Die Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase

Auch die Menge des transkriptionellen Aktivatorkomplexes cAMP/CAP im Mlc-PtsG-System wird durch eine PTS-Komponente, dem EIIA^Glc, reguliert. EIIA^Glc beeinflusst die Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase, welche die Bildung von cAMP aus ATP katalysiert. Die bisherigen Ergebnisse wurden indirekt durch Untersuchung der Adenylatcyclaseaktivität in PTS-Mutanten und bei Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen erhalten (44, 78, 100, 124). Demnach wird die Aktivität der Adenylatcyclase stimuliert, wenn EIIA^Glc phosphoryliert ist, nicht aber, wenn EIIA^Glc, aufgrund des Transportes und der Phosphorylierung von PTS-Substraten (v. a. Glukose), dephosphoryliert vorliegt (124). Es wurde postuliert, dass EIIA^Glc-Phosphat an die Adenylatcyclase bindet. Diesem Modell zufolge geschieht die Aktivierung, indem durch die EIIA^Glc-Phosphat Bindung der inhibitorische Effekt aufgehoben wird, den die regulatorische C-terminale Domäne der Adenylatcyclase auf die eigene N-terminale katalytische Domäne ausübt (63, 135).

Die Adenylatcyclase kommt unter normalen, physiologischen Bedingungen nur in sehr geringen Mengen vor, etwa 15 Moleküle pro Zelle. Durch Überproduktion von plasmidkodierter Adenylatcyclase lässt sich eine Steigerung erreichen, die es erlaubt, dass Protein mit konventionellen Methoden zu reinigen und in vitro Enzymtests damit

durchzuführen (132, 171). Über die Löslichkeit und Aktivität des Proteins gibt es widersprüchliche Angaben. So wurde einerseits behauptet, dass die Assoziation des Proteins an die Membran eine Voraussetzung für dessen Aktivität sei, da diese nur in permeabilisierten Zellen nachweisbar war und nicht im zellfreien System (135). Es wurde weiter beschrieben, dass etwa 75 % des Proteins in der Membranfraktion zu finden wären und etwa 25 % als lösliches Protein im Cytoplasma vorliegen würde. Andere Methoden der Proteinreinigung führten zu dem Ergebnis, dass nur etwa 15 % des Proteins in der Membranfraktion zu finden sind und 85 % als lösliches Protein vorliegen (171). Wie der Kontakt der Adenylatcyclase zur Membran zustande kommt ist unklar. Bisher konnte kein Protein identifiziert werden, dass die Membranbindung indirekt vermitteln könnte. Auch verschiedene hydrophobe Bereiche der Adenylatcyclase selbst sind an sich nicht ausreichend. Im Rahmen der hier durchgeführten Experimente, konnte die Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag in der Membranfraktion nachgewiesen werden. Eine ausreichende Menge der Adenylatcyclase war membranassoziiert, um damit Membranbindungstests mit EIIA^Glc durchzuführen. Die gebundene Menge entsprach schätzungsweise den in (170) angegebenen 15 – 20 % des gebildeten Proteins (Daten nicht gezeigt).

Die Ergebnisse in dieser Arbeit zeigen, dass in E .coli eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen dem EIIA^Glc und der Adenylatcyclase stattfindet. Diese Interaktion schien, zumindest unter in vitro Bedingungen, unabhängig vom Phosphorylierungszustand des EIIA^Glc zu erfolgen. Die Interaktion mit der Adenylatcyclase wurde mit gereinigtem EIIA^Glc getestet und mit Zellextrakten, die überproduziertes EIIA^Glc enthielten. In beiden Fällen war sowohl phosphoryliertes, als auch dephosphoryliertes EIIA^Glc enthalten. Zusätzlich wurde die Interaktion mit ausschließlich dephosphoryliertem EIIA^Glc getestet. Die Frage, ob die Adenylatcyclase an beide Formen von EIIA^Glc bindet oder auch nur an dephosphoryliertes EIIA^Glc konnte mit dem durchgeführten Membranbindungstests nicht beantwortet werden, da keine Probe verwendet wurde, die ausschließlich EIIA^Glc-Phosphat enthielt, beziehungsweise der Phophorylierungszustand des gebundenen EIIA^Glc nicht nachgeprüft wurde.

Das oben beschriebene Modell der Regulation der Adenylatcyclaseaktivität muss aufgrund dieser Ergebnisse neu bedacht werden. Geht man zunächst davon aus, dass sowohl die phosphorylierte als auch die dephosphorylierte Form von EIIA^Glc an die Adenylatcyclase bindet, könnte der Phosphorylierungszustand von EIIA^Glc entscheidend sein, ob das Protein

aktivierend oder deaktivierend auf die Adenylatcyclase wirkt. Das Signal könnte beispielsweise über die negative Ladung des gebundenen Phosphat übertragen werden.

Entgegen dem vorherrschenden Modell, der Aktivierung der Adenylatcyclase durch EIIA^Glc -Phosphat, gab es auch Modelle, die von einer Inaktivierung des Enzyms durch dephosphoryliertes EIIA^Glc ausgingen. Bei dem Versuch die Regulation der Adenylatcyclase in Zellextrakten zu erforschen, zeigte sich, dass die Zugabe von PTS-Komponenten und PEP alleine nicht ausreichte um den cAMP Spiegel zu erhöhen. Diese erfolgt bei Zugabe von anorganischem Phosphat (Pi). Im Gegensatz dazu inhibierte das dephosphorylierte EIIA^Glc die Adenylatcyclaseaktivität, wenn Pi zugegeben wurde (87, 124, 131). Es wurde vermutet, dass bei Vorhandensein von Pyruvat Pi in Form von ATP abgezogen wird. Daraus wurde geschlossen, dass dephosphoryliertes EIIA^Glc die Adenylatcyclase in einem Pi abhängigen Prozess inaktiviert. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen ebenfalls für die Möglichkeit der Inaktivierung der Adenylatcyclase durch dephosphoryliertes EIIA^Glc. Allerdings würde ein Modell, dass nur von einer Deaktivierung durch dephosphoryliertes EIIA^Glc ausgeht und die Aktivierung der Adenylatcyclase durch phosphoryliertes EIIA^Glc außer Acht lässt, nicht erklären weshalb die cAMP Konzentration in crr (EIIA^Glc) -Mutanten erniedrigt ist (siehe Kap. 1.3.2).

Die Dephosphorylierung von EIIA während des Transports von externer Glukose hätte somit zwei Konsequenzen. Zum einem würde die Bindung von EIIA^Glc an Permeasen und katabole Enzyme Induktorausschluss bewirken (124). Zum anderen würde die Bindung an die Adenylatcyclase deren Inaktivierung zur Folge haben. Es würde sich also bei der Inaktivierung der Adenylatcyclase um einen dem Induktorausschluss ähnlichem Mechanismus handeln.

Das Modell der Inaktivierung der Adenylatcyclase durch dephosphoryliertes EIIA^Glc lässt sich auf die durch Glukosetransport bewirkte Katabolitenrepression anwenden. Der Transport von Glukose bewirkt eine starke Dephosphorylierung von EIIA^Glc. Die Phosphorylierung des Proteins könnte, wenn auch nicht geklärt wie, die Aktivierung der Adenylatcyclase bewirken.

Hierin könnte auch der Sinn der teilweisen Membranassoziation der Adenylatcyclase liegen.

So würde die Adenylatcyclase mit gebundenen EIIA^Glc in die Nähe des EIICB^Glc (PtsG) gelangen. Die Phosphorylierung der PTS-Proteine ist reversibel. Phosphoryliertes EIICB^Glc könnte ein Zeichen dafür sein, dass keine Glukoseaufnahme mehr stattfindet und das

Phosphat auf EIIA^Glc übertragen. EIIA^Glc-Phosphat würde dann die Adenylatcyclase aktivieren oder die Bindung zwischen den Proteinen lösen.

Bei der Katabolitenrepression durch Nicht-PTS-Zucker ist das Signal für die Anwesenheit des Zuckers, das bei dessen Abbau gebildete Zucker-Phosphat. Sensor für dieses Signal ist das EIIA^Glc. Dessen Interaktion mit der Adenylatcyclase wird dahingehend beeinflusst, dass keine Aktivierung der Adenylatcyclase stattfindet (39). Das Modell der Inaktivierung der Adenylatcyclase durch EIIA^Glc würde dann auch erklären, weshalb die Zugabe der Zuckerphosphate (siehe Kap 3.3.3) die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc nicht beeinflusst hat. Die Inaktivierung des Enzyms durch dephosphoryliertes EIIA^Glc konnte so aufrecht erhalten werden. Nicht-PTS-Zucker rufen eine sehr unterschiedliche Dephosphorylierung von EIIA^Glc hervor. Diese ist meist wesentlich geringer als die durch den Transport von Glukose bewirkte. Der Transport von Glycerin und dessen Verwertung bewirkt nur eine etwa 14 % Dephosphorylierung von EIIA^Glc (61). Diese Menge an dephosphoryliertem EIIA^Glc müsste dann ausreichen um die Adenylatcyclase zu inaktivieren.

Wenn man bedenkt, dass die Adenylatcyclase in sehr geringen Mengen von nur etwa 15 Molekülen (171) in der Zelle vorkommt und das EIIA^Glc (95) mit etwa 15000 Molekülen, wäre dies vorstellbar. Zumindest eine teilweise Inhibierung.

Die Klonierung der beiden Domänen der Adenylatcyclase als separate Polypeptide ermöglichte es zu zeigen, dass EIIA^Glc durch die katalytische Domäne des Enzyms gebunden wird. Die nicht nachweisbare Bindung von EIIA^Glc an die regulatorische Domäne der Adenylatcyclase sollte vorsichtig diskutiert werden. Es ist nicht sicher, dass die unabhängig vom Rest des Proteins exprimierte Domäne auch korrekt gefaltet war. Möglich wäre auch, dass eine Bindung von EIIA^Glc über beide Domänen erfolgt und die an die regulatorische Domäne nur zu sehen ist, wenn die EIIA^Glc Bindung über die Bindung an die katalytische Domäne stabilisiert wird. Hinweise auf potentielle EIIA^Glc Bindestellen in beiden Domänen der Adenylatcyclase ergaben sich schon früher aus der Analyse von C-terminal trunkierten Varianten der Adenylatcyclase und von solchen mit einem Aminosäureaustausch in der N-terminalen Hälfte des Enzyms (31, 135). Betreffend der Bindung von EIIA^Glc an die katalytische Domäne bestand ein Unterschied, ob eine Variante (AS: 87-535) getestet wurde, deren N-terminale 86 Aminosäuren entfernt waren oder eine Variante (0-535) ohne diese Deletion. Es erfolgte keine Bindung von EIIA^Glc an die terminal trunkierte Variante. Die N-terminalen 86 Aminosäuren der Adenylatcyclase werden für die Bindung von EIIA^Glc

benötigt. Bezieht man mit ein, dass ein Fragment, das den Aminosäuren 82-341 (62) bzw. 87 – 531 (siehe Kap. 3.3.2; Abb. 33) entspricht, katalytisch aktiv ist, EIIA^Glc an den N-terminalen Bereich der Adenylatcyclase bindet und die regulatorische Domäne für die Inhibierung der Adenylatcyclaseaktivität benötigt wird, dann kann man sich ein vorläufiges in Abbildung 45 gezeigtes Modell vorstellen.

Abb. 45: Aktivierung/Inaktivierung der Adenylatcyclase.

A: Dephosphoryliertes EIIA^Glc ist an den N-terminalen Bereich der Adenylatcyclase gebunden (und evt. an die regulatorische Domäne). Die Adenylatcyclase liegt in einer Konformation vor, in der die regulatorische Domäne die Aktivität der katalytischen Domäne inhibiert. Die Ausbildung dieser Konformation wäre auch dann vorstellbar, wenn, beispielsweise in der crr (EIIA^Glc)-Mutante, kein EIIA^Glc gebunden wird.

B: Das gebundene EIIA^Glc ist phosphoryliert. Elektrostatische Abstoßung aufgrund der negativen Ladung des gebundenen Phosphates und/oder sterische Abstossung verhindern den Kontakt der regulatorischen Domäne zur katalytischen Domäne. Die Adenylatcyclase ist aktiv.

C: Die EIIA^Glc Bindung hat keinen Einfluss auf den minimal katalytischen Bereich (grün). Fehlt die regulatorische Domäne erhält man ein Protein, dass unabhängig vom Phosphorylierungszustand von EIIA^Glc oder vom Vorhandensein von EIIA^Glc aktiv ist.

Sicherlich ist der Test weiterer Adenylatcyclase Varianten in Verbindung mit der Bestimmung der Adenylatcyclaseaktivität nötig, bevor ein Modell aufgestellt werden kann, dass den tatsächlichen Gegebenheiten nahe kommt.

Zusammenfassend kann man also sagen, dass EIIA^Glc eine direkte Interaktion mit der Adenylatcyclase eingeht. Für diese Bindung ist die katalytische Domäne der Adenylatcyclase ausreichend. Das Modell der Deaktivierung der Adenylatcyclase durch dephosphoryliertes EIIA^Glc ist mit früheren Erfahrungen und den in dieser Arbeit gemachten Ergebnissen vereinbar. Nach wie vor nicht geklärt ist, wie die Zuckerphosphate auf die Adenylatcyclase-Aktivität einwirken, ob dies beispielsweise auch über die Dephosphorylierung von EIIA^Glc erreicht wird. Wäre EIIA^Glc aber nur der Inhibitor der Adenylatcyclase-Aktivität, würde man in crr (EIIA^Glc)-Mutanten einen Anstieg der Adenylatcyclase-Aktivität erwarten. Das Gegenteil ist der Fall. Der cAMP-Spiegel in einer crr-Mutante ist niedrig im Vergleich zu dem von Wildtypzellen. EIIA^Glc wird auch für die Aktivierung des Enzyms benötigt.