Oberflächenresonanzspektroskopie

Die Durchführung der Bindetests zwischen Mlc und YeeI (siehe Kap. 2.5.10) erfolgte unter Anleitung von Kerstin Mahr (FAU Erlangen-Nünberg) und in Kooperation mit Ann-Katrin Becker (Universität Osnabrück). Die Kontrollproteine Bld (Streptomyces coelicolor), CcpA (Lactobacillus cassei) und HPr (Streptomyces coelicolor) wurden von Kerstin Mahr zur Verfügung gestellt, YeeI (E. coli) von Ann-Katrin Becker. Dargestellt sind die Versuche mit gereinigtem Protein (für Mlc siehe Kap. 2.5.6).

Im ersten Experiment wurde Mlc mit C-terminalen His-tag in Flusszelle 2 (F2) an den Chip gekoppelt und als Kontrolle Bld aus Streptomyces coelicolor in Flusszelle 1 (F1). YeeI mit N-terminalen His-tag wurde mit einer Flussrate von 20 µl/min über den Chip geleitet. Die Differenz zwischen F2 und F1 betrug 230 RU (Responseunits) (Abb.32). Die in F2 höhere Massenzunahme als in F1 gibt einen Hinweis auf eine Bindung zwischen Mlc und YeeI. Der Chip wurde durch Zugabe von 0,5 M NaCl regeneriert. Als weitere Kontrolle, ob die Bindung von YeeI an Mlc spezifisch erfolgte, wurde Bld aus Streptomyces coelicolor und CcpA aus Lactobacillus cassei durch die Flusszellen geleitet. Für diese Proteine wurde keine Bindung an Mlc nachgewiesen.

Abb. 32: Oberflächenresonanzspektroskopie; Bindung von an den Chip gebundenen Mlc mit YeeI.

Mlc WT wurde an einen CM5 Sensorchip gebunden (siehe Kap. 2.5.10) und YeeI darübergeleitet. Zu sehen ist das Differenzsensorgramm der gemessenen Responseunits (RU) in Flusszelle2 – Flusszelle1. Gezeigt ist die Veränderung der Responseunits (y-Achse) bezogen auf die Zeitspanne, zu der der Analyt (YeeI) zugegeben wurde (min/x-Achse). Die Differenz der RU in F2-F1 steht für die Massenzunahme durch an Mlc gebundenes YeeI. Diese beträgt 230 RU. Letzteres weist auf eine Bindung zwischen beiden Proteinen hin.

In einem zweiten Experiment wurde YeeI in F2 an den Chip gekoppelt und in F1 zur Kontrolle CcpA aus Lactobacillus cassei. Danach wurde in drei aufeinanderfolgenden Schritten je 20 µl einer 50 nM Lösung von MlcWT mit N-terminalen His-tag, Mlc∆9 und Mlc∆18 mit N-terminalen His-tag als Analyt durch die Flusszellen geleitet. Zwischen den Schritten wurde der Chip mit 0,5 M NaCl regeneriert. Die Flussrate betrug auch hier 10 µl/min. Die Differenz der Massenzunahme (F2-F1) betrug für MlcWT 2490 RU, für Mlc∆9 500 RU und für Mlc∆18 0 RU. MlcWT bindet an YeeI, die Bindung von Mlc∆9 an YeeI ist stark reduziert und Mlc∆18 ist nicht mehr fähig an YeeI zu binden (siehe Abb. 33). Als zusätzliche Kontrollen wurden Bld und Hpr aus Streptomyces coelicolor durch die Flusszellen geleitet. Damit konnte keine unspezifische Bindung an YeeI dedektiert werden.

Abb. 33: Bindung der Mlc-Varianten an chipgebundenes YeeI.

YeeI (30 µl von 0,2 mg/ml Protein) wurde in Flusszelle 2 gebunden, CcpA (Lactobacillus cassei) (10 µl von 0,13 mg/ml Protein) in Flusszelle1. Dargestellt ist die Veränderung der Responseunits (y-Achse) bezogen auf die Zeitspanne, zu der der Analyt (Mlc-Varianten/je 20 µl einer 50 nM Lösung) zugegeben wurde (min/x-Achse).

Die Differenz der Massenzunahme in Flusszelle 2 und 1 (F2-F1) beträgt für MlcWT 2490 RU, für Mlc∆9 500 RU und für Mlc∆18 0 RU.

3.2.3 Beeinflußt YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ?

Um diese Frage zu klären, wurden, wie zuvor beschrieben (Kap. 2.5.9 und 3.1.1-3.1.3), Bindetests zwischen mit PtsG angereicherten Membranvesikeln und gereinigtem Mlc durchgeführt. Zu diesen Ansätzen wurde, während der Phase der Inkubation von Mlc mit den PtsG-Membranen, gereinigtes YeeI in unterschiedlichen Konzentrationen gegeben. Die nachfolgenden Zentrifugationsschritte wurden wie bei den Bindetests zuvor durchgeführt. Die Konzentration von PtsG in den Membranen lässt sich nicht leicht bestimmen. Deshalb wurden die eingesetzten Mengen der Monomere der gereinigten Proteine, Mlc und YeeI miteinander verglichen. Bedenkt man die Größe eines Monomers von MlcWT mit N-terminalen His-tag (= 46,263 kDa) und die Konzentration der Proteinreinigung (= 0,75 µg/µl) so hat man 16,2 µmol Mlc in 1 µl Lösung. Für 16,2 µmol YeeI mit N-terminalen His-tag (≈31 kDa) benötigt

man 0,42 µl der Reinigung mit einer Konzentration von 1,2 µg/µl. Es wurde stets 1 µl Mlc in den Tests eingesetzt.

Auf diese Art und Weise wurden Mlc und YeeI in den verschiedenen Ansätzen bis hin zu einem 72-fachen Überschuss von YeeI über Mlc zugegeben. Betrachtet man Mlc als Tetramer und YeeI als Dimer, so hätte man einen 141- fachen Überschuss an YeeI. In keinem dieser Ansätze wurde die Bindung von Mlc an PtsG beeinträchtigt. Kein Mlc ist in der Überstandfraktion zu finden, wo es sein müsste, falls es an das ebenfalls lösliche YeeI gebunden hätte bzw. wenn YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ansonsten gemindert hätte (siehe Abb. 34).

Abb. 34: Membranbindetests mit Mlc, YeeI und mit PtsG angereicherten Membranvesikeln.

Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc. Membranen für die Bindetests wurden aus Stamm IT1168 (ptsG::kan) transformiert mit pTSG11 (EIICB^Glc) präpariert. Für die Membranpräparation wurde ein Volumen an Zellextrakt verwendet, der 2 mg Protein enthielt. P steht für Pelletfraktion, die Membranen und an die Membran gebundene Proteine enthält. S steht für Überstand (Supernatant), der die löslichen Proteine enthält. 19,2 µg (16 µl), 24 µg (20 µl) und 36 µg (1170 µmol - 30 µl) YeeI wurde zugegeben. Es wurde 16,2 µmol Mlc (0,75 µg/1µl) eingesetzt. Im Bild sind als Beispiel für alle durchgeführten Bindetests, die mit den höchsten YeeI Konzentrationen gezeigt. std.: Precision Plus Protein standard (All blue/Biorad);

3.3 Einfluß von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIA

^Glc

und der Adenylatcyclase

Der cAMP/CAP Komplex ist der positive Regulator aller bekannten durch Mlc regulierten Gene. Nicht nur die Aufnahme von Glukose, sondern auch die Aufnahme und Verwertung von Nicht-PTS-Substraten bewirkt einen niedrigen cAMP Spiegel in der Bakterienzelle. Die aus den Substraten entstehenden Zuckerphosphate nehmen Einfluss auf die Interaktion zwischen der Adenylatcyclase (cyaA) und EIIA^Glc (crr). Die Aktivierung der Adenylatcyclase unterbleibt (siehe Kap. 1.3.3). Zunächst sollte ein Test entwickelt werden, mit dessen Hilfe die Einflussnahme der Zuckerphosphate gezeigt werden könnte. Dafür sollte in einem ersten Schritt geklärt werden, ob eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase besteht, und in einem zweiten Schritt, ob diese Interaktion durch die Zugabe von Zuckerphosphaten unterbunden werden kann.

Die Protein-Protein-Interaktion zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase konnte gezeigt werden. Sie erfolgte unabhängig davon, ob die phosphorylierte und die dephosphorylierte Form von EIIA^Glc zusammen vorlagen, oder ob ausschließlich die dephosphorylierte Form zugegeben wurde. Eine Bindung konnte auch nachgewiesen werden, wenn die katalytische Domäne der Adenylatcyclase als separates Polypeptid exprimiert wurde. Die Zugabe von Zuckerphosphaten zu dem in vitro Bindetest hatte keinen Einfluss auf die Bindung zwischen den beiden Proteinen.

3.3.1 Nachweis der Interaktion zwischen EIIA

^Glc

und der Adenylatcyclase

Es gibt unterschiedliche Informationen über die Löslichkeit der Adenylatcyclase und die Möglichkeit, das Protein unter nativen Bedingungen zu reinigen. Im Gegensatz zu früheren Behauptungen (134) scheint nur ein sehr geringer Prozentsatz der Adenylatcyclase membranassoziiert zu sein, wobei nicht geklärt ist wie der Kontakt zu der Cytoplasmamembran zustande kommt (170).

Da durch die Überproduktion von plasmidkodierter Adenylatcyclase auch die Menge an Protein erhöht sein dürfte, die membranassoziiert ist, wurde versucht, die Bindung zu EIIA^Glc

in Membranbindungstests, vergleichbar zu denen mit Mlc und PtsG, zu untersuchen (siehe Kap. 2.5.9 und 3.1.1-3.1.3).

Die Überproduktion der Adenylatcyclase wurde getestet, indem während des Wachstums der Bakterien 1 ml Proben aus der Kultur entnommen und mittels SDS-PAGE analysiert wurden (siehe Abb. 35). Spezifische Antikörper für den Nachweis durch einen Westernblot waren nicht verfügbar.

Abb. 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA).

Überproduktion der Adenylatcyclase erfolgte mit Stamm SA14, transformiert mit pSA8. Die Adenylatcyclase wurde hier mit der Shine Dalgarno Sequenz und dem Startcodon (TTG) von cyaA kloniert. Die Expression ist durch Arabinose induzierbar Die Induktionskontrollen (1 ml Probe der Bakterienkultur) wurden vor (v I) und 5 h nach (n I) der Induktion genommen. Das Pellet von 1ml Bakterienkultur wurde mit 2xPAP (Proteinauftragepuffer) auf eine OD=13,5 eingestellt und je 10 µl auf das Gel aufgetragen. Eine Bande bei etwa 94 kDa ist leicht verstärkt. Dies würde in etwa dem kalkulierten Molekulargewicht der Adenylatcyclase entsprechen. Std.: LMW (low molecular weight) Standard, Pharmacia.

Da EIIA^Glc auch an PtsG binden kann, wurden die Membranen grundsätzlich von Stämmen präpariert, bei denen ptsG deletiert war. Die Bindung von EIIA^Glc an solche Membranen wurde verglichen, die, aufgrund einer Mutation in cyaA, keine Adenylatcyclase exprimierten (Cya^-) mit denen, die die Adenylatcyclase plasmidkodiert überexprimierten (Cya⁺).

Die in Abbildung 36 a gezeigten Bindetest mit gereinigtem EIIA^Glc wurden wie in Kapitel 2.5.11 beschrieben durchgeführt. Dass EIIA^Glc nur in den Membranpellets (P2) der Cya⁺ Ansätze erhalten blieb, zeigt deutlich, dass EIIA^Glc an die membranassoziierte Adenylatcyclase gebunden hatte. Um zu sehen, ob EIIA^Glc unter den Versuchsbedingungen Komplexe bildet und ausfällt bzw. deshalb abzentrifugiert wird, wurde gereinigtes EIIA^Glc, ohne die Zugabe von Membranen, wie die Bindetests behandelt. Die Membranfraktionen (Pellet1/P1) des ersten Zentrifugationsschrittes nach der Inkubation mit EIIA^Glc enthielten sowohl im Cya^- als auch im Cya⁺ Ansatz EIIA^Glc. In Pellet 1 der Kontrolle ohne Membranen war kein EIIA^Glc bzw. eine kaum detektierbare Bande zu sehen. In Überstand 1 (S1) aller Ansätze war ungebundenes EIIA^Glc vorhanden. Das Membranpellet 1 (P1) wurde nochmals resuspendiert (gewaschen) und abzentrifugiert. EIIA^Glc war im Pellet 2 (P2) der Cya -Membranen nicht mehr zu detektieren und wurde folglich ausgewaschen. Ebenfalls kein EIIA^Glc befand sich im Pellet 2 der Ansätze ohne Membranen. EIIA^Glc blieb jedoch im Pellet 2 der Membranen des Cya⁺ Ansatzes erhalten (siehe Abb. 36 a). Stämme ohne Adenylatcyclase besitzen das crp* Allel. Durch letzteres wird ein CAP Protein gebildet, dass unabhängig von cAMP aktiv ist. So wurde sichergestellt, dass auch im cya-Stamm alle cAMP/CAP abhängigen Gene transkripiert wurden, obwohl keine Adenylatcyclase vorhanden ist und, dass die ausbleibende EIIA^Glc-Bindung nur auf das Fehlen der Adenylatcyclase zurückzuführen ist und nicht auf das Fehlen einer cAMP/CAP abhängigen transkripierten Membrankomponente.

Da unterschiedlichste Faktoren an der Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase beteiligt sind (siehe Kap. 1.3.2), könnte es sein, dass weitere lösliche Faktoren benötigt werden, um den Einfluss der Zuckerphosphate auf die Bindung zwischen EIIA^Glc und der Adenylatcyclase zu bewirken und nachzuweisen. Deshalb wurde versucht die Bindetests mit Zellextrakten durchzuführen, die überproduziertes EIIA^Glc ohne His-tag enthielten (siehe Abb. 36 b). Der zugegebene EIIA^Glc-Zellextrakt enthielt nur lösliche Proteine. Es zeigt sich, dass bei dem Einsatz von Zellextrakten die Membranfraktion ein weiteres Mal gewaschen werden müsste, da in Pellet 2 (P2) der Cya^- Membranen noch EIIA^Glc enthalten ist. An Membranpellet 2 (P2) des Cya⁺ Stammes ist aber deutlich mehr EIIA^Glc gebunden, so dass auch dieses Experiment auf eine direkte Interaktion zwischen EIIA^Glc der Adenylatcyclase hinweist.

Abb. 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase(CyaA).

Westernblot mit Antikörpern gegen EIIA. Der Bindetest wurde wie in Kap. 2.5.11 beschrieben durchgeführt. P1:

Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA^Glc mit den Membranen; S: Überstand 1; P2: entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Die Überproduktion der Adenylatcyclase (Cya+) erfolgte in Stamm SA14, transformiert mit pSA8 (=pBAD_cya).

Gezeigt sind in a)die Membranbindetests mit gereinigtem EIIA^Glc an: (i) oben (----) Kontrolle ohne Membranen, (ii) Mitte (cya^--) Membranen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase (CyaA) und (iii) unten (cya⁺) Membranen von einem Stamm mit CyaA.

In b) wurden Zellextrakte mit überproduziertem EIIA^Glc zugegeben.

Die Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag (99 kDa) konnte im Westernblot mit Penta-His-Antikörpern in den Membranfraktionen des Cya⁺ Stammes nachgewiesen werden (siehe Abb. 37 a). Zusätzlich wurde mit dem Penta-His-Antikörper eine Bande bei etwa 30 kDa detektiert. Es handelt sich hierbei nicht um ein Abbauprodukt der Adenylatcyclase, sondern um ein Membranprotein ohne His-tag, da man das Signal auch in der Cya^- Kontrolle erhielt, in der kein His-tag-Protein enthalten war. Der Bindetest wurde mit gereinigtem EIIA^Glc durchgeführt, das ebenfalls einen N-terminalen His-tag besitzt. Im Westernblot, der wie in den Experimenten zuvor zur Auswertung der Bindetests genutzt wurde, konnten somit beide Proteine mit dem Penta-His-Antikörper detektiert werden. Wiederum blieb das EIIA^Glc-Signal im Membranpellet P2 des Cya+ Stammes erhalten, während es in der Cya^- Kontolle ausgewaschen wurde. EIIA^Glc bindet an Membranen, die überproduzierte Adenylatcyclase enthalten (siehe Abb. 37 b).

Abb. 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIA^Glc.

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2:

entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2.

Die Adenylatcyclase wurde in Stamm Sa17 (∆cya ∆ptsG), transformiert mit pSA11, überproduziert.

In a) erfolgt der Nachweis, dass die (His6x)-Adenylatcyclase (99 kDa) in den Membranen enthalten ist und auch in P2 erhalten bleibt. Dieser Test erfolgte ohne Zugabe von EIIA^Glc. Auf Höhe der 100 kDa Standard Bande, erscheint ein Signal () in den Membranfraktionen des Cya⁺ Stammes, nicht aber im Cya^- Stamm. Bei der unteren Bande(), die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich um ein Membranprotein ohne His-tag, das durch den Antikörper erkannt wird.

In b) wurde sowohl EIIA^Glc () als auch die Adenylatcyclase () mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

3.3.2 Analyse der Interaktion zwischen EIIA

^Glc

und den Domänen der Adenylatcyclase

Eine weitere Frage, die geklärt werden sollte, war, an welche der Domänen der Adenylatcylase EIIA^Glc bindet. Die Adenylatcyclase ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa, das aus einer N-terminalen katalytischen (AS: 1-535) und einer C-terminalen regulatorischen Domäne (AS: 536-848) besteht (134). Bei Fehlen der regulatorischen Domäne hat die mit dem Transport von Glukose zusammenhängende Dephosphorylierung von EIIA^Glc keine negativen Auswirkungen mehr auf die Aktivität des Enzyms. Einem Modell zufolge inhibiert die regulatorische Domäne die Aktivität der Katalytischen. Die Anwesenheit von phosphoryliertem EIIA^Glc hebt diese Inhibition auf (siehe Kap. 1.3.2). EIIA^Glc könnte demnach an die regulatorische Domäne binden und so deren inhibitorischen Effekt verhindern. Aber auch in der katalytischen Domäne konnten drei Aminosäuren (Arg188, Asp414, Glycin463) identifiziert werden, bei deren Austausch gegen eine andere Aminosäure die Regulation der Adenylatcyclaseaktivität durch CAP verändert wird (31). Da die CAP abhängige Reduktion der Adenylatcyclase-Aktivität wiederum EIIA^Glc benötigt, könnte es also auch möglich sein, dass EIIA^Glc an die katalytische Domäne bindet.

Die getrennt voneinander klonierten Domänen wurden zur Expression gebracht und von diesen Stämmen, wie zuvor, Membranen präpariert. Beide Domänen waren membranassoziiert. Es erfolgte keine Bindung von EIIA^Glc an die regulatorische Domäne.

Von der katalytischen Domäne wurden zwei unterschiedliche Varianten getestet. Bei einer Variante wurden zusätzlich die N-terminalen 86 AS entfernt. Diese Variante zeigte ebenfalls keine EIIA^Glc Bindung. Jedoch eine Variante, ohne N-terminale Deletion, konnte wie CyaAgesamt EIIA^Glc binden.

Abbildung 38 a zeigt, dass beide Domänen membranassoziiert sind. Die Bindetests erfolgten mit gereinigtem EIIA^Glc mit N-terminalen His-tag. Es erscheint so, als bestünde kein Unterschied zwischen den Membranfraktionen P2 der Membranen, die die Adenylatcyclasedomänen enthalten und dem P2 der Negativkontrolle. EIIA^Glc bindet an keine der beiden Domänen, wenn diese als separate Polypeptidketten gebildet werden (siehe Abb.

38 b).

Abb. 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIA^Glc

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2:

ensteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2.

Die Adenylatcyclase-Domänen wurden in Stamm Sa17 (∆cya ∆ptsG), transformiert mit pSA13 und pSA16, überproduziert.

In a) erfolgte der Nachweis, dass die Domänen der Adenylatcyclase in den Membranen enthalten sind. Hier wurde kein EIIA^Glc zugegeben. Bei der unteren Bande, die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich nicht um ein Abbaubauprodukt der His-tag-Proteine, sondern um ein Membranprotein, an das der Penta-His-Antikörpers ebenfalls bindet, auch in der Kontrolle ohne Adenylatcyclase (Hisa6x).

In b) wurde sowohl EIIA^Glc als auch die Adenylatcyclase mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen.

Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

Da ein Protein seine Tertiär-/Quartiärstruktur unter anderen durch die Interaktion der Seitenketten der Aminosäuren untereinander aufrecht erhält, könnte es sein, dass die Domänen, wenn separat exprimiert nicht korrekt gefaltet werden und deshalb die Bindung von EIIA^Glc unterbleibt. Zwar ist bekannt, dass die katalytische Domäne ohne die regulatorische Domäne aktiv ist (62, 134) und deshalb korrekt gefaltet sein muss, dennoch wurde dies für die klonierten Fragmente nochmals überprüft. E. coli Zellen, die keine Adenylatcyclase besitzen, sind nicht mehr fähig auf Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, da die Transkription der Gene des Glycerintransporters und der Glycerinkinase cAMP/CAP abhängig ist (65). Wird in diesen Bakterien plasmidkodierte Adenylatcyclase oder deren katalytische Domäne zur Expression gebracht, sollten sie wieder auf Glycerin wachsen können, vorausgesetzt das Protein oder die Domäne ist korrekt gefaltet und aktiv.

Abbildung 39 zeigt die daraus erhaltenen Wachstumskurven. Zellen, die die Adenylatcyclase gesamt oder die katalytische Domäne exprimierten, zeigten vergleichbares Wachstum. Zellen, die die regulatorische Domäne exprimierten oder mit der Vektorkontrolle transformiert waren, zeigten kein Wachstum. Eine ausreichende Menge Adenylatcyclase gesamt oder der katalytischen Domäne schien korrekt gefaltet und aktiv zu sein.

Der bislang getesteten His-tag Variante der katalytischen Domäne fehlen zusätzlich 86 Aminosäuren des N-Terminus. Dass diese Variante noch katalytisch aktiv ist, deckt sich mit den Ergebnissen von Holland et al. (63). Bei den dort gezeigten Experimenten ging aus dem Trypsinverdau der Adenylatcyclase ein Fragment hervor, das den Aminosäuren 82-341, des aus 848 Aminosäuren bestehenden Proteins, entsprach. Dieses Fragment war noch immer katalytisch aktiv. Eine weitere klonierte Variante der katalytischen Domäne, die im Rahmen dieser Arbeit getestet wurde, umfasst die Aminosäuren 0-535 und hat also keine N-terminale Deletion. Wurden die Membranen von E. coli Zellen präpariert, die diese Variante der katalytischen Domäne überproduzierten, konnte eine Bindung von EIIA^Glc nachgewiesen werden (siehe Abb. 40). Das Signal in Membranpellet P2 bleibt erhalten, wenn diese katalytische Domäne (KatDom) exprimiert wird, nicht aber bei den Membranen ohne Adenylatcyclase (∆cya).

Abb. 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle.

Stamm CH4 (∆cya), transformiert mit Plasmid pHIHO101(lacI^q) und den Plasmiden pSA11(=ges;

Adenylatcyclase gesamt) oder mit pSA13(=KD; katalytischen Domäne) oder mit pSA16(=RD; regulatorische Domäne) oder pQE32(= Vektor), wurde auf Minimalmedium mit 0,4% Glycerin bei 37°C angezogen und die Transkription der Adenylatcyclase-Varianten mit 50 µM IPTG induziert. In regelmäßigen Abständen wurden Aliquots entnommen und das Wachstum durch Messung der OD bei 578 nm verfolgt.

Abb. 40 Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase und gereinigtem EIIA^Glc

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA^Glc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: ging aus Membranpellet 1 hervor, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Im Vergleich zu Abbildung 38 wurde hier die gesamte katalytische Domäne (AS: 0 – 535) kloniert (pSA12) und in Stamm SA17 überproduziert. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

3.3.3 Nachweis der Interaktion zwischen EIIA

^Glc

und der Adenylatcyclase bei Zugabe von Zuckerphosphat

Da der von mir erstellte Test geeignet war, eine Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc nachzuweisen, sollte nun getestet werden, ob diese Bindung durch die Zugabe von Zuckerphosphaten beeinflusst werden konnte.

Abb. 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc in Zellextrakten.

Westernblot mit Antikörper gegen EIIA^Glc. Der Bindetest wurde wie in Kap. 2.5.11 beschrieben durchgeführt.

P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA^Glc mit den Membranen; S1:

Überstand 1; P2: Membranpellet 1 wurde nochmals resuspendiert und abzentrifugiert. Die Adenylatcyclase wurde in Stamm SA14 ( ∆ptsG), transformiert mit pSA8 , überproduziert. EIIA^Glc wurde mittels Stamm DHB4 und pJFBH überproduziert.

Bei dem Bindetest wurden während der Inkubation von EIIA^Glc und der Adenylatcyclase die oben angegebenen Zuckerphosphate zugegeben und danach der Assay wie in den Versuchen zuvor fortgesetzt. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

Wieder wurden Membranvesikel präpariert. Einmal von einem Stamm, der die Adenylatcyclase überproduziert hatte. Zum anderen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase.

Im Bindetest wurden Zellextrakte zugegeben, die überproduziertes EIIA^Glc enthielten. Zu diesen Ansätzen wurden die Zuckerphosphate (50 mM) gegeben. In Abb. 41 ist beispielhaft der Ansatz gezeigt, dem Glukose-6-P zugegeben wurde. Wieder zeigt sich ein Problem bei

der Verwendung von EIIA^Glc-Zellextrakten. Es wäre ein weiterer Wasch/Zentrifugationsschritt nötig, um noch in Membranpellet P2 der Kontrolle gebundenes EIIA^Glc weiter zu entfernen. Dennoch zeigt ein Vergleich der Membranfraktion P2 der Cya -Kontrolle und des Cya⁺ Stammes, dass das Signal für EIIA^Glc in der Fraktion des Cya⁺ Stammes intensiver ist, was für eine Bindung von EIIA^Glc an die Cya⁺ Membranen spricht. Es kann also davon ausgegangen werden kann, dass die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc nicht durch die verwendeten Zuckerphosphate beeinträchtigt wurde (siehe Abb 41).

3.3.4 Auswirkungen der EIIA

^Glc

Phosphorylierung auf die Interaktion zwischen EIIA

^Glc

und Adenylatcyclase

Abb. 42: Bindetests mit (His6x)Adenylatclyse und gereinigtem nicht phosphoryliertem EIIA.

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von

Im Dokument Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli (Seite 97-0)