Die Rolle des C-Terminus von Mlc

Die in dieser Arbeit erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die Sequenzen am carboxy-terminalen Ende von Mlc eine wichtige Rolle bei der Tetramerisierung des Proteins, der DNA-Bindung und der Bindung an den Transportkomplex EIICB^Glc (PtsG) einnehmen. Dabei wurde eine 18 Aminosäuren umfassende Sequenz untersucht, durch welche eine α-Helix mit möglicherweise amphipatischen Charakter gebildet wird. Es sollte die Frage geklärt werden, ob die Protein-Protein-Interaktion zu PtsG über die hydrophoben Bereiche der Helix erfolgt. In einem ersten Versuch wurden zwei Deletions-Varianten von Mlc hergestellt. Die Variante Mlc∆9, der neun

C-terminale Aminosäuren und somit die Hälfte der Helix entfernt wurden, zeigt eine dem Mlc WT vergleichbare Repression der Mlc regulierten Gene und Bindung an PtsG. MlcWT und Mlc∆9 bilden unter nativen Pufferbedingungen Tetramere. Die Bildung von Mlc Tetrameren durch MlcWT konnte schon früher durch ein vergleichbares Experiment dargestellt werden (98). Im Gegensatz dazu bildet die Variante Mlc∆18 Dimere und besitzt weder die Fähigkeit zur Bindung an PtsG, noch an die DNA.

Aus den Ergebnissen in Kapitel 3.1.2 ergaben sich keine direkten Hinweise auf eine bestimmte Region von Mlc, die an der PtsG-Bindung beteiligt ist. Vielmehr zeigt sich, dass die C-terminale Region die Struktur von Mlc an sich beeinflusst oder zumindest an der Ausbildung einer korrekten Tertiär und/oder Quartiärstruktur beteiligt sein muss. Letzteres, die Ausbildung des Tetramers, scheint eine Vorraussetzung für die Repressorfunktion des Proteins zu sein. Ein Vergleich zu anderen transkriptionellen Repressoren wie LacI (16) oder dem zu Mlc homologen NagC (120) zeigt, dass diese aufgrund der Tetramerisierung zwei palindrome Operatorsequenzen binden können, was zur Ausbildung einer DNA-Schleife führt, die zu einer effektiven Repression der Zielgene beiträgt. Jedoch nur im Bereich der ptsG Promotoren sind zwei Bindestellen für Mlc zu finden (115) und auch hier findet keine kooperative Bindung dieser Bindestellen statt. Weitere Zielgene werden repremiert, indem Mlc an eine palindrome Bindestelle bindet, die man nahe oder überlappend mit dem Transkriptionsstart vorfindet (34, 114, 116). So betrachtet wäre die Ausbildung eines Mlc Dimers mit der Bindung je eines der HTH-Motive an je eine Operatorhälfte vollkommen ausreichend (110). Die deletierten C-terminalen Bereiche scheinen daher direkt oder über die Stabilisierung anderer Bereiche im Protein für die Stabilität des N-terminalen DNA-Bindemotives nötig zu sein.

Betrachtet man die ∆18 AS Variante von Mlc und setzt deshalb voraus, dass der C-terminale Bereich für die Tetramerisierung des Proteins benötigt wird, so könnte ein ähnlicher Mechanismus der Tetramerisierung wie bei dem Lac-Repressor LacI vorliegen. Bei diesem wird über mehrere C-terminale α-Helices ein Dimer aus zwei Dimeren gebildet (86). Die Struktur von kristallisiertem Mlc konnte kürzlich gelöst werden (48, 139). In der asymmetrischen Einheit des Kristalls findet man zwei Mlc Dimere. In Abbildung 44 ist die Struktur eines der Dimere gezeigt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren sind rot markiert. Der C-Terminus faltet in diesem Modell zurück auf den N-Terminus. Es entsteht ein Protein mit drei Domänen. Domäne 1 umfasst die Aminosäuren 1 –81 und enthält das HTH-Motiv (grün),

Domäne 2 (gelb/rot) die Aminosäuren 82 bis 194 und 381 bis 406. Domäne 3 (blau) enthält die Aminosäuren 195 bis 380. Der Teil der potentiellen Helix, der in der ∆9 AS Variante deletiert ist, ist in Kontakt mit Domäne 1 und stabilisiert möglicherweise das HTH-Motiv bezüglich der Domäne 2. Die neun zusätzlich deletierten Aminosäuren der ∆18 AS Variante haben Kontakt zu den hydrophoben Resten eines zentralen ß-Faltblatts in Domäne 2. Eine Tetramerisierung über die C-terminale amphipatische Helix liegt, in Bezug auf diese Struktur, im Bereich des Möglichen, würde aber die Rotation des HTH-Motives erfordern, damit der C-terminale Bereich nach außen falten und den Kontakt zwischen den Dimeren bilden kann. Die Deletion der 18 Aminosäuren könnte zu zweierlei Konsequenzen führen. Einerseits könnte Domäne 2 nicht mehr richtig gefaltet sein, mit Konsequenzen für das HTH-Motiv, andererseits könnte die Flexibilität des HTH-Motivs selbst erhöht werden, was wiederum eine effektive DNA-Bindung verhindert (139).

Abb. 44: Struktur des MlcH52 Dimers (138).

Die Abbildung zeigt die ermittelte Struktur eines der Dimere, das in der asymmetrischen Einheit des Mlc-Kristalls zu finden ist. Domäne 2 ist gelb (und rot), Domäne 3 ist blau dargestellt. Die N-terminale Domäne 1 mit HTH-Motiv ist mit grün, die C-terminale amphipatische α-Helix ist mit rot gekennzeichnet. Ein gebundenes Zn²⁺ Ion ist als graue Kugel dargestellt. Den Aminosäuren 1-11 und 61-79 in Domäne 1 konnte keine definierte Struktur zugeordnet werden und sind deshalb ausgespart worden. Die Dimerkontakte finden über Domäne 3 statt.

Im Gegensatz zu dem Modell, das den C-Terminus von Mlc als den möglichen Kontaktbereich zu PtsG betrachtet, wurden von Tanaka et al. (2004) Mlc-Varianten mit je einem Aminosäureaustausch selektioniert, die zwar normale Repressorfunktion besitzen, aber nicht mehr durch Glukose induziert werden können (156). Die Induktion durch Glukose kann dabei als ein Maß für die Bindung an PtsG gesehen werden (siehe Kap. 1.4.3 und 1.4.4). Eine Mutation (I34V) befindet sich in der ersten Helix des HTH-Motivs, die andere Mutation (H86R) wäre, verglichen mit der Kristallstruktur, in Domäne 2, aber nicht an einer exponierten Oberfläche zu finden. Unklar ist, ob diese Aminosäuren in direkten Kontakt mit PtsG treten können, oder ob der Aminosäureaustausch indirekt auf die Bereiche einwirkt, die für die PtsG-Bindung benötigt werden.

4.1.2 Der Widerspruch: Mlc-Dimere in der Kristallstruktur und Tetramer