1. Einleitung
1.2 Das Phosphotransferasesystem (PTS)
Das PTS zeichnet sich dadurch aus, dass durch den Mechanismus der Gruppenübertragung, ein Phosphatrest, ausgehend von PEP (Phosphoenolpyruvat), in unmittelbare Nähe einer Permease übertragen wird. Ermöglicht wird dies durch die Phosphorylierung und Dephosphorylierung verschiedener allgemeiner oder Substrat spezifischer Proteine. Das aufgenommene Substrat kann gekoppelt an den Transport phosphoryliert und somit energetisiert werden. (124, 136)
Die allgemeinen und löslichen Komponenten des PTS sind HPr (heatstable oder Histidin carrying protein, ptsH) und EI (EnzymI, ptsI), welche von allen Substrat spezifischen PTS-Komponenten in E. coli genutzt werden (siehe Abb.1). Eine Ausnahme bildet das Fruktose-PTS, dass ein HPr ähnliches Protein beinhaltet, welches bei konstitutiver Expression HPr funktionell komplementieren kann (46). EI wird am Histidin-189 durch PEP phosphoryliert.
Voraussetzung für die Phophorylierbarkeit von EI ist die Dimerisierung des Proteins und das Vorhandensein zweiwertiger Kationen. Das phosphorylierte Dimer zerfällt in Monomere, welche dann HPr an dessen in Position 15 befindlichen Histidin phosphorylieren. Ein limitierender Schritt der Phosphorylierungskaskade ist die Reassoziation der dephosphorylierten Monomere (166, 168, 169). HPr überträgt das Phosphat auf die EIIA der Zucker spezifischen Transportkomplexe (siehe Abb. 1).
Die Zucker spezifischen Transportkomplexe, auch EII (EnzymII) genannt, bestehen aus drei bis vier funktionellen Komponenten, bezeichnet mit IIA, IIB, IIC und gelegentlich IID. Sie sind entweder einzelne Proteine und dann als Untereinheiten eines Komplexes anzusehen, oder Teil eines aus mehreren Domänen bestehenden Proteins. Die Domänen sind dann durch flexible Linker miteinander verbunden. EIIA und EIIB sind hydrophile Proteine oder Domänen. EIIC und D sind Membranproteine (siehe Abb. 1).
Aufgrund der Verteilung der Domänen auf ein oder mehrere Proteine und der Anordnung der Domänen innerhalb der Proteine wurden für E. coli und S. typhimurium mehrere PTS-Familien definiert. Funktionelle Komplementation zwischen Domänen der gleichen Familie ist möglich, nicht aber zwischen den Familien (124, 136, 145).
Abb. 1: Bestandteile des PTS (Phosphotransferase System)
Phosphatgruppenübertrag von PEP über die allgemeinen, löslichen PTS-Komponenten EI und HPr auf die zuckerspezifischen EII. Beispielhaft dargestellt sind die EII zur Aufnahme von Mannose, Glukose und N-Acetyl-Glukosamin mit unterschiedlicher Anzahl 3-4 und unterschiedlicher Verbindung der Komponenten als Domänen von einem oder zweier Proteine. Die Dimerisierung von EI ist eine Voraussetzung für dessen Phophorylierbarkeit. Die Phosphorylierung/Dephosphorylierung der PTS-Komponenten ist reversibel.
1.2.1 Die Aufnahme von Glukose über das PTS
Das Glukose-spezifische PTS gehört zur Glukose-Sucrose Familie. Bei all diesen PTS sind IIC und IIB Domänen eines Proteins. EIIA liegt frei (Glukose) oder gebunden vor (EIICBANag, N-Acetyl-Glukosamin). Verschiedene Systeme haben kein eigenes EIIA und nutzen das des Glukose-PTS. Die Phosphorylierung der aufgenommenen Zucker erfolgt am C-6 des Glukopyranosidringes (124, 133). Glukose wird transportiert und über eine Kaskade von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen der PTS-Komponenten von PEP ausgehend phosphoryliert (siehe Abb. 2). Das EIIAGlc wird dabei durch die allgemeine Komponente HPr am Histidin 90 phosphoryliert (35, 126). EIIAGlc wiederum überträgt das Phosphat auf ein Cystein (Cys 421) in der B-Domäne von EIICBGlc(ptsG) (91). Die über IIC aufgenommene Glukose wird schließlich ausgehend von IIB phosphoryliert (siehe Abb. 2).
Die pts-Gene werden abhängig vom Substratvorkommen, Metabolismus, Stressfaktoren und vom Redox-Zustand der Zelle durch unterschiedliche Mechanismen reguliert. Sowohl die Transkription des Operons ptsHIcrr (HPr, EI, EIIAGlc), als auch die von ptsG (EIICBGlc) wird negativ durch Mlc und positiv durch den cAMP/CAP Komplex reguliert (115, 116).
Daneben beeinflussen weitere Regulatoren die Transkription der Gene. So werden die pts-Gene als Teil des Hitzeschockregulons, vermittelt durch den alternativen Sigmafaktor σ32, bei Hitzestress vermehrt expremiert (144). Auch FruR (oder Cra: catabolite repressor activator), der Repressor des Fruktose-spezifischen PTS, repremiert neben Genen der Glykolyse zudem schwach ptsH (119). Am ausgeprägtesten jedoch zeigen sich die vielfältigen Regulationsmechanismen bei der Kontolle der ptsG Transkription. ArcA bindet bei Veränderungen des Redoxzustandes der Zelle (70) an die ptsG Promotoren und das Nukleoid assoziierte Protein Fis verstärkt sowohl die Repression durch Mlc als auch die Aktivierung durch cAMP/CAP (143).
Neben der Regulation auf Ebene der Transkription wird ptsG zusätzlich posttranskriptionell reguliert. Die Anhäufung von Zuckerphosphaten, sei es durch Blockieren der Glykolyse oder durch Zugabe eines nicht abbaubaren Substratanalogons, bewirkt einen schnellen Abbau der ptsG mRNA durch einen RNaseE abhängigen Prozess. So könnte die Anhäufung von Zuckerphosphaten darauf hinweisen, dass der Abbau des Substrates langsamer abläuft als dessen Aufnahme. Durch den Abbau der ptsG mRNA könnte verhindert werden, dass durch die nachfolgende Translation noch mehr Transporter gebildet wird, der die Transportrate zusätzlich erhöhen würde (73, 76, 96, 163).
Allein durch das Zusammenspiel dieser Regulatoren bei der Expression der pts-Gene, ist das Glukose-PTS in diverse regulatorische Netzwerke eingebunden, die eine Anpassung an verschiedenste Umweltfaktoren erlauben. Dieses Bild erweitert sich um ein Vielfaches, wenn man die regulatorischen Funktionen mit einbezieht, die die PTS-Proteine selbst ausüben.
Bedingt durch die zuckerabhängige Dephosphorylierung beziehungsweise der PEP abhängigen Phosphorylierung, liegen die PTS-Proteine entweder vermehrt in ihrer dephosphorylierten oder vorwiegend in der phosphorylierten Form vor. Eine merkbare zuckerabhängige Dephosphorylierung der PTS-Komponenten erfolgt letztendlich dadurch, dass, wie zuvor beschrieben, die Dimerisierung der Komponente EI eine Voraussetzung für
deren Phosphorylierbarkeit und somit der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Phosphorylierungskaskade ist.
Auf diese Weise nehmen das nicht phosphorylierte EI und PEP über CheA Einfluss auf die Chemotaxis (88, 124). Phosphoryliertes EI dagegen kann das Phosphat auf die Acetatkinase übertragen. Dies könnte eine Verbindung zwischen PTS und dem TCA (Tricarbonsäure)-Zyklus darstellen (45). Das Protein HPr kann den Antiterminator BglG des bglGFB Operons phosphorylieren (49). Zusätzlich vermittelt HPr, durch Interaktion mit der Glykogenphosphorylase, möglicherweise eine Abstimmung zwischen der Substrataufnahme und dem Aufbau des Kohlehydratspeichers (142).
Die Bindung von nicht phophoryliertem EIIAGlc an FrsA (fermentation/respiration switch) beeinflusst die Rate von oxidativen Abbau und Vergärung der Glukose (79).
Dephophoryliertes EIIAGlc verursacht außerdem Induktorausschluss (siehe Kap. 1.3.1), während EIIAGlc-Phosphat durch Aktivierung der Adenylatcyclase die Bildung des Aktivators cAMP/CAP steigert, wodurch die Transkription der pts-Gene selbst und die anderer Gene aktiviert wird (siehe Kap1.3.1).
Letztendlich hat auch der Transportkomplex (EIICBGlc = PtsG) an sich positive Auswirkung auf die Expression der pts-Gene und die weiterer Transportsysteme, da der globale Regulator Mlc durch nicht phosphoryliertes PtsG inaktiviert wird (siehe Kap. 1.4).
Abb. 2: Glukose-PTS – Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten
Überblick über die am Transport von Glukose beteiligten PTS-Proteine (gelb) und die Phosphorylierungsreaktionen ausgehend von PEP über EI, HPr, EIIA auf EIIB. Phosphat wird von EIIB auf die transportierte Glukose übertragen. Der Regulator Mlc (orange) bindet an dephosphoryliertes EIICB.
Dephosphoryliertes EIIAGlc bindet an LacY, MalK und GlpK. Positive und negative Einflüsse der PTS-Proteine auf andere Transportsysteme und Enzyme (türkis) werden mit (+) und (-) dargestellt. (P) kennzeichnet die Phosphorylierung eines Proteins.