Das Mlc-Regulon

Eine Frage, der ebenfalls in dieser Arbeit nachgegangen werden sollte, war, ob, außer den bislang bekannten, noch weitere Gene durch Mlc reguliert werden. Um einen Überblick darüber zu bekommen, wurde zum einen das Transkriptom einer mlc-Mutante mit dem des Wildtyps verglichen beziehungsweise mit dem eines Stammes, der mlc überexprimierte.

Ergänzend wurde das Proteom eines Stammes mit mlc-Mutation mit dem eines Stammes verglichen, der Mlc überproduzierte.

Obwohl bei den einzelnen DNA-Chip-Experimenten doch eine Vielzahl an Genen in der mlc-Mutante signifikant erhöht oder erniedrigt exprimiert waren, ließen sich diese umfangreichen Ergebnisse durch eine statistische Auswertung auf eine Liste von 41 Genen einschränken. Die Überprüfung der Daten mittels transkriptioneller lacZ- oder phoA-Fusionen, ermöglichte es für die Gene proV, agn(=flu), tauC, ssuC, yabN (=sgrR), yeeR, araD, araC, tbpA auszuschließen, dass diese durch Mlc reguliert werden. Das Gen yobD wird möglicherweise zusammen mit den Genen manXYZ transkripiert (Daten nicht gezeigt). Bislang konnten keine unbekannten Zielgene der Mlc-Regulation identifiziert werden.

Es zeigen sich mehr Übereinstimmungen zwischen den Chipexperimenten, in denen der Wildtyp mit der mlc-Mutante verglichen wurde und dem Vergleich ptsG-Mutante mit ptsG/mlc-Doppelmutante als zu dem Vergleich mlc-Mutante mit mlc-Überexpression. Im Vergleich Wildtyp mit ptsG-Mutante war die Expression keines Genes signifikant erhöht oder erniedrigt (Daten nicht gezeigt). Das zu den anderen Vergleichen unterschiedliche Expressionsmuster im Experiment mit der mlc-Überexpression könnte schon darauf zurückzuführen sein, dass die Überproduktion eines Proteines an sich einen gewissen Stress für die Zelle bedeutet und so das Expressionsmuster der Zelle in diesem Sinne verändert wird. Andererseits wird auch die mlc-Expression bei Hitzestress leicht erhöht (144). Die Mlc-Überproduktion könnte so einen permanenten Stress simulieren, ohne dass in diesem Fall andere Gene, die normalerweise bei Stress auch erhöht exprimiert werden, davon betroffen sind. Der Ansatz mit mlc-Überexpression scheint am wenigsten geeignet zu sein die Regulation durch Mlc zu definieren.

Dass die Microarrays aussagekräftig sind, zeigt das Vorhandensein von Signalen für die bekannten Mlc regulierten Gene. Nahezu alle finden sich auch in der statistischen Auswertung wieder (mlc, ptsG, ptsHI, manXYZ, malT => malP, malG, malF, malK, malM).

Aus den Untersuchungen mit transkriptionellen lacZ-Fusionen zu diesen Genen ist bekannt, dass deren Expression in einer mlc-Mutante um etwa 2 –5 fach erhöht ist (34, 114). Eine Ausnahme bildet dabei ptsG mit einer bis zu 20-fachen Erhöhung. Man würde folglich auch für die unbekannten Mlc regulierten Gene einen Anstieg der Expression um etwa 2-5 erwarten. Betrachtet man Gene, deren Expression nur derart gering verändert ist, können bei der Auswertung, wie sie in Kap. 2.4.4 beschrieben ist, nicht alle Ungenauigkeiten berücksichtigt werden. Bedenkt man nun die Schwankungen, die natürlicherweise bei der Expression von Genen auftreten können, und zudem Schwankungen, die auf die Präparation der RNA, Chipherstellung oder Hybridisierung der cDNA zurückzuführen sind, wird deutlich, dass viele falsch positive Signale auftreten können und manche Signale verloren gehen. Darin zeigt sich die Wichtigkeit der Wiederholung und der statistischen Auswertung der erhaltenen Microarraydaten. Die Frage ist allerdings, wie viele Wiederholungen des Experimentes in diesem Fall notwendig gewesen wären, um nur mit den Microarraydaten mit ausreichend hoher Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass ein Gen Mlc abhängig exprimiert wird. Die Ergebnisse aus den bisher durchgeführten acht Microarrays können daher eine Orientierung sein, für welche Gene es sich lohnt, eine genauere Untersuchung mit anderen Methoden durchzuführen. Ein signifikant erhöhtes Signal auf einem der Microarrays ist aber in diesem

Fall noch kein Beweis, dass das Gen tatsächlich Mlc abhängig exprimiert wird. Tabelle 21 zeigt einige Charakteristika oder auch Gemeinsamkeiten der Genprodukte der Gene, deren Signal nach der statistischen Auswertung der Microarrays als signifikant erhöht/erniedrigt galt (15, 20, 53, 102, 124, 140, 151, 164). Aber auch dadurch ließ sich kein Schema ableiten, das die Suche nach den tatsächlich durch Mlc regulierten Gene erleichtern würde.

Gemeinsamkeit Gene beteiligt an

Kohlehydratabbau/-transport; Aufbau von Polysacchariden;

araD, araC, yabN, ptsG, maa, abgR, mlc, manXYZ, ugd, wcaK, gmd, wza, gatDAZ, ptsHI, malP, malT, rhaA, malG, malF, malK, malM

transkriptionelle Regulatoren araC, abgR, yabN, mlc, malT, stpA, soxS Membranproteine/Teile von

Transportkomplexen

ptsG, manXYZ, yobD(potentiell), yeeR, malG, malF, malK, yabI, yabJ, yabK, yiaH(potentiell),manYZ periplasmatische Proteine yceI, malE, malM

Außenmembran/ -assoziiert flu(AG43), wza, ydeT(potentiell), yfbE(arnB) beeinflusst Koloniemorphologie/

beteiligt an Lipopolysaccharidsynthese

flu, ugd, wcaK, gmd, wza Histon-ähnlich/RNA Chaperon stpA

zusätzlich σ³² abhängig transkripiert ptsG, ptsHI, mlc Leseraster kodiert unmittelbar

stromabwärts und in gleicher Leserichtung nach einem durch Mlc repremierten Gen

manXYZ => yobD malT => yhgJ(=rtcA) oxidativer Stress/OxyR abhängig flu

von pH im Medium beeinflusst malT, manX, yceI

Tab. 21: Gemeinsamkeiten und Charakteristika der möglicherweise durch Mlc regulierten Gene.

Interessanterweise ist StpA, zusammen mit dem Histon-ähnlichen Protein H-NS, auch an der Regulation der mal-Gene beteiligt (72).

Bei YabN(=SgrR) handelt es sich vermutlich um einen Regulator, der als Sensor für das erhöhte Vorkommen von Hexose-6-P in der Zelle dient und der daraufhin die Transkription einer kleinen regulatorischen RNA (sgrS) aktiviert (163). Die Blockierung der Glykolyse führte zu einer Anhäufung von möglicherweise für die Zelle toxischem Hexose-6-P und in der Folge zum schnellen Abbau der ptsG (EIICB^Glc) mRNA. Der Abbau der durch sgrS/Hfq markierten ptsG mRNA erfolgt durch die RNaseE (73, 76, 96). Schon deshalb war yabN ein interessanter Kandidat für die Mlc-Regulation. Für yabN erhielt man bei all jenen Microarrays ein Signal, mittels denen der Vergleich Wildtyp mit mlc-Mutante oder ptsG-Mutante mit ptsG/mlc-Doppelmutante durchgeführt wurde. Dabei war yabN in Anwesenheit von Mlc, also

im Wildtyp, 2-5-fach erhöht und in der mlc-Mutante erniedrigt. Untersuchungen mit transkriptionellen lacZ-Fusionen zu yabN oder sgrS zeigen aber, dass deren Transkription nicht von Mlc abhängt. Es muss sich also um einen indirekten Effekt handeln. In diesem Fall war das Wildtyp yabN noch vorhanden und die yabN-lacZ Fusion in die att-site des Bakterienchromosoms integriert. Möglicherweise ist die Methode bei einem gering transkripiertem Gen wie yabN auch zu wenig sensitiv und ein möglicher Unterschied in der Transkription ließe sich vielleicht durch RT-PCR zeigen. Bedingt durch die Promotorregion der beiden entgegengesetzt angeordneten Gene, sgrS und yabN, kann yabN möglicherweise nicht mehr transkripiert werden, wenn der Regulator die Transkription von sgrS aktiviert (162). Dieses Ereignis könnte in der mlc-Mutante früher eintreten als im Wildtyp. Da die Zellen für die RNA Präparation aber in der gleichen Wachstumsphase geerntet wurden, stellt es sich als Unterschied in der Genexpression dar.

Ein Nebeneffekt der Akkumulation von Glukose-6-Phosphat ist die Induktion des cps-Operons (38, 52, 148). Das cps-Operon umfasst 19 Gene, welche für die Synthese von

„Colanic Acid“ (M-Antigen), einem extracellulären Polysaccharid benötigt werden (152).

Mehrere dieser Gene sind in der mlc-Mutante erhöht, wenn diese mit der mlc-Überexpression verglichen wird. In der statistischen Auswertung der Microarrays sind immerhin noch drei dieser Gene enthalten (wza, gmd, wcaK). Bislang wurden aber noch keine ergänzenden Analysen durchgeführt, die die Microarraydaten bzgl. der cps-Gene bestätigen würden.

Auch der Vergleich des Proteoms einer mlc-Mutante verglichen mit einem Stamm, der Mlc überproduzierte, lieferte bislang keine neuen Einsichten, ob es weitere Mlc regulierte Gene gibt. Das mag auch auf die Umstände zurückzuführen sein, dass nur die löslichen Proteine untersucht wurden, und dass mit der Mlc-Überproduktion die Ausnahmesituation untersucht wurde. Der Vergleich eines Wildtyps mit einer mlc-Mutante wäre aufschlussreicher gewesen.

Die durchgeführten Experimente lassen zweierlei Erwartungen zu. Einmal besteht die Möglichkeit, dass durch eine weitere Auswertung der erhaltenen Daten tatsächlich noch durch Mlc-regulierte Gene gefunden werden. Zum anderen könnte es sein, dass es keine weiteren Mlc regulierten Gene gibt. Dadurch, dass Mlc abhängig von dem Transport der PTS-Substrate die Menge an PTS-Komponenten beeinflusst und diese vielfältige regulatorische Aufgaben in der Zelle erfüllen, sind auch vielfältige indirekte Auswirkungen einer mlc-Mutation denkbar.