Die Phosphorylierungsabhängige Bindung von EIIB Glc und Mlc

Mlc bindet an dephosphoryliertes PtsG wie man es bei aktivem Transport von Glukose vorfindet. Die Phosphorylierungsstelle von PtsG befindet sich an dem Cys421 innerhalb der cytoplasmatischen B-Domäne von PtsG. In einer durch NMR Spektroskopie ermittelten Struktur der löslichen IIB-Domäne findet man das Cys421 innerhalb einer konvexen Oberfläche. Es ist Teil eines polaren Bereichs, der von hydrophoben Aminosäureresten und einem Halbkreis an hydrophilen Aminosäureresten umgeben ist (25, 37, 47). Die Bindetests mit Varianten des Gp8-IIB-Fusionsproteins zeigten, dass das in diesem Bereich befindliche Arg424 für die Bindung von Mlc unbedingt erforderlich ist. Der Austausch von Arg424 nach Ala, Lys oder His verhinderte die Bindung von Mlc an EIIB^Glc.

Da die Bindung von Mlc an EIIB^Glc davon abhängt, dass dieses dephosphoryliert vorliegt, war zunächst die Phosphorylierungsstelle von PtsG, das Cys421, ein Ziel der Untersuchung. Dabei wurden Gp8-IIB^Glc-Fusionsproteine mit einem Austausch unterschiedlicher Aminosäuren, in und um die Phosphorylierungsstelle, getestet. Beide Varianten mit Aminosäureaustausch Cys421Ser oder Cys421Asp binden Mlc. Diese Bindung und die Derepression der Mlc regulierten Gene ist konstitutiv, da EIIB^Glc nicht mehr phosphoryliert werden kann. Eine Möglichkeit wäre gewesen, dass die Thiolgruppe des Cysteins an der Mlc Bindung beteiligt ist. Diese wäre bei dem phosphorylierten EIIB^Glc nicht mehr zur Verfügung gestanden. Der Aminosäureaustausch nach Serin und Aspartat sollte die dephosphorylierte und die phosphorylierte Form simulieren (siehe Kap. 3.1.3) um herauszufinden, ob die durch das gebundene Phosphat eingebrachte negative Ladung die Mlc Bindung verhindert. Der Bindetest jedoch zeigte, weder wird die Thiolgruppe von Cys421 für die Mlc Bindung benötigt, noch wird die Bindung durch die zusätzliche negative Ladung, wie sie bei der Phosphorylierung zu erwarten ist, verhindert.

Untersuchungen an PtsG mit einem Austausch des Arg424 oder Arg426 nach Alanin, zeigen, dass diese Proteine Glukose weder transportieren, noch phosphorylieren. Im in vitro Test können diese Varianten nicht mehr durch Glukose dephosphoryliert werden und man geht deshalb davon aus, dass die Aminosäurereste für den Phosphattransfer von EIIB auf Glukose benötigt werden (83). Aus der NMR Struktur des EIIB^Glc/EIIA^Glc Komplexes geht hervor, dass Arg424 und auch Arg426 durchaus in Kontakt zu EIIA^Glc stehen und dass vor allem Arg424 Teil eines Netzwerkes an Aminosäureresten ist, das die Thiolgruppe des Cys421 über Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert (25). Die hier getesteten Gp8-IIB-Varianten mit dem Austausch Arg426 oder Asp419 waren weiterhin fähig Mlc zu binden und die Derepression der Mlc regulierten Gene zu vermitteln. Beides ist bei einem Austausch von Arg424 nach Ala komplett aufgehoben. Durch den Austausch Arg424 nach His oder Lysin, wird zwar der Aminosäurerest, aber nicht die Ladung in diesen Bereich des Proteins verändert. Es erfolgte keine Bindung an Gp8-IIB (Arg424Lys), aber noch ein Rest an Bindung an die Variante (Arg424His). Gebundenes Mlc kann aber durch zusätzliches Resuspendieren und Abzentrifugieren der Membranen gelöst werden. Dies ist bei den Varianten, an die Mlc stabil gebunden ist, nicht möglich. In vivo vermittelt keine der drei Arg424-Varianten die Derepression durch Mlc repremierter Gene.

Die bisherigen Ergebnisse beziehen sich auf Versuche, die unter dem Ausschluss der PTS abhängigen Phosphorylierung der Gp8-IIB-Varianten durchgeführt worden waren. Wurden

die Membranen von Zellen präpariert, die noch zur PTS abhängigen Phosphorylierung der Gp8-IIB-Varianten fähig waren, so enthielten die Membranen eine Mischung aus phosphorylierten und dephosphorylierten EIIB^Glc. Die Ergebnisse dieser Bindetests entsprachen weitestgehend den zuvor durchgeführten. Die Bindung von Mlc an das Wildtyp EIIB^Glc und die Variante EIIB^Glc (Arg426Ala) war etwas reduziert, was sich im Falle des Wildtyp EIIB^Glc leicht durch eine geringere Menge des Proteins erklären ließ. Das zeigte ein Westerblot mit Antkörpern gegen EIIB^Glc, mit dem das Vorkommen der Gp8-IIB-Varianten in der Membran miteinander verglichen wurde. EIIB^Glc (Arg426Ala) konnte in in vitro Phosphorylierungsassays weniger phophoryliert werden. Es wird vermutet, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass das Protein unter den in vitro Bedingungen weniger dephosphoryliert wird und deshalb auch weniger durch das nachweisbare ³²P phosphoryliert wird (J.

Plumbridge, persönliche Mitteilung). Daraus konnte geschlossen werden, dass ein größerer Anteil des Gp8-IIB (Arg426Ala) phosphoryliert war, als in den anderen Proben, was letztendlich die reduzierte Bindung von Mlc bewirkte.

In begleitend durchgeführten Untersuchungen der Gp8-IIB-Varianten, wurde getestet, ob deren Überproduktion die Repression einer ptsG-lacZ-Fusion verhindert. Um eine maximale Bindung von Mlc an die IIB-Varianten zu erreichen wurde dies unter Bedingungen durchgeführt, die keine PTS abhängige Phosphorylierung ermöglichten. Die nicht im Bindetest analysierten Varianten Thr423Ala, Gln456Ala zeigten nur eine eingeschränkte Derepression und die Varianten Arg424Ala/His/Cys, sowie die Doppelmutante Ile458//Gln456-Ala keinerlei Derepression der Mlc regulierten Gene (J. Plumbridge in (141)).

Die Bindetests zusammen mit den Ergebnissen, die sich auf die Repression und Induktion der ptsG-lacZ-Fusion stützen, lassen vermuten, dass eine mögliche Mlc-Bindetstelle an EIIB^Glc mit dem Bereich überlappt, an den auch EIIA^Glc gebunden wird und der die Phosphorylierungsstelle, das Cys421, enthält (siehe auch (25)). Mittels NMR Spektroskopie wurde durch die Phosphorylierung von Cys421 bezüglich der Region Ile422, Thr423, Arg424 eine potentielle Konformationsänderung gezeigt (47), welche von Mlc wahrgenommen werden könnte.