Die Mlc-Varianten und ihr Einfluss auf die Mlc regulierten Gene

Die für die Bindetests verwendeten Mlc-Varianten, MlcWT, Mlc∆9, Mlc∆18 und zudem Mlc110 wurden bezüglich ihrer Fähigkeit die Mlc-regulierten Gene zu repremieren getestet.

Getestet wurde der Einfluss auf eine transkriptionelle malT- und eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion. Mlc∆9 repremierte die Transkription der Reportergenfusionen vergleichbar zu MlcWT. Mlc∆18 und Mlc110 haben ihre Funktion als Repressor komplett eingebüst und zeigten keinerlei Repression der Reportergenfusionen. Eine Mlc-Variante mit einem Aminosäureaustausch im HTH-Motiv zeigte die Charakteristika des MlcWT, während der Austausch von Aminosäuren in einem potentiellen Zink-Bindemotiv (Mlc_AYA und Mlc_SYS) zu einem Mlc mit stark eingeschränkter Repressorfunktion führte.

Die Expression von plamidkodiertem MlcWT und Mlc∆9 vermittelte eine starke Repression der Reportergenfusionen, bis zu 24–fach bei malT-lacZ (siehe Abb. 14) und bis zu 112-fach bei ptsG-lacZ (siehe Abb. 15). Mlc∆18 nahm keinen Einfluss auf die Transkription der Mlc-regulierten Gene. Die ß-Galaktosidaseaktivität bei Überproduktion dieser Variante entsprach der der Vektorkontrolle. Ebenfall keine Auswirkung auf die malT-lacZ Transkription hatte eine weitere Mlc-Variante, Mlc110. Eine in frame Deletion führt bei dieser Variante zum Verlust der Aminosäuren 188-191 von Mlc. Diese Mutation in Mlc entstand spontan bei Wachstum von E. coli unter Glukoselimitation im Chemostaten (103). Die Sequenz dieser Mlc-Mutante wurde amplifiziert und ebenfalls in einen Expressionsvektor kloniert. Für die C-terminal trunkierte Variante Mlc∆18 sah man nach der Reinigung des Proteins im SDS-Gel eine definierte Proteinbande, die der Größe eines Monomers entsprachen. Es waren keine Abbauprodukte zu erkennen. Im Gegensatz dazu gelang es bislang nicht Mlc110 zu reinigen, da das Protein stets schon vor dem Zellaufschluss abgebaut wurde. Die fehlende Repressorfunktion von Mlc110 lässt sich daher mit dem schnellen Abbau des Proteins erklären (Daten nicht gezeigt).

Eine kristallisierte Mlc-Variante (MlcH52) besitzt eine Mutation im HTH (Helix-turn-Helix) Motiv, einen Austausch des Arginin an Position 52 gegen Histidin (48, 139). Um zusätzliche Hinweise über die Zuverlässigkeit der Kristallstruktur zu erhalten, sollte überprüft werden, ob MlcH52 gleiche Charakteristika wie MlcWT besitzt. Im Zusammenhang mit der Kristallstruktur wurde eine Metallbindestelle identifiziert. Durch diese wird ein Zinkion gebunden. Das Motiv CYC (Cystein-Tyrosin-Cystein) befindet sich an Position 257 – 259

und wurde einmal verändert zu AYA (Alanin-Tyrosin-Alanin) oder zu SYS (Serin-Tyrosin-Serin). Wie zuvor wurden die Auswirkungen auf die Transkription einer ptsG-lacZ-Fusion gemessen. MlcH52 repremierte die Expression von ptsG-lacZ in vergleichbarer Weise wie MlcWT. Im Vergleich zur Vektorkontrolle war die ß-Galaktosidaseaktivität bei MlcWT und MlcH52 um 96-360 fach reduziert. Beide Varianten mit Mutation im Metallbindemotiv, Mlc_AYA und Mlc_SYS, bewirkten dagegen nur noch eine stark eingeschränkte Repression um den Faktor 2,7-2,9 (siehe Abb. 16).

Abb. 14: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆∆∆∆9, Mlc∆∆∆∆18 und Mlc110 auf die malT-lacZ Expression.

Stamm ET104, der eine Mutation in mlc, cyaA, crp* und eine transkriptionelle malT-lacZ-Fusion besitzt, wurde mit den Plasmiden pSL104 (MlcWT), pmlc410 (Mlc∆9), pmlc401 (Mlc∆18), pmlc110 (Mlc110) und zur Kontrolle mit dem Vektor pGDR11 transformiert. Die crp*-Mutation hat die Expression eines CAP-Proteins zur Folge, das unabhängig von cAMP aktiv ist. So kann der Effekt der Mlc-Überproduktion auf malT-lacZ ohne Beeinflussung durch die Katabolitenrepression gemessen werden. Die Zellen waren in Minimalmedium mit 1%

CAA gewachsen und je eine Hälfte der Ansätze wurde mit 50 µM IPTG induziert (schwarze Balken). Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.

Abb. 15: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆∆∆∆9 und Mlc∆∆∆∆18 auf die ptsG-lacZ Expression.

Stamm JM-G2, der eine Mutation in mlc und eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion besitzt, wurde mit den Plasmiden pSL104 (Mlc WT), pmlc410 (Mlc ∆9 AS), pmlc401 (Mlc ∆18 AS) und zur Kontrolle mit dem Vektor pGDR11 transformiert. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit 1% CAA inkubiert und je eine Hälfte der Ansätze wurde mit 50 µM IPTG induziert (schwarze Balken). Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.

Abb. 16: Auswirkung von MlcWT, MlcH52, Mlc_AYA und Mlc_SYS auf die ptsG-lacZ Expression.

Stamm JM-G2, der eine Mutation in mlc und eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion besitzt, wurde mit den Plasmiden pmlc_wt, pmlc_H52, pmlc_AYA, pmlc_SYS und zur Kontrolle mit dem Vektor pQE60 transformiert. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit 1% CAA inkubiert. Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen.

Bei der Aufnahme von externer Glukose ist PtsG überwiegend dephophoryliert (siehe Kap.

1.3 und 1.4). Ergänzend zu den Bindetests sollte gezeigt werden, in wie weit die Bindung der Mlc-Varianten an das durch Glukosetransport dephosphoryliertes PtsG zu einer Derepression der Mlc regulierten Gene führt. Geringe Mengen der plasmidkodierten Mlc-Varianten werden auch ohne zusätzliche Induktion durch IPTG expremiert (siehe Abb. 14 und 15). Um die Derepression der Reportergenfusion bei Wachstum auf Glukose zu untersuchen, wurde die mlc-Transkription nicht mit IPTG induziert um die Mlc Mengen niedrig zu halten und es damit zu ermöglichen, dass Mlc komplett von der DNA abgezogen und an PtsG gebunden wurde. Bei den Zellen, die MlcWT oder Mlc∆9 exprimierten, zeigte sich eine etwa 2,2 - 2,6 fach höhere ß-Galaktosidaseaktivität, wenn die Zellen auf Glukose gewachsen waren. Ansätze von Zellen mit Mlc∆18 haben eine vergleichbare ß-Galaktosidaseaktivität wie jene von Zellen, die mit Vektor ohne Insert transformiert waren. Wobei zu bemerken ist, dass auch bei der Vektorkontrolle die ß-Galaktosidaseaktivität der auf Glukose gewachsenen Zellen um 1,5 fach erhöht ist. Diese ist aber bei Mlc WT oder Mlc ∆9 AS mit 2,2 –2,6 fach stärker erhöht.

Zellen, die MlcWT oder Mlc∆9 exprimierten, bewirkten die Repression der Mlc abhängigen malT-lacZ Fusion, welche durch Wachstum auf Glukose derepremiert wurde (siehe Abb. 17).

Das Messen der ß-Galaktosidaseaktivität nach Wachstum auf Glukose gab einen Hinweis darauf, dass Varianten mit Mutation im Metallbindemotiv vermutlich nicht mehr oder nur noch eingeschränkt an PtsG gebunden werden, da die verbleibende Repression nicht weiter aufgehoben wird. Ein deutlicheres Ergebnis könnte in diesem Fall ein in vitro Bindetest zu PtsG liefern. Im Gegensatz dazu führt die durch Glukose herbeigeführte Derepression von MlcWT und MlcH52 zu einer um 15-30 fach erhöhten ß-Galaktosidaseaktivität (siehe Abb.

18).

Abb. 17: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der malT-lacZ Expression.

Stamm ET104, transformiert mit den Plasmiden pSL104 (MlcWT), pmlc410 (Mlc∆9), pmlc401 (Mlc∆18) und dem Vektor pGDR11 wurde auf Minimalmedium mit 1% CAA (graue Balken) und mit 0,5% CAA + 0,2%

Glukose (schwarze Balken) angezogen. Die Expression von mlc wurde nicht zusätzlich durch IPTG induziert.

Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen.

Abb. 18: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der ptsG-lacZ Expression.

Stamm JM-G2, transformiert mit den Plasmiden pmlc_wt, pmlc_H52, pmlc_AYA, pmlc_SYS und pQE60 wurde auf Minimalmedium mit 1% CAA (graue Balken) und mit 0,5% CAA + 0,2% Glukose (schwarze Balken) angezogen. Die Expression von mlc wurde nicht zusätzlich durch IPTG induziert. Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen.