Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli

Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von

Escherichia coli

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von Sabine Seitz Universität Konstanz

mathematisch-naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie

Lehrstuhl für Mikrobiologie

Konstanz, April 2005 Tag der mündlichen Prüfung: 17.06.2005 1. Referent: Prof. Dr. W. Boos

2. Referentin: PD. Dr. C. Schlatterer

Danksagung

Herzlich bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer Winfried Boos. Nicht nur dafür, dass er mir ermöglichte diese Arbeit durchzuführen, sondern auch dafür, dass ich auf meine Art mit den Aufgaben wachsen konnte, indem er eigene Wege ebenso zuließ, so wie er stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Es war schön an ihrem Beispiel mitzuerleben, dass man auch in langen Berufsjahren die Begeisterung für das Forschen nicht über die alltäglichen Dinge verliert. Und, wenn man es auch nicht immer gerne hören wollte, Danke für die humorvolle und direkte Art, mit der man so manches Mal einen Schubs in die richtige Richtung bekommen hat.

Ein Danke an Michael Dahl, im Gedenken, und an Uli Dahl, im Besonderen, dafür, dass sie mir die ersten Schritte in Konstanz um so vieles schöner und leichter gemacht haben.

Meinen Kollegen in M1040 möchte ich sagen, es ist einfach klasse eine von euch zu sein.

Danke, nicht nur für die Hilfe, die Diskussion, sondern auch für die Freundschaft, den Einblick in ferne Kulturen, und dafür dass auch die langen Stunden im Labor mit Leben und Freude ausgefüllt waren.

Ein herzliches „Danke Schön“ an alle in der AG Boos, mit denen ich in den vergangenen Jahren zusammengearbeitet habe, für viele wertvolle Ratschläge, praktische Hilfe oder einfach nur für geduldiges Zuhören.

Ein besonderes Danke geht an Angie, Tina, Pari, Stefan und Daniel. Zu sagen weshalb würde noch mal ein Werk der Größe dieser Arbeit erfordern.

Mein Dank gilt auch allen Praktikanten und HiWis für die einerseits motivierte Unterstützung bei den verschiedenen Projekten und die vielen erfrischenden Fragen.

Und zum Schluss möchte ich auch die nicht vergessen, die durch ihren Beitrag zum Gelingen und zur Vollendung dieser Arbeit beitrugen wie Jacqueline Plumbridge in Paris, Ann-Katrin Becker und Knut Jahreis in Osnabrück, Tino Pohlen und Volker Wendisch in Jülich, Uwe Völker in Greifswald für die Zusammenarbeit, den fleißigen Korrekturlesern in der AG Boos und Christina Schlatterer dafür, dass sie die Aufgabe der Zweitgutachterin übernommen hat.

Inhaltsverzeichnis I

Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VIII Zusammenfassung X

1. Einleitung... 1

1.1 Einführung... 1

1.2 Das Phosphotransferasesystem (PTS)... 2

1.2.1 Die Aufnahme von Glukose über das PTS... 3

1.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss... 7

1.3.1 Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss.. 7

1.3.2 Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIA^Glc... 9

1.3.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTS- Substrate... 10

1.4 Mlc... 11

1.4.1 Ein globaler Regulator zuckerverwertender Systeme... 11

1.4.2 Durch Mlc regulierte Gene... 13

1.4.3 Glukoseinduktion der pts Gene... 16

1.4.4 Die Inaktivierung des Repressors Mlc... 17

1.5 Das Protein YeeI beeinflusst die Mlc regulierten Gene... 20

1.6 Zielsetzung... 21

2. Material und Methoden... 23

2.1 Abkürzungen... 23

2.2 Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide... 24

2.3 Medien und Wachstumsbedingungen... 28

2.3.1 Medien... 28

2.3.2 Medienzusätze und Kohlenstoffquellen... 29

2.3.3 Kulturbedingungen... 30

2.3.4 Zelldichtemessung... 30

2.4 Genetische und molekularbiologische Methoden... 30

2.4.1 Standardmethoden mit Nukleinsäuren... 30

2.4.2 Konstruktion von Plasmiden... 31

2.4.3 Stammkonstruktionen... 31

2.4.4 Transkriptomanalyse... 33

2.4.4.1 Präparation von RNA aus Bakterien... 33

2.4.4.2 Formaldehyd Agarose Gelelektophorese... 34

2.4.4.3 Chip-Herstellung... 35

2.4.4.4 Auswertung der Arraydaten... 36

2.4.5 EMSA – Electromobility Shift Assay……… 38

2.5 Biochemische Mehtoden... 39

2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)... 39

2.5.2 Westernblot... 39

2.5.3 Bestimmen der Proteinkonzentration... 40

2.5.4 Bestimmen der β-Galaktosidase-Aktivität... 40

2.5.5 Bestimmen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase... 42

2.5.6 Reinigung von Protein... 43

2.5.6.1 Affinitätschromatographie... 2.5.6.2 Gelfiltration... 43

45

2.5.7 Bestimmen des Polymerisierungsgrades von Mlc und YeeI mittels Gelfiltration... 45

2.5.8 Reinigen des Komplexes aus Mlc und IIB^Glc (Koelution)... 46

2.5.9 Bindetests zwischen Mlc und EIICB^Glc (PtsG)... 47

2.5.10 Bindetests zwischen Mlc und YeeI (Surface Plasmone Resonace)... 49

2.5.11 Bindetests zwischen EIIA^Glc und CyaA (Adenylatcyclase)... 50

2.5.12 Zellextrakte für 2D-Gelelektrophorese... 52

3. Ergebnisse... 53

3.1 Mlc und PtsG – Analyse verschiedener Mlc- und EIIB^Glc-Varianten bezüglich ihrer Rolle bei der Bindung der Proteine und des Einflusses auf die Mlc regulierten Gene... 53

3.1.1 Der C-Terminus von Mlc... 53

3.1.2 Membranbindetests mit PtsG (EIICB^Glc) enthaltenden Membranen und den Mlc-Varianten... 54

3.1.3 Membranbindetests mit unterschiedlichen IIB^Glc-Varianten und MlcWT... 56

3.1.4 Die Mlc-Varianten und ihr Einfluss auf die Mlc regulierten Gene... 62

3.1.5 Die DNA-Bindung der Mlc-Varianten mit C-terminaler Deletion... 67

3.1.6 Bestimmen der Quartiärstruktur von Wildtyp Mlc und den Mlc- Varianten... 69

3.1.7 Koelution von MlcWT mit der löslichen B-Domäne von PtsG... 78

3.1.8 Überblick zu den Untersuchungen an den Mlc- und der EIIB^Glc- Varianten... 80

3.2 Bindung zwischen Mlc und YeeI... 81

3.2.1 Bestimmen des Oligomerisierungsgrades von YeeI... 81

3.2.2 Oberflächenresonanzspektroskopie... 83

3.2.3 Beeinflusst YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ?... 85

3.3 Einfluss von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase... 87

3.3.1 Nachweis der Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase.. 87

3.3.2 Analyse der Interaktion zwischen EIIA^Glc und den Domänen der Adenylatcyclase... 92

3.3.3 Nachweis der Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase bei Zugabe von Zuckerphossphat... 96

3.3.4 Auswirkungen der EIIA^Glc Phosphorylierung auf die Interaktion zwischen EIIA^Glc und Adenylatcyclase... 97

3.4 Identifizieren weiterer Mlc regulierter Gene ... 98 3.4.1 DNA-Microarray ... 99 3.4.2 Überprüfung der Chipdaten... 101

3.4.3 Proteonomanalyse – Muster der in der Zelle synthetisierten Proteine im mlcHintergrund verglichen mit der Mlc-Überproduktion... 102

4. Diskussion... 107

4.1 Untersuchungen zur Interaktion zwischen Mlc und dem EIICB^Glc (PtsG)... 107

4.1.1 Die Rolle des C-Terminus von Mlc... 107

4.1.2 Der Widerspruch: Mlc-Dimere in der Kristallstruktur und Tetramer unter nativen Pufferbedingungen... 110

4.1.3 Die Regulation der Mlc abhängigen Gene durch unterschiedliche Mlc-Varianten... 111

4.1.4 Membranassoziation ist die Voraussetzung für die Inaktivierung von Mlc... 112

4.1.5 Die Phosphorylierungsabhängige Bindung von EIIB^Glc und Mlc... 115

4.2 Die Wechselwirkung zwischen Mlc und YeeI... 118

4.3 Die Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase... 120

4.4 Das Mlc-Regulon... 125

5. Literatur... 129

6. Anhang... 144

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Bestandteile des PTS (Phosphotransferasesystem)... 3

Abbildung 2: Glukose-PTS – Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten... 6

Abbildung 3: HTH-Motiv von Mlc und NagC... 12

Abbildung 4: DNA-Bindemotive von NagC und Mlc... 13

Abbildung 5: Mlc regulierte Gene... 15

Abbildung 6: Inaktivierung von Mlc... 18

Abbildung 7: Aufsicht auf die amphipatische α-Helix... 54

Abbildung 8: Mlc-Varianten... 54

Abbildung 9: Membranbindungstest von Mlc mit PtsG enthaltenden Membranen.... 55

Abbildung 10: Membranbindetests mit den Mlc-Varianten... 56

Abbildung 11: Bindung von MlcWT an Gp8-IIB^Glc... 57

Abbildung 12: Bindung von MlcWT an die Gp8-IIB^Glc Varianten unter nicht phosphorylierenden Bedingungen... 60

Abbildung 13: Bindetests unter phosphorylierenden Bedingungen mit Membranen aus dem Stamm IT1168 und MlcWT... 61

Abbildung 14: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆9, Mlc∆18 und Mlc110 auf die malT- lacZ Expression... 63

Abbildung 15: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆9 und Mlc∆18 auf die ptsG-lacZ Expression... 64

Abbildung 16: Auswirkung von MlcWT, MlcH52, Mlc_AYA und Mlc_SYS auf die ptsG-lacZ Expression... 64

Abbildung 17: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der malT-lacZ Expression... 66

Abbildung 18: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der ptsG-lacZ Expression... 66

Abbildung 19: Electromobility Shift Assay……… 68

Abbildung 20: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur der Mlc- Varianten... 70

Abbildung 21: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcWT und Mlc∆9, Mlc∆18... 71

Abbildung 22: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris-Puffer... 72

Abbildung 23: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in

Tris-Puffer mit ß-Mercaptoethanol... 73

Abbildung 24: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Glycinpuffer... 74

Abbildung 25: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Kristallisationspuffer... 76

Abbildung 26: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer... 76

Abbildung 27: Analyse augewählter Peakfraktionen bei der Gelfiltration zur Bestimmung des Molekulargewichtes von MlcH52... 77

Abbildung 28: Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIB^Glc(His6x)... 79

Abbildung 29: Koelution von Mlc und IIB^Glc(His6x)... 79

Abbildung 30: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von YeeI... 82

Abbildung 31: Bestimmen des Molekulargewichtes von YeeI... 83

Abbildung 32: Oberflächenresonanzspektroskopie; Bindung von an den Chip gebundenen Mlc mit YeeI... 84

Abbildung 33: Bindung der Mlc-Varianten an chipgebundenes YeeI... 85

Abbildung 34: Membranbindetests mit Mlc, YeeI und mit PtsG angereicherten Membranvesikeln... 86

Abbildung 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA)... 88

Abbildung 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase (CyaA)... 90

Abbildung 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIA^Glc... 91

Abbildung 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit N- terminalem His-tag und gereinigtem EIIA^Glc... 93

Abbildung 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle... 95

Abbildung 40: Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase und gereinigtem EIIA^Glc... 95

Abbildung 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc in Zellextrakten... 96

Abbildung 42: Bindetests mit (His6x)Adenylatclyse und gereinigtem nicht phosphoryliertem EIIA... 97

Abbildung 43: 2D-Gele des Vergleiches mlc-Mutante gegen Mlc-Überproduktion... 104

Abbildung 44: Struktur des MlcH52 Dimer... 109 Abbildung 45: Aktivierung/Inaktivierung der Adenylatcyclase... 124

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Bakterienstämme... 24

Tabelle 2: Phagen... 25

Tabelle 3: Plasmide………... 25

Tabelle 4: Oligonukleotide………... 27

Tabelle 5: Medienzusätze... 29

Tabelle 6: Kohlenstoffquellen... 29

Tabelle 7: Plasmide - Überproduktion von Protein... 43

Tabelle 8: Plasmide für die Überproduktion von EIIBC^Glc und IIB-Varianten... 48

Tabelle 9: Plasmide - Überproduktion der Adenylatcyclasevarianten für Membranbindungstests... 51

Tabelle 11: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcWT, Mlc∆9 und Mlc∆18... 71

Tabelle 12: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Trispuffer... 73

Tabelle 13: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 inTrispuffer mit ß-Mercaptoethanol... 74

Tabelle 14: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Glycinpuffer... 75

Tabelle 15: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer... 77

Tabelle 16: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von YeeI... 81

Tabelle 17: Statistische Auswertung der DNA-Microarray-Daten... 100

Tabelle 18: Auswertung der 2D-Gelelektrophorese. Vergleich der synthetisierten Proteine einer mlc-Mutante mit denen bei Mlc-Überproduktion... 105

Tabelle 19: Vergleich der durch die Microarrays erhaltenen Daten, mit denen der 2D-Gelelektrophorese... 106

Tabelle 20: Liste von Gram negativen Bakterien mit zu Mlc und YeeI ähnlichen Proteinen... 118

Tabelle 21: Gemeinsamkeiten und Charakteristika der möglicherweise durch Mlc regulierten Gene... 127

Tabelle 22: Normalisierte Ratio of Median – WT gegen mlc – Teil 1... 144

Tabelle 23: Normalisierte Ratio of Median – WT gegen mlc – Teil 2... 146

Tabelle 24: Normalisierte Ratio of Median – mlc gegen Mlc-Überproduktion –

Teil 1... 149 Tabelle 25: Normalisierte Ratio of Median – mlc gegen Mlc-Überproduktion –

Teil 2... 150

Zusammenfassung

Mlc, von Escherichia coli, ist ein globaler, transkriptioneller Regulator, der die Expression verschiedener Systeme zur Aufnahme und Verwertung von Kohlenstoffen repremiert. Die Mlc regulierten Gene werden andererseits durch den cAMP/CAP Komplex aktiviert. Unter den durch Mlc repremierten Genen befinden sich solche, deren Genprodukte Komponenten des PEP abhängigen Phosphotransferasesystems (PTS) darstellen. Die PTS-Komponenten selbst haben ebenfalls regulatorische Funktion. So beeinflusst das EIIA^Glc die Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase, welches cAMP aus ATP bildet. Mlc selbst wird durch Bindung an PtsG, dem Glukose spezifischen EIICB, inaktiviert. Mlc wird an dephosphoryliertes PtsG gebunden wie man es bei aktiven Transport von Glukose vorfindet. So ist die Bildung des Aktivators cAMP/CAP und die Aktivität des Repressors Mlc im Mlc-PtsG-System in Abhängigkeit von dem Transport von Glukose über PtsG reguliert.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass für die Bindung von Mlc an PtsG, die lösliche, cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, auch wenn diese unabhängig vom Rest des Proteins als separates Polypeptid exprimiert wird. Jedoch nur, wenn die B-Domäne mittels eines Membranankers membrangebunden ist und der Repressor Mlc dadurch an der Membran fixiert wird, wird zusätzlich eine Derepression der Mlc-regulierten Gene erreicht. Dabei kann IIB^Glc an ein Membranprotein fusioniert sein, das keine Ähnlichkeit zur C-Domäne von PtsG hat. Gezeigt wurde zudem, dass Mlc an Bereiche der B-Domäne bindet, die mit der Bindestelle des EIIA^Glc überlappen und die sich in unmittelbarer Nähe der Phosphorylierungsstelle der B-Domäne, dem Cystein 421, befinden. Das auch an der Stabilisierung der Phosphatbindung beteiligte Arg424 von PtsG ist für die Mlc-Bindung unbedingt erforderlich.

Die Bestimmung des Molekulargewichtes von Mlc ergab, dass das Protein unter nativen Bedingungen als Tetramer vorliegt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren von Mlc bilden möglicherweise eine amphipatische α-Helix. Die hier durchgeführten Experimente ergaben, dass die Helix eine wichtige Funktion bei der Ausbildung der korrekten Tertiär und Quartiärstruktur des Proteins hat. Eine um die 18 Aminosäuren verkürzte Mlc-Variante bildete unter nativen Bedingungen lediglich ein Dimer und hatte die Fähigkeit verloren an PtsG oder an die DNA zu binden.

In weiteren Bindetests wurde bewiesen, dass Mlc neben PtsG auch an YeeI bindet. YeeI ist ein lösliches Protein, dass bei Überproduktion die Expression der Mlc regulierten Gene positiv beeinflusst. Für YeeI konnte unter nativen Bedingungen die Bildung eines Dimers nachgewiesen werden. In den in vitro Bindetests konnte die Mlc-PtsG-Bindung auch nicht durch Zugabe eines Überschusses an YeeI gelöst werden.

Ebenfalls wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen der Adenylatcyclase und dem EIIA^Glc nachgewiesen. Entgegen dem vorherrschenden Modell, das die Bindung von phosphoryliertem EIIA^Glc propagierte, erfolgte die Bindung von dephosphoryliertem EIIA^Glc. Eine Bindung von phosphoryliertem EIIA^Glc konnte weder bewiesen noch ausgeschlossen werden. Für die Bindung von EIIA^Glc ist die N-terminale katalytische Domäne der Adenylatcyclase ausreichend.

Eine genomweite Suche nach weiteren Mlc regulierten Genen wurde mit Hilfe von DNA- Microarrays durchgeführt. Durch die nachfolgende Analyse der erhaltenen Daten mittels transkriptioneller Reportergenfusionen, konnten einige der falsch positiven Ergebnisse ausgeschlossen werden, aber keine weiteren Zielgene der Mlc-Regulation ermittelt werden.

1. Einleitung

1.1 Einführung

Escherichia coli, ein Gram-negatives, stäbchenförmiges, fakultativ anaerobes Eubakterium zeichnet sich durch eine große Variabilität seiner Lebensräume aus. Es kann neben seinem normalen Lebensraum im Darm von Mensch und Tier auch in deren Umgebung überleben.

Optimale Wachstumsbedingungen im Labor, die sich im schnellen Wachstum wiederspiegeln, sollten in den natürlichen Ökosystemen kaum vorkommen. Hier herrschen Mangel (Nährstoffe, Phosphat-, Stickstoffquellen, usw.) und Stress (O2, pH, Temperatur, osmotischer Druck, usw.) vor (59, 69).

Das wiederum erfordert eine fein abgestimmte, koordinierte Kontrolle sämtlicher zellulärer Vorgänge um die Anpassung an diese veränderlichen Umweltbedingungen zu erreichen und im Konkurrenzkampf mit anderen Organismen zu bestehen. Komplexe regulatorische Netzwerke bewirken, dass nur der Teil an zellulären Systemen gebildet wird oder aktiv ist, der eine Anpassung an die jeweilige Lebenssituation erlaubt. Beispielhaft ist die Fähigkeit von Bakterien ein energetisch hochwertigeres Substrat unter anderen zu erkennen, sich daraufhin zuzubewegen und Systeme für den Transport und Metabolismus der vorhandenen Substrate einer Hierarchie entsprechend zu exprimieren und aktivieren. Glukose stellt für E.

coli eine der bevorzugten Kohlenstoffquellen dar, da sie gekoppelt an den Transport in die Zelle über ein von Phosphoenolpyruvat abhängiges Phosphotransferasesystem (PTS) zu Glukose-6-Phosphat phosphoryliert wird und ohne weitere Modifizierungen in Stoffwechselwege wie beispielsweise der Glykolyse eingehen kann. Die Expression des PTS wird abhängig von der Verfügbarkeit des Substrates durch unterschiedliche Mechanismen reguliert, während wiederum die Proteine selbst die Aktivität anderer Systeme beeinflussen (42, 99). Einen Teil dieses umfangreichen regulatorischen Netzwerkes stellt das Mlc-PtsG- System dar.

Mlc als globaler Regulator bewirkt eine koordinierte Kontrolle von Genen, die für PTS- Komponenten kodieren. Diese Kontrolle erfolgt selbstreguliert, da die Aktivität von Mlc durch den Transport von Glukose über das Glukose-spezifische EIICB^Glc(PtsG) reguliert wird (119). Im folgenden werden die an diesem regulatorischen Netzwerk beteiligten Komponenten beschrieben.

1.2 Das Phosphotransferasesystem (PTS)

Das PTS zeichnet sich dadurch aus, dass durch den Mechanismus der Gruppenübertragung, ein Phosphatrest, ausgehend von PEP (Phosphoenolpyruvat), in unmittelbare Nähe einer Permease übertragen wird. Ermöglicht wird dies durch die Phosphorylierung und Dephosphorylierung verschiedener allgemeiner oder Substrat spezifischer Proteine. Das aufgenommene Substrat kann gekoppelt an den Transport phosphoryliert und somit energetisiert werden. (124, 136)

Die allgemeinen und löslichen Komponenten des PTS sind HPr (heatstable oder Histidin carrying protein, ptsH) und EI (EnzymI, ptsI), welche von allen Substrat spezifischen PTS- Komponenten in E. coli genutzt werden (siehe Abb.1). Eine Ausnahme bildet das Fruktose- PTS, dass ein HPr ähnliches Protein beinhaltet, welches bei konstitutiver Expression HPr funktionell komplementieren kann (46). EI wird am Histidin-189 durch PEP phosphoryliert.

Voraussetzung für die Phophorylierbarkeit von EI ist die Dimerisierung des Proteins und das Vorhandensein zweiwertiger Kationen. Das phosphorylierte Dimer zerfällt in Monomere, welche dann HPr an dessen in Position 15 befindlichen Histidin phosphorylieren. Ein limitierender Schritt der Phosphorylierungskaskade ist die Reassoziation der dephosphorylierten Monomere (166, 168, 169). HPr überträgt das Phosphat auf die EIIA der Zucker spezifischen Transportkomplexe (siehe Abb. 1).

Die Zucker spezifischen Transportkomplexe, auch EII (EnzymII) genannt, bestehen aus drei bis vier funktionellen Komponenten, bezeichnet mit IIA, IIB, IIC und gelegentlich IID. Sie sind entweder einzelne Proteine und dann als Untereinheiten eines Komplexes anzusehen, oder Teil eines aus mehreren Domänen bestehenden Proteins. Die Domänen sind dann durch flexible Linker miteinander verbunden. EIIA und EIIB sind hydrophile Proteine oder Domänen. EIIC und D sind Membranproteine (siehe Abb. 1).

Aufgrund der Verteilung der Domänen auf ein oder mehrere Proteine und der Anordnung der Domänen innerhalb der Proteine wurden für E. coli und S. typhimurium mehrere PTS- Familien definiert. Funktionelle Komplementation zwischen Domänen der gleichen Familie ist möglich, nicht aber zwischen den Familien (124, 136, 145).

Abb. 1: Bestandteile des PTS (Phosphotransferase System)

Phosphatgruppenübertrag von PEP über die allgemeinen, löslichen PTS-Komponenten EI und HPr auf die zuckerspezifischen EII. Beispielhaft dargestellt sind die EII zur Aufnahme von Mannose, Glukose und N-Acetyl- Glukosamin mit unterschiedlicher Anzahl 3-4 und unterschiedlicher Verbindung der Komponenten als Domänen von einem oder zweier Proteine. Die Dimerisierung von EI ist eine Voraussetzung für dessen Phophorylierbarkeit. Die Phosphorylierung/Dephosphorylierung der PTS-Komponenten ist reversibel.

1.2.1 Die Aufnahme von Glukose über das PTS

Das Glukose-spezifische PTS gehört zur Glukose-Sucrose Familie. Bei all diesen PTS sind IIC und IIB Domänen eines Proteins. EIIA liegt frei (Glukose) oder gebunden vor (EIICBA^Nag, N-Acetyl-Glukosamin). Verschiedene Systeme haben kein eigenes EIIA und nutzen das des Glukose-PTS. Die Phosphorylierung der aufgenommenen Zucker erfolgt am C-6 des Glukopyranosidringes (124, 133). Glukose wird transportiert und über eine Kaskade von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen der PTS-Komponenten von PEP ausgehend phosphoryliert (siehe Abb. 2). Das EIIA^Glc wird dabei durch die allgemeine Komponente HPr am Histidin 90 phosphoryliert (35, 126). EIIA^Glc wiederum überträgt das Phosphat auf ein Cystein (Cys 421) in der B-Domäne von EIICB^Glc(ptsG) (91). Die über IIC aufgenommene Glukose wird schließlich ausgehend von IIB phosphoryliert (siehe Abb. 2).

Die pts-Gene werden abhängig vom Substratvorkommen, Metabolismus, Stressfaktoren und vom Redox-Zustand der Zelle durch unterschiedliche Mechanismen reguliert. Sowohl die Transkription des Operons ptsHIcrr (HPr, EI, EIIA^Glc), als auch die von ptsG (EIICB^Glc) wird negativ durch Mlc und positiv durch den cAMP/CAP Komplex reguliert (115, 116).

Daneben beeinflussen weitere Regulatoren die Transkription der pts-Gene. So werden die pts- Gene als Teil des Hitzeschockregulons, vermittelt durch den alternativen Sigmafaktor σ³², bei Hitzestress vermehrt expremiert (144). Auch FruR (oder Cra: catabolite repressor activator), der Repressor des Fruktose-spezifischen PTS, repremiert neben Genen der Glykolyse zudem schwach ptsH (119). Am ausgeprägtesten jedoch zeigen sich die vielfältigen Regulationsmechanismen bei der Kontolle der ptsG Transkription. ArcA bindet bei Veränderungen des Redoxzustandes der Zelle (70) an die ptsG Promotoren und das Nukleoid assoziierte Protein Fis verstärkt sowohl die Repression durch Mlc als auch die Aktivierung durch cAMP/CAP (143).

Neben der Regulation auf Ebene der Transkription wird ptsG zusätzlich posttranskriptionell reguliert. Die Anhäufung von Zuckerphosphaten, sei es durch Blockieren der Glykolyse oder durch Zugabe eines nicht abbaubaren Substratanalogons, bewirkt einen schnellen Abbau der ptsG mRNA durch einen RNaseE abhängigen Prozess. So könnte die Anhäufung von Zuckerphosphaten darauf hinweisen, dass der Abbau des Substrates langsamer abläuft als dessen Aufnahme. Durch den Abbau der ptsG mRNA könnte verhindert werden, dass durch die nachfolgende Translation noch mehr Transporter gebildet wird, der die Transportrate zusätzlich erhöhen würde (73, 76, 96, 163).

Allein durch das Zusammenspiel dieser Regulatoren bei der Expression der pts-Gene, ist das Glukose-PTS in diverse regulatorische Netzwerke eingebunden, die eine Anpassung an verschiedenste Umweltfaktoren erlauben. Dieses Bild erweitert sich um ein Vielfaches, wenn man die regulatorischen Funktionen mit einbezieht, die die PTS-Proteine selbst ausüben.

Bedingt durch die zuckerabhängige Dephosphorylierung beziehungsweise der PEP abhängigen Phosphorylierung, liegen die PTS-Proteine entweder vermehrt in ihrer dephosphorylierten oder vorwiegend in der phosphorylierten Form vor. Eine merkbare zuckerabhängige Dephosphorylierung der PTS-Komponenten erfolgt letztendlich dadurch, dass, wie zuvor beschrieben, die Dimerisierung der Komponente EI eine Voraussetzung für

deren Phosphorylierbarkeit und somit der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Phosphorylierungskaskade ist.

Auf diese Weise nehmen das nicht phosphorylierte EI und PEP über CheA Einfluss auf die Chemotaxis (88, 124). Phosphoryliertes EI dagegen kann das Phosphat auf die Acetatkinase übertragen. Dies könnte eine Verbindung zwischen PTS und dem TCA (Tricarbonsäure)- Zyklus darstellen (45). Das Protein HPr kann den Antiterminator BglG des bglGFB Operons phosphorylieren (49). Zusätzlich vermittelt HPr, durch Interaktion mit der Glykogenphosphorylase, möglicherweise eine Abstimmung zwischen der Substrataufnahme und dem Aufbau des Kohlehydratspeichers (142).

Die Bindung von nicht phophoryliertem EIIA^Glc an FrsA (fermentation/respiration switch) beeinflusst die Rate von oxidativen Abbau und Vergärung der Glukose (79).

Dephophoryliertes EIIA^Glc verursacht außerdem Induktorausschluss (siehe Kap. 1.3.1), während EIIA^Glc-Phosphat durch Aktivierung der Adenylatcyclase die Bildung des Aktivators cAMP/CAP steigert, wodurch die Transkription der pts-Gene selbst und die anderer Gene aktiviert wird (siehe Kap1.3.1).

Letztendlich hat auch der Transportkomplex (EIICB^Glc = PtsG) an sich positive Auswirkung auf die Expression der pts-Gene und die weiterer Transportsysteme, da der globale Regulator Mlc durch nicht phosphoryliertes PtsG inaktiviert wird (siehe Kap. 1.4).

Abb. 2: Glukose-PTS – Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten

Überblick über die am Transport von Glukose beteiligten PTS-Proteine (gelb) und die Phosphorylierungsreaktionen ausgehend von PEP über EI, HPr, EIIA auf EIIB. Phosphat wird von EIIB auf die transportierte Glukose übertragen. Der Regulator Mlc (orange) bindet an dephosphoryliertes EIICB.

Dephosphoryliertes EIIA^Glc bindet an LacY, MalK und GlpK. Positive und negative Einflüsse der PTS-Proteine auf andere Transportsysteme und Enzyme (türkis) werden mit (+) und (-) dargestellt. (P) kennzeichnet die Phosphorylierung eines Proteins.

1.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss

Katabolitenrepression ist ein Mechanismus, bei dem die Transkription von Genen kataboler Systeme durch die Aufnahme und Verwertung einer bevorzugten Kohlenstoffquelle gehemmt wird. In E. coli beruht dies auf der fehlenden Aktivierung cAMP/CAP abhängig transkribierter Gene. Die direkte Bindung von dephosphoryliertem EIIA^Glc an Permeasen oder Enzyme verschiedener kataboler Systeme, verhindert die Aufnahme oder die Bildung des Induktors dieser Systeme und wird als Induktorausschluss bezeichnet.(137)

Da beide Mechanismen von dem Transport von Glukose über das EIICB^Glc (PtsG) abhängig sein können und der cAMP/CAP Komplex der Aktivator der Mlc regulierten Gene ist, sind auch die Katabolitenrepression und der Induktorausschluss als Parameter der transportgesteuerten Genregulation im Mlc-PtsG System mit einzubeziehen.

1.3.1 Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss

Glukose und andere PTS-Zucker werden im Anschluss an den Transport mit einer energiereichen Phosphatgruppe versehen. Derartige Kohlenstoffquellen werden von E. coli präferenziell aufgenommen und inhibieren den Transport und die Verwertung anderer (42, 137).

Der Transport von Glukose über das PTS bewirkt, wie zuvor beschrieben, dass die PTS- Proteine vorwiegend in ihrer dephosphorylierten Form vorliegen. Dephosphoryliertes EIIA^Glc hemmt die Aufnahme oder die Bildung des Induktors anderer kataboler Systeme (siehe Abb.2), indem es direkt an Permeasen oder Enzyme dieser Systeme bindet. Die Bindung erfolgt jedoch nur in Anwesenheit des Substrates des jeweiligen Systemes. Vermutlich bewirkt die Substratbindung eine Änderung der Konformation der betroffenen Proteine, welche die EIIA^Glc Bindung ermöglicht. Auf diese Weise wird verhindert, dass EIIA^Glc austitriert wird, wenn die Substrate dieser Systeme nicht vorhanden sind und diese Regulation unnötig ist. Dieser Mechanismus wird als Induktorausschluss bezeichnet (124).

Beispielsweise bindet EIIA^Glc an LacY, die Laktosepermease, und verhindert den Transport von Laktose, bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glukose im Medium (101, 107, 108, 149).

Induktorausschluss ist der maßgebliche Mechanismus der die Glukose-Laktose-Diauxie bedingt. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von EIIA^Glc an die ATPase MalK, die Teil des Maltose/Maltodextrin ABC(ATP-binding-cassette)-Transportsystemes ist (33, 81). Im Falle der Bindung von EIIA^Glc an GlpK (Glycerinkinase) wird die Bildung des Inuktors Glycerin-3- Phosphat aus Glycerin blockiert (67, 123).

Andererseits wird die Adenylatcyclase, welche die Bildung von cAMP aus ATP katalysiert, unter Bedingungen aktiviert unter denen EIIA^Glc phosphoryliert ist (siehe Kap. 1.3.2). cAMP wird durch CAP (catabolite activator protein; crp) gebunden. Die daraus resultierende Konformationsänderung ermöglicht es dem Regulator spezifisch an DNA-Sequenzen, den CAP-Boxen, zu binden (90, 167). Die Ähnlichkeit der Sequenzen der CAP-Boxen zu einem 22 bp langen, palindromen Konsensusmotiv (5’-AAATGTGATCT+AGATCACATTT- 3’)(10), die Lage der CAP-Boxen bezüglich des Transkriptionsstartes oder kooperative Bindung mit weiteren transkriptionellen Regulatoren, bewirkt eine unterschiedliche Affinität des cAMP-CAP-Komplexes zu den Operatoren. Dies geht einher mit einer unterschiedlich starken Beeinflussung der Transkription an den Promotoren der katabolitsensitiven Gene.

Daraus ergibt sich zudem, ob cAMP/CAP als positiver oder negativer Regulator wirkt.(2, 3, 23, 24, 78)

Unter Bedingungen, unter denen EIIA^Glc hauptsächlich dephosphoryliert vorliegt, wie etwa bei dem Transport von Glukose, erfolgt keine Aktivierung der Adenylatcyclase. Der niedrige cAMP und cAMP/CAP Spiegel reicht nicht aus um die meisten der cAMP/CAP abhängigen Gene zu aktivieren. Unter diesen Genen sind solche, die für Proteine kodieren, die für den Transport und den Abbau alternativer Kohlenstoffquellen gebraucht werden. Dieser Effekt wird als Katabolitenrepression bezeichnet.

1.3.2 Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIA

Die Adenylatcyclase (cyaA) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa, das aus zwei Domänen besteht, einer N-terminalen katalytischen- und einer C-terminalen regulatorischen Domäne. Ein Modell, entwickelt aus genetischen Untersuchungen, besagt, dass die regulatorische Domäne die Aktivität der katalytischen Domäne hemmt (63, 135).

Der Phosphorylierungszustand der PTS-Proteine ist ausschlaggebend für die Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase. Ein niedriger cAMP Spiegel findet sich in Zellen mit verringerter Phosphorylierung der PTS-Proteine. Entweder verursacht durch eine Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade mittels Mutation von ptsH, ptsI (78, 124) oder crr (44, 100) oder durch den Transport von Glukose. Ein vergleichbarer Effekt wird durch eine Mutation in EIIA^Glc erreicht, die dessen Phosphorylierung verhindert, oder bei einer Insertion in cyaA (58). Nur unter Bedingungen, unter denen EIIA^Glc überwiegend phosphoryliert vorliegt, erfolgt eine Aufhebung des inhibitorischen Effektes der regulatorischen Domäne und damit ein Anstieg des cAMP-Spiegels in der Zelle (113).

Dass die C-terminale regulatorische Domäne der Adenylatcyclase für diesen Prozess von Bedeutung ist, zeigt sich darin, dass bei Mutanten, denen die regulatorische Domäne fehlt, die Aktivität der Adenylatcyclase konstitutiv vorhanden ist und nicht mehr durch Glukoseaufnahme oder crr-Deletion inhibiert wird (113, 135). Bislang ist nicht bekannt, ob die negative Ladung von EIIA^Glc-P (P: Phosphat) (130) oder eine direkte Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase oder beides die Aktivierung der Adenylatcyclase bewirken.

Man weiß ebenfalls wenig darüber, inwieweit weitere Faktoren daran beteiligt sind. So wurde diskutiert, ob auch eine Phosphorylierung der Adenylatcyclase durch EIIA^Glc-P möglich ist, da sich um das Histidin-609 der Adenylatcyclase eine potentielle Phosphorylierungsstelle befindet (31). Auch das CAP-Protein ist an der Regulation der Adenylatcyclase-Aktivität beteiligt. Mutanten ohne CAP-Protein produzieren große Mengen an cAMP. Die gesteigerte Produktion ist abhängig von EIIA^Glc, da sie bei zusätzlicher crr-Mutation unterbleibt (31, 68, 125, 155). Weitere Faktoren, die bekanntermaßen die Aktivität der Adenylatcyclase positiv beeinflussen, sind das Vorkommen von anorganischem Phosphat (Pi) (5) und die Verfügbarkeit von ATP (131).

1.3.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTS- Substrate

Auch die Nutzung von Nicht-PTS-Substraten ist aufeinander abgestimmt reguliert. Ebenfalls werden schneller verwertbare Substrate bevorzugt genutzt und inhibieren die Expression und Aktivität weiterer kataboler Systeme. Nicht-PTS-Substrate, wie Glukose-6-P, Glukonat, Laktose, Glycerin, Glycerin-3-P bewirken im unterschiedlichen Ausmaß Katabolitenrepression (62). Im Falle von Glukose-6-P entspricht die Reduktion von cAMP und die Dephosphorylierung von EIIA^Glc der bei Transport von Glukose herbeigeführten (61).

Durch die Bestimmung der Aktivität von chromosomal kodierter ß-Galaktosidase (LacZ), die im Operon lacZYA cAMP/CAP abhängig exprimiert wird, sieht man, dass die Katabolitenrepression durch Glukose-6-P nicht von EIIA^Glc abhängig ist. Sie ist aber abhängig von cAMP/CAP. Die Expression von lacZ mit veränderter Promotorsequenz erfolgt unabhängig von der Aktivierung durch cAMP/CAP. In diesem Stamm bewirkt Glukose-6-P nur eine geringe Repression von lacZ. Sowohl die CAP, als auch die cAMP Konzentration wird durch Glukose-6-P erniedrigt. Letzteres bedingt durch eine verringerte Adenylatcyclaseaktivität (62). Es wird postuliert, dass die cAMP-Konzentration mit der Transportaktivität korreliert, da der Transport des nicht abbaubaren 2-Deoxy-Glukose-6-P eine Abnahme der Adenylatcyclaseaktivität zur Folge hat (36). Die fehlende Aktivierung der Adenylatcyclase, verbunden mit einer niedrigen Konzentration des cAMP/CAP-Komplexes, ist auch hier der Mechanismus der Katabolitenrepression.

Auch im Falle von Glukose-6-P wird die Inhibierung anderer Zucker verwertender Systeme durch Induktorausschluss mittels dephosphoryliertem EIIA^Glc erreicht. Anders als bei Glukose bewirkt der Transport von Glukose-6-P keine Veränderung im Verhältnis von phosphoryliertem zu nicht phosphoryliertem EIIA^Glc. Es wird jedoch vermutet, dass der weitere Stoffwechsel über die Glykolyse das PEP zu Pyruvat Verhältnis verändert, welches dann zu einer verringerten Phosphorylierung der PTS-Proteine führt (61).

Im Gegensatz dazu kommt es bei der Aufnahme von Glycerin und Glycerin-3-P zu keiner wesentlichen Dephosphorylierung von EIIA^Glc (39, 61). Untersuchungen zum mal-Regulon zeigen aber, dass die Expression dieser Gene bei Wachstum auf den beiden Kohlenstoffquellen sehr wohl repremiert wird. Verursacht wird diese Repression durch das Auftreten von Glycerin-3-P. Die Produkte weiterer Stoffwechselschritte sind dafür nicht nötig. Untersuchungen mit transkriptionellen und translationellen Reportergenfusionen zu

malT, dessen Genprodukt MalT der transkriptonelle Aktivator der mal-Gene ist, weisen auf die Möglichkeit hin, dass zwei unterschiedliche Mechanismen diese Repression bewirken.

Einer betrifft die Transkription und ist abhängig von cAMP/CAP und EIIA^Glc, während ein posttranskriptioneller Mechanismus von cAMP/CAP und EIIA^Glc unabhängig ist. Weitere Experimente führten zu einem Modell, nach dem das Signal für die Anwesenheit eines Nicht- PTS-Substrates das daraus resultierende Zuckerphosphat ist. EIIA^Glc ist der Rezeptor für dieses Signal und wird direkt oder indirekt daran gehindert die Adenylatcyclase zu aktivieren.

Dies bewirkt wie bereits zuvor erläutert Katabolitenrepression. Die translationale Regulation geschieht vermutlich in Folge einer pH-Wert Erniedrigung in Kulturen, denen eine Kohlenstoffquelle im Überschuss zur Verfügung steht. Der weitere Mechanismus ist bislang nicht aufgeklärt.(39-41)

1.4 Mlc

1.4.1 Ein globaler Regulator zuckerverwertender Systeme

Mlc (making large colonies) wird durch ein offenes Leserater bei 35,9 min des E.coli Chromosoms kodiert. In seiner Rolle als Regulator für Systeme zur Aufnahme und Verwertung von diversen Kohlenstoffquellen wurde es auf unterschiedlichen Wegen entdeckt, was sich auch in einer unterschiedlichen Namensgebung wiederspiegelt. So wurde es zunächst bei der Untersuchung von E. coli Stämmen mit einer ptsG-Mutation (EIICB^Glc) und einer Suppressormutation entdeckt. Unter anaeroben Bedingungen nehmen diese Mutanten Glukose und das Substratanalogon 2-Deoxyglukose über die Mannose spezifischen EII auf.

Das Gen, in dem sich die Suppressormutation befindet wird dgsA (deoxy-glucose-sensitive) genannt (134). Davon unabhängig entdeckte man es, als man das Wachstum von E. coli auf Vollmedium mit Glukose optimieren wollte. Die Überexpression eines unbekannten Genes, später mlc genannt, bewirkte eine langsame Verwertung der Glukose und verhinderte die dabei auftretende Akkumulierung von Acetat. Im Vergleich zu Wildtypzellen bilden Zellen, die plasmidkodiertes Mlc überproduzieren große Kolonien (66). Mlc und DgsA sind identisch.

Mlc ist der ROK (repressor, open reading frame, kinases)-Familie zugeordnet. Darin sind drei Klassen von Proteinen zusammengefasst (57, 159). Eine Klasse (O), die durch bislang nicht charakterisierte offene Leseraster kodiert ist, eine Klasse (R) von transkriptionellen Repressoren und eine (K), in der Fruktose- oder Glukose-Kinasen zusammengefasst sind.

Letzteren fehlen im Vergleich zu den Repressorproteinen 100 Aminosäuren am N-Terminus, welche bei den Regulatoren das HTH (helix-turn-helix)-Motiv, die DNA-Bindedomäne, enthalten. Mlc und der ebenfalls zur ROK-Familie gehörende Regulator NagC weisen 40%

Identidät und 80% Ähnlichkeit zueinander auf (34, 118). NagC ist der transkriptionelle Repressor der N-Acetyl-Glucosamin (GlcNAc) spezifischen EII und von Enzymen des GlcNAc-Abbaus. Am markantesten ist diese Übereinstimmung zu Mlc auf Proteinebene bezüglich des HTH-Motives. Die Aminosäuresequenz der Erkennungshelix (Helix 2) des HTH-Motivs von Mlc und NagC ist nahezu identisch (siehe Abb.3).

Abb.3:HTH-Motiv von Mlc und NagC.

Vergleich des N-terminalen DNA-Bindemotivs von NagC (AS: 33-56) und Mlc (AS: 31-54) mit Helix 1 und der Erkennungshelix 2.

Beide Regulatorproteine erkennen nahezu identische Operatoren. Um eine zentrale Position 0 führt die Anordnung GCGC an Position –4 bis –1/+1 bis +4 zu einer erhöhten Bindung an den Operator. Aber auch bei Abweichungen dazu ist der Abstand von 9 Basenpaaren zwischen den absolut konservierten Basen TT bei –5/-6 und AA bei +5/+6 unbedingt erforderlich. An Position –7 bis –10/+7 bis +10 befinden sich ausschließlich die Basen T oder A. Einziger Sequenzunterschied zwischen einem Mlc und einem NagC Operator sind die Basen G oder C an Position –11/+11 bei NagC bzw. A/T bei Mlc. Beide Proteine binden in vitro mit unterschiedlicher Affinität an die Bindestellen des jeweils anderen, wobei unter

physiologischen Regulatorkonzentrationen in vivo keine übergreifende Regulation beobachtet werden kann (118).

Abb.4: DNA-Bindemotive von NagC und Mlc

Auswahl von DNA-Bindestellen von NagC bzw. Mlc regulierten Genen: S steht für die Basen Guanin/Cytosin (G/C), W für die Basen Adenin/Thymin (A/T), N für A, T, C, oder G;

1.4.2 Durch Mlc regulierte Gene

Mlc repremiert die Transkription des Operons ptsHIcrr, das für HPr und EI, den allgemeinen PTS-Komponenten, und das EIIA^Glc kodiert (74, 116). Ebenfalls reguliert durch Mlc ist ptsG, das für das EIICB^Glc kodiert (75, 115) und das Operon manXYZ (114), das die Mannose spezifischen PTS-Komponenten kodiert. Des weiteren repremiert Mlc die Expression von malT, das für den Aktivator der mal-Gene kodiert. Über letzteren beeinflusst Mlc die Expression sämtlicher MalT regulierten Gene. Mlc selbst ist schwach autoreguliert (34). Der mlc p2 Promotor (siehe Abb. 5) wird sowohl durch den Sigmafaktor σ⁷⁰, als auch durch σ³² erkannt, wodurch die mlc Transkription als ein Teil des Hitzeschockregulons bei erhöhter Temperatur gesteigert wird (144).

Der Vergleich der regulatorisch wichtigen DNA-Regionen von Mlc und NagC regulierten Genen zeigt, dass die NagC-Bindestelle bevorzugt die –35 Region ersetzt, und dass bei der Regulation eine Schleifenbildung der DNA und somit die kooperative Bindung von zwei NagC-Bindestellen erforderlich ist. Mlc Bindestellen findet man meist überlappend mit oder in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts. Eine Bindestelle scheint für den repressorischen Effekt ausreichend. Auch wenn man bei ptsG (sowohl bei Promotor p1, als auch bei p2) zwei Bindestellen findet, konnte eine kooperative Bindung nicht nachgewiesen werden (siehe Abb. 5).

Alle Mlc regulierten Gene werden durch die Überproduktion von Mlc stark repremiert. Die Expression der Gene ist unter dieser Bedingung nahezu nicht mehr detektierbar. Dies zeigt auch, dass Mlc unter physiologischen Bedingungen limitiert ist und die vorhandenen Bindestellen möglicherweise nur partiell besetzt sind. Dennoch zeigen sich Unterschiede in der Regulation der Gene, die mit der unterschiedlichen Affinität des negativen Regulators Mlc und des Aktivatorkomplexes cAMP/CAP zu den jeweiligen Bindestellen zu erklären sind (34, 74, 75, 114-116).

Mlc beeinflußt die Expression der man-Gene, von malT und mlc in vergleichbarer Weise. Bei Wachstum auf Glycerin führt die Deletion von mlc zu einer um das 2 – 5 fach gesteigerten Expression dieser Gene. Das Wachstum eines mlc⁺ aber auch eines mlc Stammes auf Glukose resultiert in einer merkbaren aber erniedrigten Expression der oben genannten Gene. Das ist bedingt durch die fehlende Aktivierung durch den bei Wachstum auf Glukose niedrigen cAMP/CAP Spiegel. Die Expression beispielsweise der man-Gene lässt sich bei Wachstum auf Glycerin durch Zugabe von cAMP auch in einem mlc⁺ Stamm um das 14-fache erhöhen.

Zusammengefasst stehen diese Gene unter der durch Glukose vermittelten Katabolitenrepression, werden negativ durch Mlc reguliert und aktiviert durch cAMP/CAP, wobei der cAMP/CAP Effekt den Mlc Effekt überwiegt (34, 114).

Abb.5: Mlc regulierte Gene

Vergleich der Promotorregion der Mlc regulierten Gene mit der des durch NagC regulierten nagE-BACD Operons, abgewandelt nach (34, 74, 75, 114-116). Die Mlc Bindestellen, gekennzeichnet mit Mlc, erscheinen als graue Rechtecke; die CAP Bindestellen, gekennzeichnet mit CAP, als weiße Rechtecke. Die Bindestellen werden bezüglich ihrer Lage zum Transkriptionsstart (+1) der genannten Gene gezeigt.

Die Expression der pts-Gene (ptsG, ptsHI) wird positiv durch cAMP/CAP reguliert, wobei der repremierende Effekt von Mlc dem aktivierenden durch cAMP/CAP entgegen gerichtet ist. Bei Wachstum auf Glycerin, weist die mlc-Mutante im Vergleich zum mlc⁺ Stamm eine um das 20-fache höhere ptsG-Expression und eine 3-4 fach höhere ptsHI-Expression auf. Bei Wachstum auf Glukose werden sowohl im mlc, als auch im mlc⁺ Stamm die Expression von ptsG etwa 8-fach und die Expression von ptsHI 3-4 fach erhöht. Die pts-Gene werden durch Glukose induziert. Bei Wachstum einer cyaA-Mutante (Adenylatcyclase) auf Glycerin und unter Zugabe von cAMP zeigt sich keine signifikante Erhöhung der ptsG-Expression, bei zusätzlicher mlc-Mutation aber ein 23-facher Anstieg (74, 75, 115, 116).

Die Zugabe von Glukose führt zu einer Derepression der Mlc-regulierten Gene, aber auch zu Katabolitenrepresion durch die Abnahme des Aktivators cAMP/CAP. Die Expression der Mlc-regulierten Gene ist abhängig von der verbleibenden Menge an cAMP/CAP und der Affinität des Komplexes zu seinen Bindestellen (119). Die relative Affinität der zwei regulatorischen Proteine (cAMP/CAP und Mlc) zu ihren Bindestellen und die Lokalisierung der Bindestellen bestimmt die unterschiedlichen Effekte von Glukose auf die Expression der verschiedenen Operone und Gene.

1.4.3 Glukoseinduktion der pts Gene

Wie im vorangegangenen Kapitel angedeutet, hat der Transport von externer Glukose Einfluss auf die Expression der pts Gene. Bewirkt wird dies durch eine Modulation der Mlc- Aktivität. Bezieht man sich auf die Übereinstimmungen zwischen Mlc und NagC würde man erwarten, dass in gleicher Weise wie GlcNAc-6-P NagC inaktiviert (121), Mlc durch Glukose oder ein Glukose-Derivat inaktiviert wird. Diese Erwartung besteht schon im Hinblick darauf, dass durch Mlc Operone und Gene reguliert werden, deren Produkte mit dem Glukosestoffwechsel verknüpft sind. Allerdings konnte kein derartiger Induktor identifiziert werden (34, 75, 115).

Bezüglich der Glukoseinduktion gibt es Hinweise aus genetischen Studien, dass die PTS- Proteine eine Rolle bei der Signaltransduktion spielen. Mutationen in ptsHIcrr, ptsIcrr oder ptsI alleine, die zum Verlust der allgemeinen PTS-Komponenten HPr, EI und des Glukose-

spezifischen EIIA führen, bewirken eine konstitutive Expression der pts-Gene (32, 116). Wie bereits beschrieben bewirken auch Mutationen in Mlc eine konstitutive Expression der pts- Gene. Mutationen in ptsG hingegen sind dominant. Sowohl der Glukosetransport, als auch die Induktion der pts-Gene werden verhindert.

Des weiteren konnte gezeigt werden, dass auch die Aufnahme anderer PTS-Zucker, die eine Dephosphorylierung der PTS-Komponenten bewirken, die Expression der pts Gene erhöht.

Diese Form der Induktion erfolgt ebenfalls nur in Anwesenheit von intaktem PtsG. Das über PtsG transportierte, phosphorylierte, aber nicht verwertbare Substratanalogon α-methyl- Glukosid bewirkt die Dephosphorylierung der PTS-Komponenten und wirkt als Induktor der Transkription der pts-Gene. All diese Versuche zusammengefasst bedeuten, dass PtsG bei der Glukoseinduktion eine entscheidende Rolle spielt, wobei der Phosphorylierungszustand ausschlaggebend ist. Die Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade zwischen PEP und PtsG und der Transport von Glukose führen zur Dephosphorylierung von PtsG und zu einer erhöhten Expression der pts-Gene. Transport von Glukose über PtsG und die damit verbundene Dephosphorylierung des Proteins ist das induzierende Signal. (32 , 74, 75, 115, 116, 158)

Es wurde diskutiert, ob durch externe Glukose ein Signal vergleichbar einem Zwei- Komponent-Systems (60) auf Mlc übertragen wird. Der die B-Domäne enthaltende C- terminus von EIICB^Glc hat 39% Ähnlichkeit zum Transmitter Konsensus Motiv von Sensor- Kinasen (77). Demnach könnte Mlc durch PtsG phosphoryliert werden und wie verschiedene andere Antwort-Regulatoren das Signal auf die Mlc regulierten Gene übertragen. Dem widerspricht, dass das Signal durch nicht phosphoryliertes PtsG übertragen wird, und dass eine Phosphorylierung von Mlc nicht nachgewiesen werden konnte (74).

1.4.4 Die Inaktivierung des Repressors Mlc

Durch Bindetests mit PtsG enthaltenden Membranvesikeln (84, 98) und durch Koprezipitation von gereinigtem PtsG mit daran gebundenen Mlc (157), kann gezeigt werden, dass Mlc mit PtsG eine direkte Protein-Protein Interaktion eingeht. Die Experimente beweisen, dass Mlc an

nicht phosphoryliertes PtsG bindet und zeigen somit einen neuen Weg der Inaktivierung eines Repressors durch Protein-Protein-Interaktion mit einem Membranprotein.

Beide Ansätze führen zu einem Modell nach dem PtsG bei Aufnahme von externer Glukose hauptsächlich in der dephosphorylierten Form vorliegt. Mlc wird durch dephosphoryliertes PtsG an der Membran gebunden, was zu einer Derepression der Mlc regulierten Gene führt.

Bei Abwesenheit von Glukose oder anderen PTS-Zuckern sollte PtsG hauptsächlich phosphoryliert vorliegen. Mlc wird dann nicht an PtsG gebunden und bindet an die jeweiligen Bindestellen an den Promotoren der Mlc regulierten Gene (84, 98, 157) (siehe Abb. 6).

Abb.6: Inaktivierung von Mlc

Dem Modell zufolge ist PtsG (EIICB) vorwiegend phosphoryliert wenn keine Glukose transportiert wird (rechte Bildseite). Mlc bleibt an seine Operatoren gebunden. Die Expression Mlc regulierter Gene unterbleibt. Während des Transports von Glukose ist PtsG überwiegend dephosphoryliert (linke Bildseite). Mlc wird an PtsG gebunden und von den DNA-Bindestellen hin zur Membran abgezogen. Die Mlc regulierten Gene sind derepremiert. Schematische Darstellung mit Veränderungen nach (84).

Während die lösliche B-Domäne von PtsG ausreicht um Mlc zu binden (84, 98), ist die Überproduktion der löslichen B-Domäne nicht ausreichend, um eine Derepression der Mlc regulierten Gene zu bewirken. Um herauszufinden, welche Bereiche von PtsG für die Mlc Bindung benötigt werden, wurden verschiedene Deletionsmutanten von PtsG getestet. Eine trunkierte Variante von PtsG (AS: 321-477) umfast den C-terminalen Bereich der C-Domäne, den Linker zwischen C- und B-Domäne und die lösliche IIB-Domäne von PtsG (84). Die genannten Bereiche werden minimal benötigt um sowohl die Bindung von Mlc an die IIB-

Domäne zu erhalten und um zusätzlich die Derepression der Mlc regulierten Gene erreichen.

Nicht geklärt ist, ob diese Bereiche von PtsG alle eine direkte Interaktion mit Mlc eingehen.

Es könnte aber ebenfalls sein, dass der verbleibende Rest der C-Domäne bewirkt, dass die getestete trunkierte Variante von PtsG (AS: 321-477) membrangebunden ist und somit Mlc in Richtung Membran von der DNA abgezogen wird. Nach einem Modell von Buhr und Erni (1993) (21) werden die acht Transmembranhelices des PtsG von den Aminosäuren 17 – 323 gebildet. Diesem Bereich folgen eine lösliche cytoplasmatische Region (AS: 324-380), ein konservierter Linker (AS: 381-388) und die lösliche B-Domäne (AS:389-477). Die trunkierte PtsG-Variante (AS:321-477) ist nach diesem Model nicht membrangebunden. Bei Bindetests zwischen Mlc und dieser Variante, konnte Mlc aber in den Membranfraktionen nachgewiesen werden (84). Nach einem Modell von Lengeler et al. (1994) (85) befindet sich die 8. Helix von PtsG zwischen den Aminosäuren 354 und 372 wodurch die trunkierte PtsG-Variante einen Membrananker besitzt (84). Mlc würde in diesem Fall durch die trunkierte PtsG- Variante an die Membran gebunden. Das wäre ein Hinweis darauf, dass die Bindung von Mlc an weitere Bereiche außerhalb der B-Domäne nicht ausschlaggebend ist für die Derepression der Mlc reguliert Gene, wohl aber die Titration des Repressors an die Membran.

In vitro Tests mit PtsG enthaltenden Membranen zeigen, dass die PEP abhängige Phosphorylierung von PtsG reduziert wird, sobald Mlc an die Membranen gebunden ist. In vergleichbaren Ansätzen wird auch die Phosphorylierung des Substratanalogons α-methyl- Glukosid reduziert (84). Dies könnte für die Zelle eine Möglichkeit sein, die, durch erhöhte Expression des Transporters PtsG, ansteigende Glukoseaufnahme zu regulieren. Unklar ist, ob dieser Effekt unter physiologischen Bedingungen auch auftritt oder nur artifiziell bei einem Überschuss an Mlc im in vitro Test (84). Die Dissoziationskonstante KD für die Interaktion von Mlc mit seinen Operatoren (ptsG p1; ptsHI p0 ~10^-8; mlc ~10^-7) ist nur etwa 10x niedriger als die von Mlc zum EIICB^glc (~10^-7). Bedenkt man aber, dass in vivo etwa 100x mehr PtsG als Mlc vorhanden ist, sollte Mlc während des Transportes von Glukose komplett von den Operatoren abgelöst werden (98). Andererseits sollte in vivo genug Transporter von Mlc ungebunden vorliegen um den Transport von Glukose nicht zu beeinträchtigen (84).

Neben dem bekannten Modell der Inaktivierung eines Repressors durch ein Induktormolekül, kann der Mechanismus der Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren durch Bindung an die Membran durch weitere Beispiele belegt werden. In gleicher Weise wird der Aktivator des mal-Regulon, MalT, abhängig von der Transportaktivität, von der membranständigen ATPase

MalK gebunden (111). Gezeigt werden kann dies auch am Beispiel des AmtB-GlnK-Systems, bei welchem GlnK(PII Signaltransduktions-Protein) über den Ammoniumtransporter AmtB an die Membran gebunden wird und dabei der Transport von extrazellulären Ammonium auf die intrazelluläre Verfügbarkeit von Stickstoff abgestimmt wird (30).

1.5 Das Protein YeeI beeinflusst die Mlc regulierten Gene

Ein Hinweis darauf, dass weitere Faktoren die Aktivität von Mlc beeinflussen könnten, ergab bei der Suche nach Genen, deren Produkte die Aktivität oder die Expression von Komponenten des Glukose-PTS beeinflussen. Einer dieser Faktoren ist das Protein YeeI. Eine yeeI Mutante zeigt im Vergleich zum Wildtyp (i) eine verlängerte Generationszeit bei Wachstum auf Glukose oder Mannose, (ii) eine früher einsetzende und kontinuierlich ansteigende Expression von lacZ während des Wachstums auf Glukose und Laktose und (iii) eine reduzierte Expression von malT, mlc, ptsG und manXYZ. Die aufgeführten Effekte sind durch eine zusätzliche mlc Deletion suppremierbar. Überproduktion von YeeI bewirkt eine Erhöhung der Menge an Mlc, PtsG, MalT und ManXYZ. Möglicherweise greift auch YeeI in die Regulation der Mlc regulierten Gene ein, indem es Mlc durch Protein-Protein-Interaktion inaktiviert (8, 9).

1.6 Zielsetzung

Die Aufnahme von Glukose in E. coli K-12 erfolgt hauptsächlich über ein Glukose- spezifisches PTS. Die Regulation der Expression der beteiligten Komponenten erfolgt durch Mlc, cAMP/CAP, sowie weiterer unter anderem posttranskriptioneller Mechanismen. Mlc ist ein transkriptionaler Regulator, der neben ptsG (EIICB^Glc) und den Genen der allgemeinen PTS–Komponenten ptsHI (HPr, EI), auch die Gene manXYZ (Mannose spezifische PTS- Komponenten) und malT (transkriptioneller Aktivator der mal-Gene) repremiert. Die Aktivität von Mlc und die Konzentration von cAMP/CAP ist abhängig vom Phosphorylierungszustand der PTS–Komponenten und damit von dem Transport von Glukose über PtsG. Zum einen wird Mlc durch die Bindung an dephosphoryliertes PtsG inaktiviert.

Zum anderen aktiviert phosphoryliertes EIIA die Adenylatcyclase, was zur Bildung von cAMP und nachfolgend zu der des cAMP/CAP-Komplexes führt, der die Expression der oben genannten Gene positiv reguliert. Die Regulation der Gene, die für die am Transport beteiligten Komponenten kodieren, ist somit wiederum abhängig vom Transport des Substrates. Thema dieser Arbeit ist die Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli.

Ein erster Ansatzpunkt ist, die Interaktion zwischen PtsG (EIICB^Glc) und Mlc weiter zu charakterisieren. Es sollen die Bereiche in Mlc und PtsG gefunden bzw. näher charakterisiert werden, die für die Bindung der beiden Proteine aneinander benötigt werden.

Bei dem Protein YeeI könnte es sich um einen zusätzlichen Faktor handeln, der Mlc in seiner Funktion als Repressor inaktiviert. Es soll daher überprüft werden, ob eine direkte Interaktion von YeeI mit Mlc besteht.

Die Aufnahme von Glukose und anderen PTS–Zuckern führt zur Dephosphorylierung von EIIA^Glc. Unter dieser Bedingung ist der cAMP/CAP Spiegel in der Zelle niedrig, da aufgrund der fehlenden Aktivierung der Adenylatcyclase nahezu kein cAMP gebildet wird. Da die Transkription vieler kataboler Systeme eine Aktivierung durch den cAMP/CAP-Komplex benötigt, hat dies die Katabolitenrepression von Genen zur Folge, die für Komponenten zur Aufnahme und des Abbaus anderer Kohlenstoffquellen kodieren. Daneben können auch Nicht–PTS–Zucker Katabolitenrepression hervorrufen. Gezeigt wurde dies unter anderen anhand des Glycerineffektes auf die Expression der mal-Gene. Hier zeigt sich, dass Glycerin-

3-Phosphat die Aktivierung der Adenylatcyclase durch EIIA^Glc beeinflusst. Es sollte deshalb die Frage geklärt werden, ob eine Bindung zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase möglich ist und, ob diese durch Glycerin-3-Phosphat oder andere Zucker-Phosphate unterbunden werden kann.

Durch Mlc werden Gene reguliert, deren Genprodukte Teile von Transportsystemen darstellen und zum Teil auch Enzyme für den Abbau der transportierten Substrate. In all diesen Fällen wirkt Mlc als transkriptioneller Repressor. Hingegen bei der anaeroben Lactatdehydrogenase (ldhA) wirkt Mlc vermutlich indirekt als Aktivator (71). Die daraus resultierenden Fragen sind. (i) Lassen sich weitere Mlc regulierte Gene finden? (ii) Wenn ja, wirkt Mlc stets als Repressor? (iii) Sind nur Gene betroffen, die für Proteine kodieren, die für die Aufnahme und dem Metabolismus von Kohlenstoffquellen benötigt werden? Dies sollte über die Anwendung von DNA-Microarrays geklärt werden und durch die anschließende Verifizierung dieser Ergebnisse mittels weiterer Methoden.

2. Material und Methoden 2.1 Abkürzungen

ABC ATP binding cassette

AS Aminosäure(n)

Amp Ampicillin

APS Ammoniumperoxidsulfat

bp Basenpaare

ß-Gal ß-Galaktosidase

BSA Albumin aus Rinderserum

cAMP 3’,5’-cyclo-Adenosinmonophosphat CAP „cAMP receptor protein“

cat chloramphenicol acetyl transferase; verleiht Cm-Resistenz Cm, Cam Chloramphenicol

c. p. m. counts per minute Da, kDa Dalton, Kilodalton DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Dinatriumsalz) g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)

Glc Glucose

GlcNAc N-Acetyl-Glucosamin

Glyc Glycerin

IPTG Isopropyl-ß-D-Thiogalaktopyranosid

Kan Kanamycin

LB Luria Bertani Broth

Mal Maltose

MMA Minimalmedium A

MOPS 3-[N-Morpholino] Propansulfonsäure

NZA NZ-Amine

ODx optische Dichte bei der Wellenlänge x nm ONPG Orthonitrophenyl ß-D-Galaktopyranosid PCR Polymerasekettenreaktion

psi pound-force per square inch (1 psi = 6,895 kPa) PTS Phosphotransferasesystem

rpm [engl.] Umdrehungen pro Minute

r resistent

SDS [engl.] Natrium Dodecyl Sulfat Spec Spectinomycin

TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin

Tet Tetracyclin

Tris Trishydroxymethylenaminomethan

U Units

X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-ß-D-Galaktopyranosid XP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-Phosphat

2.2 Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide

Stammname relevanter Genotyp Referenz oder Quelle DHB4 F’lacI^q pro ∆(ara-leu)7697 araD139∆lacX74

galE galK rpsL

phoR ∆phoA (PvuII) ∆malF3 thi

(127)

IT1168 ^{F- lam-} IN(rrnD-rrnE)1 rph-1 deoC ptsG::Tn5(kan)

(154) JM-G2 JM101(supE thi-1 ∆(lac-proAB) [F’ traD36

proAB lacI^qZ∆M15] ) ptsG⁺ptsG-lacZ mlc::tet JM-G77 JM101(supE thi-1 ∆(lac-proAB) [F’ traD36

proAB lacI^qZ∆^{M15] ) ptsG-} lacZ(transkriptionale Fusion) ptsG::cat ptsHIcrr::kan

(115) (115)

MC4100 F- araD139 ∆(argF-lac) U169

rpsL150 relA1deoC1 ptsF25 rbsR flbB5301

(27) TG1 ^F´[lacIq lacZM15 proAB traD36] hsdD5

supE thi (lac-pro) (pro-lac) (26) DH5α ^{F- Θ80d lacZ ∆M15} ∆(lacZYA-argF)U169

recA endA1 hsdR17 (r_K^—m_K⁺) sup E44 λ^- thi-1 gyrA relA1

(56) ET104 araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rbsR relA1

rpsL150 ∆(argF-lac)U169 øP[(malT-lacZ) (λ placMu50)] ∆cya crp* ilv+ mlc::kan

(39)

ET25 MC4100; Φ(malT-lacZ) ∆cya crp* ilv+ (39)

KD413 MC4100; mlc::tet Katja Decker; Doktorarbeit, Uni- Konstanz

Bre2071 araD139 deoC1 flbB5301 θ(proV-lacZ) hyb2 (λ placMu15) osmZ200 ptsF25 rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169

Bremer, 1992

MV198 agn`-lacZ (agn=flu) (55)

SH10 F^- araC-lacZ leu^- str^-∆^{lac araD-} Jennifer Ross, John Hopkins University

SE40 MC4100 trp-1 ssuE`-lacZ ∆ssuADCB (161) SE70 MC4100 Θ(tauC-lacZ) (λ ^{placMu9) (161)} MC1061 hsdR mcrB araD139 ∆(araABC-leu)7679

∆lacX174 galU galK rpsL thi

(27) HA18 araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rpsL150

∆(argF-lac)U169 ∆(phoA20)

A. Hartmann, Diplomarbeit Uni- Konstanz

CH4 araD139 flbB5301 øP[malK-lacZ] ptsF25 rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169 ∆^cya

Christiane Braun Vertiefungskurs Uni-Konstanz

RD15 araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169 øP[(malT-lacZ)(λ placMu50)] ∆^cya::kan

Renate Dippel, Uni-Konstanz

DG102 HfrKL16 thi ∆ptsHIcrr Epstein, 1989

CV5200 MG1655 ∆^{lac X74 PsgrS-lacZ (163)}

SA1 MC4100 ptsG ::TN5(kan) diese Arbeit

SA2 KD413 ptsG ::TN5(kan) diese Arbeit

SA5 Bre2071 mlc::tet diese Arbeit

SA6 MV198 mlc::tet diese Arbeit