Membranassoziation ist die Voraussetzung für die Inaktivierung von

Die lösliche, cytoplasmatische B-Domäne von PtsG (EIICB^Glc) reicht aus um Mlc zu binden.

Wird sie an einen heterologen Membrananker fusioniert, vermittelt sie zudem die Inaktivierung des Repressors Mlc und damit die Derepression der Mlc-regulierten Gene.

Indem lösliches EIIB^Glc an eine Chipoberfläche gekoppelt wurde, konnte von Nam et al.

(2001) mit der Methode der Oberflächenresonanzspektroskopie bewiesen werden, dass dieser Teil von PtsG ausreicht, um den löslichen Transkriptionsfaktor Mlc zu binden (98).

Vergleichbar dazu konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Mlc an EIIB^Glc bindet, das mit einem C-terminalen His-tag an eine mit Ni²⁺ beladene Säule gebunden war. Diese Bindung hielt dem Auswaschen ungebundener Proteine stand. Mlc konnte zusammen mit EIIB^Glc durch Zugabe von Imidazol eluiert werden.

Die Überproduktion der B-Domäne bewirkt aber in vivo keine Derepression, was mittels lacZ-Fusionen zu Promotoren von Mlc regulierten Genen gezeigt werden konnte (84).

Verschiedene PtsG Deletionsvarianten wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in einem Membranbindungstest Mlc stabil zu binden (84). Bleibt zusätzlich zur B-Domäne eine potentielle neunte Helix von PtsG erhalten ((21, 85) siehe Kap. 3.1.4) und der Linker (83), der die beiden Domänen des Proteins verbindet, dann erfolgt die Bindung von Mlc an die Membran und die Derepression der Mlc regulierten Gene. Die Untersuchungen in dieser Arbeit sollten nun zeigen, ob das Vorhandensein der neunten Helix und des Linker die Inaktivierung von Mlc bewirkt. In diesem Fall würde man in diesem Bereich Aminosäurereste vermuten, die an der Mlc Bindung mitwirken. Andererseits könnte dieser Bereich einfach nur die Verankerung von EIIB^Glc in der Membran bewirken. EIIB^Glc wurde hierfür an das Gp8-Protein, einem Hüllprotein des Phagen M13, fusioniert. Dieses bildet einen heterologen Membrananker mit keinerlei Ähnlichkeit zu PtsG. Das exprimierte Fusionsprotein konnte in den Membranfraktionen nachgewiesen werden. Es vermittelt wie PtsG die Membranbindung von Mlc. In Zellen, die das EIIB-Gp8 Fusionsprotein unter nicht phosphorylierenden Bedingungen überproduzierten, sind die Mlc regulierten Gene derepremiert. Die neunte Helix und der Linker von PtsG haben daher die Funktion eines Membranankers. Mlc wird inaktiviert, indem es über EIIB^Glc an die Membran bindet. Dieses Ergebnis wurde durch Tanaka et al. (2004)(156) bestätigt. Statt des Gp8-Proteins wurde hier die Laktosepermease LacY als Membrananker an EIIB^Glc fusioniert.

Wenn nun beide Formen der IIB-Domäne, die lösliche wie die membrangebundene, Mlc binden, weshalb bewirkt nur die membrangebundene Variante die Inaktivierung von Mlc als Repressor? Bislang wurde in keinem Experiment gezeigt, dass Mlc gleichzeitig an DNA und an EIIB^Glc bindet. Die von Tanaka et al. (2004)(156) gefundenen Mutationen im N-terminalen Bereich von Mlc, die die Bindung von Mlc an PtsG verhinderten, sprechen auch mehr dafür, dass beides nicht gleichzeitig erfolgen kann. Möglicherweise ist aber dieser Blick zu eingeschränkt, wenn man bedenkt, dass für die DNA-Bindung von Mlc eine Dimere Form des Repressors ausreichen würde. Die beiden Mlc Dimere, die in der asymmetrischen Einheit des Mlc Kristalls gefunden wurden, besitzen jeweils eine monomere Kette, die mit der des anderen Dimers übereinstimmt. Die jeweils andere monomere Kette ist strukturell unterschiedlich, was Bereiche im Molekül andeutet, die eine gewisse Beweglichkeit erlauben.

Auswirkung hat diese Beweglichkeit auf die Anordnung der Helices im HTH-Motiv, so dass das eine Dimer eher die DNA bindende Form beschreibt als das andere (139). Geht man nun

davon aus, dass sich beide Dimere auch im Mlc Tetramer wiederfinden und dass nur das Dimer für die DNA Bindung benötigt würde, wäre die gleichzeitige Bindung von DNA und EIIB^Glc eventuell möglich. Diese Möglichkeiten könnte auch im Zusammenhang mit der seit kurzem bekannten Tatsache, dass nicht alles PtsG in die Membran eingebaut wird, diskutiert werden. Ein Teil des translatierten Proteins liegt als lösliche, monomere Form in der Zelle vor (1), die unter Umständen ebenfalls an Mlc binden kann. Bezieht man sich wiederum auf die Hypothese, dass für die Tetramerisierung von Mlc über die exponierte C-terminale Helix eine Rotation des HTH-Motives notwendig, könnte man zwei Zustände von Mlc postulieren. Diese sind eine dimere, DNA bindende Form und eine tetramere Form, die an PtsG bindet (138).

Letztendlich führen experimentelle Befunde und Modellvorstellungen abermals zu dem Schluss, dass die Derepression der Mlc regulierten Gene eine direkte Folge des Abtitrierens von Mlc an die Membran ist.

Eine mögliche Rolle der C-terminalen amphipatischen α-Helix könnte sein, dass dieser Teil von Mlc, über die Bindung an PtsG hinaus, direkt an die Membran bindet. Bei Proteinen mit ebenfalls einer amphipatischen Helix, wie EIIA^Glc (165) oder MinD (153), vermittelt diese Helix die Membranassoziation bzw. stabilisiert über den Kontakt mit der Membran die Bindung an ein Membranprotein. Das wäre eine weitere Erklärungsmöglichkeit, weshalb die

∆18 AS Variante nicht stabil an die Membran gebunden wird. Die Idee, dass die Membran oder Membrankomponenten für die Mlc-Inaktivierung von Bedeutung sein könnten, ergab sich aus dem Vergleich zu Untersuchungen an dem Antiterminator BglG (49) aus E. coli und ToxR aus Vibrio colerae (94, 109). Diese waren trotz der potentiell räumlichen Trennung, bzw. Fixierung an einem Ort durch Membranbindung, regulatorisch aktiv. Diese Annahme wird ebenfalls durch die Experimente von Tanaka (2004) (156) unterstützt. Das über den Membrananker (LacY) an der Membran fixierte Mlc hatte im Gegensatz zu einem löslichen Mlc-Fusionsprotein keine Repressoraktivität. Die Ergebnisse aus den Untersuchen der Gp8-IIB-Fusionsproteine und der Mlc-Varianten, zusammen mit den von Tanaka (156) gemachten Beobachtungen zeigen, dass PtsG Mlc in Abhängigkeit vom Glukosetransport an die Membran bindet. Der Membrankontakt an sich und nicht die Bindung zu PtsG inaktiviert den Repressor Mlc.

Auch, wenn in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass Bereiche von PtsG, die außerhalb der B-Domäne liegen, im Bezug auf die Mlc-Bindung nur die Membranlokalisation verursachen, so bestand dennoch ein Unterschied darin, ob im Membranbindetest das PtsG

(EIICB^Glc) insgesamt vorlag oder die Gp8-IIB-Fusion. Bei Verwendung der Gp8-IIB-Fusion war früher eine sättigende Bindung von Mlc erreicht. Im Bindetest konnte durch die mit PtsG angereicherten Membranen 2 µg Mlc gebunden werden, durch Gp8-IIB aber nur 1 µg Mlc.

Das Gp8-IIB-Fusionsprotein könnte vergleichbar löslichem EIIB^Glc als Monomer an die Membran gebunden werden, während PtsG als Dimer vorliegt (173). Die ausbleibende Oligomerisierung von EIIB^Glc könnte dann die Affinität der Mlc Bindung verringern oder die Stoichiometrie der Mlc – IIB Bindung verändern. Weitere Beobachtungen sprechen dafür, dass die C-Domäne von PtsG zwar nicht direkt an der Bindung von Mlc beteiligt ist, aber die B-Domäne derart beeinflussen könnte, dass die Mlc-Bindung mit höherer Affinität stattfindet.

So konnten für EIIC^Glc Mutationen beschrieben werden, deren Substratspezifität zum einen verändert ist (80, 105) und zum anderen die Repression der Mlc regulierten Gene auch unter nicht induzierenden Bedingungen teilweise aufheben (104, 117, 172). Die dabei erhaltenen Mutationen befinden sich an Positionen in EIIC^Glc , die nicht in direkten Kontakt mit Mlc treten können. Das Gp8-EIIB^Glc ist daher ausreichend für die Bindung von Mlc und bewirkt die Inaktivierung des Repressors durch dessen Bindung an die Membran. Unter normalen in vivo Bedingungen mit Wildtyp PtsG erfolgt das induzierende Signal durch den Transport von Glukose und der damit verbundenen Dephosphorylierung von PtsG. Ein möglicherweise damit verbundener Einfluss der C-Domäne auf die in der B-Domäne gelegene Bindestelle von Mlc könnte die Affinität der Mlc-Bindung erhöhen.