3. Ergebnisse
3.3 Einfluss von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIA Glc und der
3.3.1 Nachweis der Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase
Es gibt unterschiedliche Informationen über die Löslichkeit der Adenylatcyclase und die Möglichkeit, das Protein unter nativen Bedingungen zu reinigen. Im Gegensatz zu früheren Behauptungen (134) scheint nur ein sehr geringer Prozentsatz der Adenylatcyclase membranassoziiert zu sein, wobei nicht geklärt ist wie der Kontakt zu der Cytoplasmamembran zustande kommt (170).
Da durch die Überproduktion von plasmidkodierter Adenylatcyclase auch die Menge an Protein erhöht sein dürfte, die membranassoziiert ist, wurde versucht, die Bindung zu EIIAGlc
in Membranbindungstests, vergleichbar zu denen mit Mlc und PtsG, zu untersuchen (siehe Kap. 2.5.9 und 3.1.1-3.1.3).
Die Überproduktion der Adenylatcyclase wurde getestet, indem während des Wachstums der Bakterien 1 ml Proben aus der Kultur entnommen und mittels SDS-PAGE analysiert wurden (siehe Abb. 35). Spezifische Antikörper für den Nachweis durch einen Westernblot waren nicht verfügbar.
Abb. 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA).
Überproduktion der Adenylatcyclase erfolgte mit Stamm SA14, transformiert mit pSA8. Die Adenylatcyclase wurde hier mit der Shine Dalgarno Sequenz und dem Startcodon (TTG) von cyaA kloniert. Die Expression ist durch Arabinose induzierbar Die Induktionskontrollen (1 ml Probe der Bakterienkultur) wurden vor (v I) und 5 h nach (n I) der Induktion genommen. Das Pellet von 1ml Bakterienkultur wurde mit 2xPAP (Proteinauftragepuffer) auf eine OD=13,5 eingestellt und je 10 µl auf das Gel aufgetragen. Eine Bande bei etwa 94 kDa ist leicht verstärkt. Dies würde in etwa dem kalkulierten Molekulargewicht der Adenylatcyclase entsprechen. Std.: LMW (low molecular weight) Standard, Pharmacia.
Da EIIAGlc auch an PtsG binden kann, wurden die Membranen grundsätzlich von Stämmen präpariert, bei denen ptsG deletiert war. Die Bindung von EIIAGlc an solche Membranen wurde verglichen, die, aufgrund einer Mutation in cyaA, keine Adenylatcyclase exprimierten (Cya-) mit denen, die die Adenylatcyclase plasmidkodiert überexprimierten (Cya+).
Die in Abbildung 36 a gezeigten Bindetest mit gereinigtem EIIAGlc wurden wie in Kapitel 2.5.11 beschrieben durchgeführt. Dass EIIAGlc nur in den Membranpellets (P2) der Cya+ Ansätze erhalten blieb, zeigt deutlich, dass EIIAGlc an die membranassoziierte Adenylatcyclase gebunden hatte. Um zu sehen, ob EIIAGlc unter den Versuchsbedingungen Komplexe bildet und ausfällt bzw. deshalb abzentrifugiert wird, wurde gereinigtes EIIAGlc, ohne die Zugabe von Membranen, wie die Bindetests behandelt. Die Membranfraktionen (Pellet1/P1) des ersten Zentrifugationsschrittes nach der Inkubation mit EIIAGlc enthielten sowohl im Cya- als auch im Cya+ Ansatz EIIAGlc. In Pellet 1 der Kontrolle ohne Membranen war kein EIIAGlc bzw. eine kaum detektierbare Bande zu sehen. In Überstand 1 (S1) aller Ansätze war ungebundenes EIIAGlc vorhanden. Das Membranpellet 1 (P1) wurde nochmals resuspendiert (gewaschen) und abzentrifugiert. EIIAGlc war im Pellet 2 (P2) der Cya -Membranen nicht mehr zu detektieren und wurde folglich ausgewaschen. Ebenfalls kein EIIAGlc befand sich im Pellet 2 der Ansätze ohne Membranen. EIIAGlc blieb jedoch im Pellet 2 der Membranen des Cya+ Ansatzes erhalten (siehe Abb. 36 a). Stämme ohne Adenylatcyclase besitzen das crp* Allel. Durch letzteres wird ein CAP Protein gebildet, dass unabhängig von cAMP aktiv ist. So wurde sichergestellt, dass auch im cya-Stamm alle cAMP/CAP abhängigen Gene transkripiert wurden, obwohl keine Adenylatcyclase vorhanden ist und, dass die ausbleibende EIIAGlc-Bindung nur auf das Fehlen der Adenylatcyclase zurückzuführen ist und nicht auf das Fehlen einer cAMP/CAP abhängigen transkripierten Membrankomponente.
Da unterschiedlichste Faktoren an der Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase beteiligt sind (siehe Kap. 1.3.2), könnte es sein, dass weitere lösliche Faktoren benötigt werden, um den Einfluss der Zuckerphosphate auf die Bindung zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase zu bewirken und nachzuweisen. Deshalb wurde versucht die Bindetests mit Zellextrakten durchzuführen, die überproduziertes EIIAGlc ohne His-tag enthielten (siehe Abb. 36 b). Der zugegebene EIIAGlc-Zellextrakt enthielt nur lösliche Proteine. Es zeigt sich, dass bei dem Einsatz von Zellextrakten die Membranfraktion ein weiteres Mal gewaschen werden müsste, da in Pellet 2 (P2) der Cya- Membranen noch EIIAGlc enthalten ist. An Membranpellet 2 (P2) des Cya+ Stammes ist aber deutlich mehr EIIAGlc gebunden, so dass auch dieses Experiment auf eine direkte Interaktion zwischen EIIAGlc der Adenylatcyclase hinweist.
Abb. 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase(CyaA).
Westernblot mit Antikörpern gegen EIIA. Der Bindetest wurde wie in Kap. 2.5.11 beschrieben durchgeführt. P1:
Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIAGlc mit den Membranen; S: Überstand 1; P2: entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Die Überproduktion der Adenylatcyclase (Cya+) erfolgte in Stamm SA14, transformiert mit pSA8 (=pBAD_cya).
Gezeigt sind in a)die Membranbindetests mit gereinigtem EIIAGlc an: (i) oben (----) Kontrolle ohne Membranen, (ii) Mitte (cya--) Membranen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase (CyaA) und (iii) unten (cya+) Membranen von einem Stamm mit CyaA.
In b) wurden Zellextrakte mit überproduziertem EIIAGlc zugegeben.
Die Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag (99 kDa) konnte im Westernblot mit Penta-His-Antikörpern in den Membranfraktionen des Cya+ Stammes nachgewiesen werden (siehe Abb. 37 a). Zusätzlich wurde mit dem Penta-His-Antikörper eine Bande bei etwa 30 kDa detektiert. Es handelt sich hierbei nicht um ein Abbauprodukt der Adenylatcyclase, sondern um ein Membranprotein ohne His-tag, da man das Signal auch in der Cya- Kontrolle erhielt, in der kein His-tag-Protein enthalten war. Der Bindetest wurde mit gereinigtem EIIAGlc durchgeführt, das ebenfalls einen N-terminalen His-tag besitzt. Im Westernblot, der wie in den Experimenten zuvor zur Auswertung der Bindetests genutzt wurde, konnten somit beide Proteine mit dem Penta-His-Antikörper detektiert werden. Wiederum blieb das EIIAGlc-Signal im Membranpellet P2 des Cya+ Stammes erhalten, während es in der Cya- Kontolle ausgewaschen wurde. EIIAGlc bindet an Membranen, die überproduzierte Adenylatcyclase enthalten (siehe Abb. 37 b).
Abb. 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIAGlc.
Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2:
entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2.
Die Adenylatcyclase wurde in Stamm Sa17 (∆cya ∆ptsG), transformiert mit pSA11, überproduziert.
In a) erfolgt der Nachweis, dass die (His6x)-Adenylatcyclase (99 kDa) in den Membranen enthalten ist und auch in P2 erhalten bleibt. Dieser Test erfolgte ohne Zugabe von EIIAGlc. Auf Höhe der 100 kDa Standard Bande, erscheint ein Signal () in den Membranfraktionen des Cya+ Stammes, nicht aber im Cya- Stamm. Bei der unteren Bande(), die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich um ein Membranprotein ohne His-tag, das durch den Antikörper erkannt wird.
In b) wurde sowohl EIIAGlc () als auch die Adenylatcyclase () mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).