Varianten überproduzierten, die im in vitro Bindetest fähig waren Mlc zu binden, zeigten eine um 10 –13 fach erhöhte ß-Galaktosidaseaktivität im Vergleich zu den Zellen, die die IIB-Varianten überexpremierten, die den Austausch des Arg424 nach Ala, His oder Lys besitzen und nicht mehr fähig waren Mlc zu binden (J. Plumbridge, persönliche Kommunikation und in (141)). Mlc wurde durch das Gp8-EIIB^Glc Fusionsprotein nicht nur an die Membran gebunden, sondern auch in seiner Funktion als Repressor inaktiviert.