Analyse der Interaktion zwischen EIIA Glc und den Domänen der

Eine weitere Frage, die geklärt werden sollte, war, an welche der Domänen der Adenylatcylase EIIA^Glc bindet. Die Adenylatcyclase ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa, das aus einer N-terminalen katalytischen (AS: 1-535) und einer C-terminalen regulatorischen Domäne (AS: 536-848) besteht (134). Bei Fehlen der regulatorischen Domäne hat die mit dem Transport von Glukose zusammenhängende Dephosphorylierung von EIIA^Glc keine negativen Auswirkungen mehr auf die Aktivität des Enzyms. Einem Modell zufolge inhibiert die regulatorische Domäne die Aktivität der Katalytischen. Die Anwesenheit von phosphoryliertem EIIA^Glc hebt diese Inhibition auf (siehe Kap. 1.3.2). EIIA^Glc könnte demnach an die regulatorische Domäne binden und so deren inhibitorischen Effekt verhindern. Aber auch in der katalytischen Domäne konnten drei Aminosäuren (Arg188, Asp414, Glycin463) identifiziert werden, bei deren Austausch gegen eine andere Aminosäure die Regulation der Adenylatcyclaseaktivität durch CAP verändert wird (31). Da die CAP abhängige Reduktion der Adenylatcyclase-Aktivität wiederum EIIA^Glc benötigt, könnte es also auch möglich sein, dass EIIA^Glc an die katalytische Domäne bindet.

Die getrennt voneinander klonierten Domänen wurden zur Expression gebracht und von diesen Stämmen, wie zuvor, Membranen präpariert. Beide Domänen waren membranassoziiert. Es erfolgte keine Bindung von EIIA^Glc an die regulatorische Domäne.

Von der katalytischen Domäne wurden zwei unterschiedliche Varianten getestet. Bei einer Variante wurden zusätzlich die N-terminalen 86 AS entfernt. Diese Variante zeigte ebenfalls keine EIIA^Glc Bindung. Jedoch eine Variante, ohne N-terminale Deletion, konnte wie CyaAgesamt EIIA^Glc binden.

Abbildung 38 a zeigt, dass beide Domänen membranassoziiert sind. Die Bindetests erfolgten mit gereinigtem EIIA^Glc mit N-terminalen His-tag. Es erscheint so, als bestünde kein Unterschied zwischen den Membranfraktionen P2 der Membranen, die die Adenylatcyclasedomänen enthalten und dem P2 der Negativkontrolle. EIIA^Glc bindet an keine der beiden Domänen, wenn diese als separate Polypeptidketten gebildet werden (siehe Abb.

38 b).

Abb. 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIA^Glc

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2:

ensteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2.

Die Adenylatcyclase-Domänen wurden in Stamm Sa17 (∆cya ∆ptsG), transformiert mit pSA13 und pSA16, überproduziert.

In a) erfolgte der Nachweis, dass die Domänen der Adenylatcyclase in den Membranen enthalten sind. Hier wurde kein EIIA^Glc zugegeben. Bei der unteren Bande, die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich nicht um ein Abbaubauprodukt der His-tag-Proteine, sondern um ein Membranprotein, an das der Penta-His-Antikörpers ebenfalls bindet, auch in der Kontrolle ohne Adenylatcyclase (Hisa6x).

In b) wurde sowohl EIIA^Glc als auch die Adenylatcyclase mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen.

Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

Da ein Protein seine Tertiär-/Quartiärstruktur unter anderen durch die Interaktion der Seitenketten der Aminosäuren untereinander aufrecht erhält, könnte es sein, dass die Domänen, wenn separat exprimiert nicht korrekt gefaltet werden und deshalb die Bindung von EIIA^Glc unterbleibt. Zwar ist bekannt, dass die katalytische Domäne ohne die regulatorische Domäne aktiv ist (62, 134) und deshalb korrekt gefaltet sein muss, dennoch wurde dies für die klonierten Fragmente nochmals überprüft. E. coli Zellen, die keine Adenylatcyclase besitzen, sind nicht mehr fähig auf Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, da die Transkription der Gene des Glycerintransporters und der Glycerinkinase cAMP/CAP abhängig ist (65). Wird in diesen Bakterien plasmidkodierte Adenylatcyclase oder deren katalytische Domäne zur Expression gebracht, sollten sie wieder auf Glycerin wachsen können, vorausgesetzt das Protein oder die Domäne ist korrekt gefaltet und aktiv.

Abbildung 39 zeigt die daraus erhaltenen Wachstumskurven. Zellen, die die Adenylatcyclase gesamt oder die katalytische Domäne exprimierten, zeigten vergleichbares Wachstum. Zellen, die die regulatorische Domäne exprimierten oder mit der Vektorkontrolle transformiert waren, zeigten kein Wachstum. Eine ausreichende Menge Adenylatcyclase gesamt oder der katalytischen Domäne schien korrekt gefaltet und aktiv zu sein.

Der bislang getesteten His-tag Variante der katalytischen Domäne fehlen zusätzlich 86 Aminosäuren des N-Terminus. Dass diese Variante noch katalytisch aktiv ist, deckt sich mit den Ergebnissen von Holland et al. (63). Bei den dort gezeigten Experimenten ging aus dem Trypsinverdau der Adenylatcyclase ein Fragment hervor, das den Aminosäuren 82-341, des aus 848 Aminosäuren bestehenden Proteins, entsprach. Dieses Fragment war noch immer katalytisch aktiv. Eine weitere klonierte Variante der katalytischen Domäne, die im Rahmen dieser Arbeit getestet wurde, umfasst die Aminosäuren 0-535 und hat also keine N-terminale Deletion. Wurden die Membranen von E. coli Zellen präpariert, die diese Variante der katalytischen Domäne überproduzierten, konnte eine Bindung von EIIA^Glc nachgewiesen werden (siehe Abb. 40). Das Signal in Membranpellet P2 bleibt erhalten, wenn diese katalytische Domäne (KatDom) exprimiert wird, nicht aber bei den Membranen ohne Adenylatcyclase (∆cya).

Abb. 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle.

Stamm CH4 (∆cya), transformiert mit Plasmid pHIHO101(lacI^q) und den Plasmiden pSA11(=ges;

Adenylatcyclase gesamt) oder mit pSA13(=KD; katalytischen Domäne) oder mit pSA16(=RD; regulatorische Domäne) oder pQE32(= Vektor), wurde auf Minimalmedium mit 0,4% Glycerin bei 37°C angezogen und die Transkription der Adenylatcyclase-Varianten mit 50 µM IPTG induziert. In regelmäßigen Abständen wurden Aliquots entnommen und das Wachstum durch Messung der OD bei 578 nm verfolgt.

Abb. 40 Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase und gereinigtem EIIA^Glc

Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA^Glc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: ging aus Membranpellet 1 hervor, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Im Vergleich zu Abbildung 38 wurde hier die gesamte katalytische Domäne (AS: 0 – 535) kloniert (pSA12) und in Stamm SA17 überproduziert. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

3.3.3 Nachweis der Interaktion zwischen EIIA

und der Adenylatcyclase bei Zugabe von Zuckerphosphat

Da der von mir erstellte Test geeignet war, eine Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc nachzuweisen, sollte nun getestet werden, ob diese Bindung durch die Zugabe von Zuckerphosphaten beeinflusst werden konnte.

Abb. 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc in Zellextrakten.

Westernblot mit Antikörper gegen EIIA^Glc. Der Bindetest wurde wie in Kap. 2.5.11 beschrieben durchgeführt.

P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA^Glc mit den Membranen; S1:

Überstand 1; P2: Membranpellet 1 wurde nochmals resuspendiert und abzentrifugiert. Die Adenylatcyclase wurde in Stamm SA14 ( ∆ptsG), transformiert mit pSA8 , überproduziert. EIIA^Glc wurde mittels Stamm DHB4 und pJFBH überproduziert.

Bei dem Bindetest wurden während der Inkubation von EIIA^Glc und der Adenylatcyclase die oben angegebenen Zuckerphosphate zugegeben und danach der Assay wie in den Versuchen zuvor fortgesetzt. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

Wieder wurden Membranvesikel präpariert. Einmal von einem Stamm, der die Adenylatcyclase überproduziert hatte. Zum anderen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase.

Im Bindetest wurden Zellextrakte zugegeben, die überproduziertes EIIA^Glc enthielten. Zu diesen Ansätzen wurden die Zuckerphosphate (50 mM) gegeben. In Abb. 41 ist beispielhaft der Ansatz gezeigt, dem Glukose-6-P zugegeben wurde. Wieder zeigt sich ein Problem bei

der Verwendung von EIIA^Glc-Zellextrakten. Es wäre ein weiterer Wasch/Zentrifugationsschritt nötig, um noch in Membranpellet P2 der Kontrolle gebundenes EIIA^Glc weiter zu entfernen. Dennoch zeigt ein Vergleich der Membranfraktion P2 der Cya -Kontrolle und des Cya⁺ Stammes, dass das Signal für EIIA^Glc in der Fraktion des Cya⁺ Stammes intensiver ist, was für eine Bindung von EIIA^Glc an die Cya⁺ Membranen spricht. Es kann also davon ausgegangen werden kann, dass die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA^Glc nicht durch die verwendeten Zuckerphosphate beeinträchtigt wurde (siehe Abb 41).

3.3.4 Auswirkungen der EIIA

Phosphorylierung auf die Interaktion