Katabolitenrepression und Induktorausschluss

Katabolitenrepression ist ein Mechanismus, bei dem die Transkription von Genen kataboler Systeme durch die Aufnahme und Verwertung einer bevorzugten Kohlenstoffquelle gehemmt wird. In E. coli beruht dies auf der fehlenden Aktivierung cAMP/CAP abhängig transkribierter Gene. Die direkte Bindung von dephosphoryliertem EIIA^Glc an Permeasen oder Enzyme verschiedener kataboler Systeme, verhindert die Aufnahme oder die Bildung des Induktors dieser Systeme und wird als Induktorausschluss bezeichnet.(137)

Da beide Mechanismen von dem Transport von Glukose über das EIICB^Glc (PtsG) abhängig sein können und der cAMP/CAP Komplex der Aktivator der Mlc regulierten Gene ist, sind auch die Katabolitenrepression und der Induktorausschluss als Parameter der transportgesteuerten Genregulation im Mlc-PtsG System mit einzubeziehen.

1.3.1 Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss

Glukose und andere PTS-Zucker werden im Anschluss an den Transport mit einer energiereichen Phosphatgruppe versehen. Derartige Kohlenstoffquellen werden von E. coli präferenziell aufgenommen und inhibieren den Transport und die Verwertung anderer (42, 137).

Der Transport von Glukose über das PTS bewirkt, wie zuvor beschrieben, dass die PTS-Proteine vorwiegend in ihrer dephosphorylierten Form vorliegen. Dephosphoryliertes EIIA^Glc hemmt die Aufnahme oder die Bildung des Induktors anderer kataboler Systeme (siehe Abb.2), indem es direkt an Permeasen oder Enzyme dieser Systeme bindet. Die Bindung erfolgt jedoch nur in Anwesenheit des Substrates des jeweiligen Systemes. Vermutlich bewirkt die Substratbindung eine Änderung der Konformation der betroffenen Proteine, welche die EIIA^Glc Bindung ermöglicht. Auf diese Weise wird verhindert, dass EIIA^Glc austitriert wird, wenn die Substrate dieser Systeme nicht vorhanden sind und diese Regulation unnötig ist. Dieser Mechanismus wird als Induktorausschluss bezeichnet (124).

Beispielsweise bindet EIIA^Glc an LacY, die Laktosepermease, und verhindert den Transport von Laktose, bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glukose im Medium (101, 107, 108, 149).

Induktorausschluss ist der maßgebliche Mechanismus der die Glukose-Laktose-Diauxie bedingt. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von EIIA^Glc an die ATPase MalK, die Teil des Maltose/Maltodextrin ABC(ATP-binding-cassette)-Transportsystemes ist (33, 81). Im Falle der Bindung von EIIA^Glc an GlpK (Glycerinkinase) wird die Bildung des Inuktors Glycerin-3-Phosphat aus Glycerin blockiert (67, 123).

Andererseits wird die Adenylatcyclase, welche die Bildung von cAMP aus ATP katalysiert, unter Bedingungen aktiviert unter denen EIIA^Glc phosphoryliert ist (siehe Kap. 1.3.2). cAMP wird durch CAP (catabolite activator protein; crp) gebunden. Die daraus resultierende Konformationsänderung ermöglicht es dem Regulator spezifisch an DNA-Sequenzen, den CAP-Boxen, zu binden (90, 167). Die Ähnlichkeit der Sequenzen der CAP-Boxen zu einem 22 bp langen, palindromen Konsensusmotiv (5’-AAATGTGATCT+AGATCACATTT-3’)(10), die Lage der CAP-Boxen bezüglich des Transkriptionsstartes oder kooperative Bindung mit weiteren transkriptionellen Regulatoren, bewirkt eine unterschiedliche Affinität des cAMP-CAP-Komplexes zu den Operatoren. Dies geht einher mit einer unterschiedlich starken Beeinflussung der Transkription an den Promotoren der katabolitsensitiven Gene.

Daraus ergibt sich zudem, ob cAMP/CAP als positiver oder negativer Regulator wirkt.(2, 3, 23, 24, 78)

Unter Bedingungen, unter denen EIIA^Glc hauptsächlich dephosphoryliert vorliegt, wie etwa bei dem Transport von Glukose, erfolgt keine Aktivierung der Adenylatcyclase. Der niedrige cAMP und cAMP/CAP Spiegel reicht nicht aus um die meisten der cAMP/CAP abhängigen Gene zu aktivieren. Unter diesen Genen sind solche, die für Proteine kodieren, die für den Transport und den Abbau alternativer Kohlenstoffquellen gebraucht werden. Dieser Effekt wird als Katabolitenrepression bezeichnet.

1.3.2 Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIA

Die Adenylatcyclase (cyaA) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa, das aus zwei Domänen besteht, einer N-terminalen katalytischen- und einer C-terminalen regulatorischen Domäne. Ein Modell, entwickelt aus genetischen Untersuchungen, besagt, dass die regulatorische Domäne die Aktivität der katalytischen Domäne hemmt (63, 135).

Der Phosphorylierungszustand der PTS-Proteine ist ausschlaggebend für die Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase. Ein niedriger cAMP Spiegel findet sich in Zellen mit verringerter Phosphorylierung der PTS-Proteine. Entweder verursacht durch eine Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade mittels Mutation von ptsH, ptsI (78, 124) oder crr (44, 100) oder durch den Transport von Glukose. Ein vergleichbarer Effekt wird durch eine Mutation in EIIA^Glc erreicht, die dessen Phosphorylierung verhindert, oder bei einer Insertion in cyaA (58). Nur unter Bedingungen, unter denen EIIA^Glc überwiegend phosphoryliert vorliegt, erfolgt eine Aufhebung des inhibitorischen Effektes der regulatorischen Domäne und damit ein Anstieg des cAMP-Spiegels in der Zelle (113).

Dass die C-terminale regulatorische Domäne der Adenylatcyclase für diesen Prozess von Bedeutung ist, zeigt sich darin, dass bei Mutanten, denen die regulatorische Domäne fehlt, die Aktivität der Adenylatcyclase konstitutiv vorhanden ist und nicht mehr durch Glukoseaufnahme oder crr-Deletion inhibiert wird (113, 135). Bislang ist nicht bekannt, ob die negative Ladung von EIIA^Glc-P (P: Phosphat) (130) oder eine direkte Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase oder beides die Aktivierung der Adenylatcyclase bewirken.

Man weiß ebenfalls wenig darüber, inwieweit weitere Faktoren daran beteiligt sind. So wurde diskutiert, ob auch eine Phosphorylierung der Adenylatcyclase durch EIIA^Glc-P möglich ist, da sich um das Histidin-609 der Adenylatcyclase eine potentielle Phosphorylierungsstelle befindet (31). Auch das CAP-Protein ist an der Regulation der Adenylatcyclase-Aktivität beteiligt. Mutanten ohne CAP-Protein produzieren große Mengen an cAMP. Die gesteigerte Produktion ist abhängig von EIIA^Glc, da sie bei zusätzlicher crr-Mutation unterbleibt (31, 68, 125, 155). Weitere Faktoren, die bekanntermaßen die Aktivität der Adenylatcyclase positiv beeinflussen, sind das Vorkommen von anorganischem Phosphat (Pi) (5) und die Verfügbarkeit von ATP (131).

1.3.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTS-Substrate

Auch die Nutzung von Nicht-PTS-Substraten ist aufeinander abgestimmt reguliert. Ebenfalls werden schneller verwertbare Substrate bevorzugt genutzt und inhibieren die Expression und Aktivität weiterer kataboler Systeme. Nicht-PTS-Substrate, wie Glukose-6-P, Glukonat, Laktose, Glycerin, Glycerin-3-P bewirken im unterschiedlichen Ausmaß Katabolitenrepression (62). Im Falle von Glukose-6-P entspricht die Reduktion von cAMP und die Dephosphorylierung von EIIA^Glc der bei Transport von Glukose herbeigeführten (61).

Durch die Bestimmung der Aktivität von chromosomal kodierter ß-Galaktosidase (LacZ), die im Operon lacZYA cAMP/CAP abhängig exprimiert wird, sieht man, dass die Katabolitenrepression durch Glukose-6-P nicht von EIIA^Glc abhängig ist. Sie ist aber abhängig von cAMP/CAP. Die Expression von lacZ mit veränderter Promotorsequenz erfolgt unabhängig von der Aktivierung durch cAMP/CAP. In diesem Stamm bewirkt Glukose-6-P nur eine geringe Repression von lacZ. Sowohl die CAP, als auch die cAMP Konzentration wird durch Glukose-6-P erniedrigt. Letzteres bedingt durch eine verringerte Adenylatcyclaseaktivität (62). Es wird postuliert, dass die cAMP-Konzentration mit der Transportaktivität korreliert, da der Transport des nicht abbaubaren 2-Deoxy-Glukose-6-P eine Abnahme der Adenylatcyclaseaktivität zur Folge hat (36). Die fehlende Aktivierung der Adenylatcyclase, verbunden mit einer niedrigen Konzentration des cAMP/CAP-Komplexes, ist auch hier der Mechanismus der Katabolitenrepression.

Auch im Falle von Glukose-6-P wird die Inhibierung anderer Zucker verwertender Systeme durch Induktorausschluss mittels dephosphoryliertem EIIA^Glc erreicht. Anders als bei Glukose bewirkt der Transport von Glukose-6-P keine Veränderung im Verhältnis von phosphoryliertem zu nicht phosphoryliertem EIIA^Glc. Es wird jedoch vermutet, dass der weitere Stoffwechsel über die Glykolyse das PEP zu Pyruvat Verhältnis verändert, welches dann zu einer verringerten Phosphorylierung der PTS-Proteine führt (61).

Im Gegensatz dazu kommt es bei der Aufnahme von Glycerin und Glycerin-3-P zu keiner wesentlichen Dephosphorylierung von EIIA^Glc (39, 61). Untersuchungen zum mal-Regulon zeigen aber, dass die Expression dieser Gene bei Wachstum auf den beiden Kohlenstoffquellen sehr wohl repremiert wird. Verursacht wird diese Repression durch das Auftreten von Glycerin-3-P. Die Produkte weiterer Stoffwechselschritte sind dafür nicht nötig. Untersuchungen mit transkriptionellen und translationellen Reportergenfusionen zu

malT, dessen Genprodukt MalT der transkriptonelle Aktivator der mal-Gene ist, weisen auf die Möglichkeit hin, dass zwei unterschiedliche Mechanismen diese Repression bewirken.

Einer betrifft die Transkription und ist abhängig von cAMP/CAP und EIIA^Glc, während ein posttranskriptioneller Mechanismus von cAMP/CAP und EIIA^Glc unabhängig ist. Weitere Experimente führten zu einem Modell, nach dem das Signal für die Anwesenheit eines Nicht-PTS-Substrates das daraus resultierende Zuckerphosphat ist. EIIA^Glc ist der Rezeptor für dieses Signal und wird direkt oder indirekt daran gehindert die Adenylatcyclase zu aktivieren.

Dies bewirkt wie bereits zuvor erläutert Katabolitenrepression. Die translationale Regulation geschieht vermutlich in Folge einer pH-Wert Erniedrigung in Kulturen, denen eine Kohlenstoffquelle im Überschuss zur Verfügung steht. Der weitere Mechanismus ist bislang nicht aufgeklärt.(39-41)