3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON LEWIS-RATTEN
3.1.12 Statistische Auswertung
Die statistische Aufarbeitung der histopathologischen Befunde und Nachweise der residenter Gehirnzellen, der semiquantitativen Auswertung der morphologischen Nachweise der BDV-Antigene (3.1.6) und BDV-RNAs (3.1.8) erfolgte mittels des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999). Mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests wurden die Veränderungen über die Zeit global analysiert. Anschließend wurde als nicht parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon-Zwei-Stichproben-Test zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt. Ergebnisse mit p≤0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Die statistische Analyse der Ergebnisse der quantitativen morphologischen Auswertung der Proteine BDV-N und BDV-GP sowie deren korresondierenden RNAs im Ammonshorn (3.1.6.4, 3.1.8.5) wurde freundlicherweise von Dr. Failing, Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen mit dem Statistikprogrammpaket BMDP/Dynamic, Release 7.0 (DIXON, 1993) durchgeführt.
Die statistische Analyse basierte auf der durchschnittlichen Anzahl positiver Zellen pro mm2. Die Beschreibung der Daten aus IH und ISH erfolgte anhand des Programms BMDP1D. Zur statistischen Prüfung des Gruppeneinflusses wurde beim Gruppenvergleich der vier verschiedenen dpi-Gruppen je nach Verteilungstyp der gemessenen Variablen die einfaktorielle Varianzanalyse (Test bei annähernder Normalverteilung; Programm BMDP7D) oder der Kruskal-Wallis-Test (nicht parametrischer Test; Programm BMDP3S) verwendet.
Der zusätzliche Vergleich verschiedener Zellkompartimente wurde mittels einer zweifaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Expression
MATERIAL UND METHODEN 64
von BDV-N und BDV-GP und ihrer korrespondierenden RNAs“ mit dem Programm BMDP2V durchgeführt. Wies der globale Vergleich signifikante Unterschiede zwischen den Kompartimenten auf, so wurde zwischen jeweils zwei Variablen bei vergleichsbezogenem Signifikanzniveau paarweise verglichen. Die Signifikanz wurde hier durch eine α-Adjustierung nach Bonferoni angeglichen. Bei der Bewertung der Signifikanzen wurde das Signifikanzniveau α = 0,05 zugrunde gelegt, d.h. Ergebnisse mit p≤ 0,05 galten als statistisch signifikant.
Die Auswertung der Quantifizierungsdaten der BDV-spezifischen +ssRNAs erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Zur Aufarbeitung der erhobenen Messwerte (Gehirnschnitt, Gehirnareale und Einzelzellen) wurde das Programm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., USA) verwendet. Nach einem Kolmogorov-Smirnov-Test zur Prüfung auf Normalverteilung wurde der Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Gehirnanschnitte, Gehirnareale und Einzelzellen) bzw. der Effekt der jeweiligen Gehirnregion/Zellpopulation (Gehirnareale und Einzelzellen) auf das quantitative Vorkommen BDV-spezifischer +ssRNAs getestet. Der Einfluss des Zeitpunkts p.i. auf die Menge der im Gehirnschnitt nachgewiesenen BDV- +ssRNAs wurde durch einfaktorielle Varianzanalyse mit dem Ryan-Einot-Gabriel-Welsch-Multiple-Range (REGWQ)-Test für unabhängige Werte bestimmt. Der Einfluss des Zeitpunkts p.i. und der jeweiligen Gehirnregion bzw. des Zelltyps auf die Menge BDV-spezifischer Transkripte wurde mit einer zweifaktoriellen Varianzanalyse für gemischte Modelle mit REGWQ-Test untersucht. Prinzipielle quantitative Unterschiede der einzelnen +ssRNAs zwischen beiden Gehirnregionen wurden mit einem t-Test für abhängige Werte überprüft.
Der Tukey’s post-hoc-Test für multiple paarweise Vergleiche wurde für alle Daten verwendet, um die Kopienzahlen: a) aller BDV +ssRNAs innerhalb eines Zeitpunkts, b) der gleichen BDV +ssRNAs zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. und c) der gleichen BDV +ssRNA eines Zeitpunkts p.i. in verschiedenen Regionen/Zellpopulationen zu untersuchen.
Der Bewertung wurde ein Signifikanzniveau von α=0,05 zugrunde gelegt und Ergebnisse mit einem Wert von p<0,05 wurden als statistisch signifikant bewertet.
MATERIAL UND METHODEN 65 3.2 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON TNF-TRANSGENEN MÄUSEN
3.2.1 VERSUCHSTIERE UND TIERHALTUNG
Die Ausgangszuchtpaare der TNF-transgenen (tg) und nicht transgenen (ntg) Mäuse mit C57Bl/6 x BDF-Hintergrund wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Eisel, Institut für Molekulare Neurobiologie, Rijksuniversiteit Groningen, Niederlande, überlassen. Die weitere Nachzucht erfolgte im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
In den transgenen Tieren wird das murine TNF unter der Kontrolle der NR2B-Untereinheit des NMDA-Glutamatrezeptors exprimiert (Abb. 8), die zu einer selektiven TNF-Überexpression in Ammonshorn, Cortex cerebri, Thalamus und Striatum führt (MARCHETTI et al., 2004). Die ntg Mäuse stammten aus der Verpaarung von heterozygot transgenen (tg+/-) Tieren oder aus Einkreuzung von C57Bl/6-Wildtyp- (wt) Mäusen in tg Mäuse.
Abb. 8: Schema des NR2B-Promotor-TNF-Konstruktes
Die Exons der Promotorregion sind als weiße Boxen 1-3 angegeben. Die translatierten Exons des murinen TNF-cDNA-Fragmentes sind als schwarze Boxen dargestellt. Am 3’- Ende befindet sich zur Stabilisierung die 3’ untranslatierte Region des humanen β-Globulins.
Kontrolltiere, BDV- und mock-infizierte Mäuse wurden unter standardisierten Bedingungen im Tierstall des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in einem individuell belüfteten Käfigsystem (Tecniplast Deutschland, Hohenpeißenberg) gehalten. In jedem Käfig befand sich zusätzlich ein Mouse House (Tecniplast). Die Zuchttiere wurden in einem Zuchtstall im Überdrucksystem gehalten, während BDV- und mock-infizierte Tiere im Infektionsstall im Unterdrucksystem gehalten wurden (10.1). In beiden Räumen erfolgte die Beleuchtung durch Neonröhren in einem Tag-Nachtrhythmus von 12 Stunden.
Die Raumtemperatur betrug 20-24 °C, die relative Luftfeuchte 50-60 %. Als Einstreu wurde Sägemehl (ssniff bedding ¾ Faser, ssniff, Soest) verwendet. Während der ersten 21 Lebenstage wurde energetisch hochwertiges pelletiertes Futter (ssniff M-Z, Ereich, 15 mm energiereich) angeboten, nach dem Absetzten wurde auf energieärmeres Futter umgestellt (ssniff R/M-Haltung, 10 mm). Wasser und Futter standen ad libitum zur Verfügung.
Alle Arbeiten an den Versuchstieren erfolgten mit Einweghandschuhen unter einer Laminar flow (HeraSafe Heraeus, Kendro Laboratory Products, Hanau). Zur Desinfektion der Werkbank und als Zwischendesinfektion aller Materialien, die mit den Tieren in Kontakt kamen, wurde 1%iges Venno Vet 1 super (Menno Chemie) für 2 h bei Raumtemperatur
NR2B TNF ß - Globulin
2
500bp
Promoter und 5’UTR 3 ’ UTR
3 1
-
2
500bp 3 ’ UTR
3
1
MATERIAL UND METHODEN 66
verwendet, danach wurde die Werkbank für 2 h mit UV-Licht bestrahlt. Die Käfige wurden wöchentlich bei 123 °C und 1,15 bar für 20 Minuten autoklaviert.
3.2.1.1 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels real time PCR
Die DNA zur Analyse des transgenen Status wurde aus Mäuseschwänzen mittels E.N.Z.A.® Tissue DNA Mini Kit (Peqlab, Erlangen) isoliert. Zur Ermittlung des transgenen Status der Tiere wurde das Comparative Quantification Protocol des Mx 4000 Multiplex Quantitative PCR Systems (Stratagene) mit SYBR®-Green (Stratagene) als Farbstoff gewählt. DNA eines im Herkunftsbestand homozygot getesteten Tieres diente als Kalibrator, das housekeeping-Gen Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) fungierte als normalizer. Als weitere Normalisierung diente der passive Referenz-Farbstoff ROX. Je ein definiertes Tier der drei Mausgruppen (homozygot [tg+/+], heterozygot [tg+/-], nicht transgen [ntg]) wurde in jedem Lauf als Kontrolle mitgeführt. Alle Proben wurden in einem Doppelansatz gemessen.
Tiere mit einer relativen Quantität (dRN) von 0,0 wurden als nicht transgen, eine dRN von 0,3 – 0,7 galt als heterozygot und eine dRN größer oder gleich 0,8 als homozygot transgen.
Das Prinzip der comparative quantification basiert darauf, dass die Differenz des Schwellenwertes (threshold Cycle, Ct) des interessierenden Gen (gene of interest, GOI, hier TNF) und des Ct eines normalizer (hier Housekeeping-Gen GAPDH) gebildet wird (∆Ct; Abb.
10). Dies wird für die unbekannten Proben und für den Kalibrator durchgeführt. Danach wird für jede Probe die Differenz des berechneten ∆Ct mit dem ∆Ct des Kalibrators gebildet (∆∆Ct). Unter der Vorraussetzung, dass die Effizienz der PCR für GOI und den normalizer, die Menge des GOI und des normalizers in den Proben annährend gleich sind, und unter der Annahme, dass die Effizienz gegen 2 geht, d.h. dass sich die Amplifikatmenge bei jedem Lauf verdoppelt, berechnet sich die relative Quantität als 2-∆∆Ct (Abb. 9).
Abb. 9: Berechnung der relativen Quantität eines Genes Ct GOI - Ct norm = ∆Ct
∆Ct Probe - ∆Ct Kalibrator = ∆∆Ct Relative Quantität = 2-∆∆Ct
Ct: Schwellenwert (threshold cycle); GOI: gene of interest (TNF);
norm: normalizer (GAPDH); Kalibrator: Sicher homozygotes Tier
Die Amplifikation der jeweiligen cDNA erfolgte mittels Brilliant® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene) und SYBR®-Green (Stratagene) als Farbstoff in einem Reaktionsansatz von 25 µl mit 1 x Core PCR buffer, 2,5 mM MgCl2, 800 µM dNTPs, 8% Glycerol, 3% DMSO; 0,5 x SYBR®-Green I, 30 nM ROX Referenzfarbstoff, 0.65 U SureStart® Taq DNA Polymerase, je 150 nm Primer (Tab. 13) und 1 µl Maus-DNA. TNF und der Kalibrator wurden unter der gleichen Reaktions- und Temperaturbedingungen inkubiert.
MATERIAL UND METHODEN 67 Tab. 13: Primer zur Analyse des transgenen Status der Mäuse
Gen
Die real time PCR wurde wie folgt durchgeführt: Denaturierung, Aktivierung der SureStart® Taq bei 95 °C für 10 Minuten, 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, annealing bei 55 °C für 1 Minute, Elongation bei 72°C für 30 Sekunden, danach 41 Zyklen zur Erstellung der Schmelzkurve bei 55 °C ↑ für 30 Sekunden. Dazu wurde mit jedem Zyklus die Temperatur um 0,5 °C erhöht. Anhand der Schmelzkurve konnte die Spezifität der Primerbindung überprüft werden. Eine spezifische Schmelzkurve war Vorraussetzung für die Auswertung der real time PCR-Analyse.
3.2.2 VIRUSPRÄPARATION
Die mausadaptierte BDV-Präparation wurde freundlicherweise von Herrn Prof. Staeheli, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abt. Virologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, überlassen und für weitere Versuche entsprechend vermehrt und passagiert. Die Bestimmung des Virustiter durch Frau Dr. Herzog, Institut für Virologie der Justus-Liebig-Universität Gießen ergab einen Titer von 6 x 105 ID50/ml. Direkt vor der Infektion wurde die Virussuspension in BHK-21 Medium 1:10 verdünnt.
3.2.3 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG
Die Mäuse wurden entsprechend ihrem transgenem Status in die drei Gruppen ntg, tg+/ und tg+/+ eingeordnet. Die Tierversuche wurden gemäß den Bestimmungen für genehmigungspflichtige Tierversuche durchgeführt (AZ 509.6-42502-03/679).
3.2.3.1 Infektion der Versuchstiere und Kontrollen
Transgene und nicht transgene Mäuse der drei Gruppen (n=5 pro Zeitpunkt p.i.) wurden innerhalb des ersten Lebenstages i.c. mit einer Hamilton-Spritze (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) in den linken Cortex cerebri mit ca. 10 µl der 10 %igen BDV-infizierten Gehirnsuspension infiziert. Als Kontrolle wurden Tiere gleichermassen mit einer Suspension aus Gehirnmaterial nicht infizierter adulter Mäuse inokuliert (Mock-Infektion; n=2 pro Zeitpunkt p.i.) sowie nicht infizierte gleichalte Mäuse (n=4 pro Zeitpunkt p.i.) verwendet.
MATERIAL UND METHODEN 68
3.2.3.2 Klinik, Versuchsablauf und Übersicht der durchgeführten Untersuchungen Die Tiere wurden einmal wöchentlich klinisch untersucht. Beurteilt wurden Aktivität, Bewegung auf dem Käfiggitter und Plexiglas, Hängtest, Lauf auf einem in der Luft schwebendem Hamsterlaufrad, Provokationsproben, Greif- und Flexorreflex, Aufrichtungsreaktion, Tischkantenprobe, Balancierfähigkeit sowie Fellzustand und Haltung.
Weiterhin wurden die Tiere nach dem Score von HAUSMANN et al. (2001) bewertet (Tab.
14). Die statistische Auswertung der klinischen Daten findet sich unter 3.2.11.
Tab. 14: Bewertung der klinischen Symptome nach HAUSMANN et al. (2001) Score Symptome
0 keine Symptome 1 geringgradige Ataxie
2 deutliche Ataxie, Torticollis, raues Fell oder aufgekrümmter Rücken,
Anheben am Schwanz: charakteristische Hinterbeinhaltung (Beine vor dem Bauch verschränkt)
3 Gewichtsverlust, schwere Ataxie und Torticollis, Parese, Apathie, moribunder Zustand Tragende Zuchtmäuse wurden geburtsnah zweimal täglich kontrolliert und neugeborene Tiere innerhalb der ersten 24 Lebensstunden in den Infektionsstall verbracht und i.c. infiziert.
Aus den drei Gruppen wurden pro Untersuchungszeitraum je 5 Tiere BDV-infiziert und 2 Tiere mock-infiziert. Alle Tiere wurden mit 21 Tagen von den Müttern abgesetzt, nach Geschlechtern getrennt, per Ohrloch markiert und auf ihren transgenen Status getestet (3.2.1.1). Tötung und Blutentnahme fanden zwischen 7 und 49 Tagen p.i. in tiefer Injektionsnarkose (Trapanal®, Thiopental-Natrium) mit nachfolgender Dekapitation statt. Die Blutentnahme erfolgte aus den Schwanzgefäßen mit Hilfe einer Mikrovette (Sarstedt, Nümbrecht). Die zu den jeweiligen Tagen p.i. durchgeführten Untersuchungen finden sich in Tab. 15.
MATERIAL UND METHODEN 69 Tab. 15: Durchgeführte Untersuchungen an BDV-infizierten Mäusen und Kontrolltieren
dpi Histologie IH ISH DM Real time
dpi: days post infection, Tag nach Infektion; HE: Hämatoxylin-Eosin-Färbung; LFB-KV: Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung; IH: Immunhistologie; ISH: In-situ-Hybridisierung; DM:
Doppelmarkierung; real time RT-PCR: real time reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion;
BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-M: BDV-Matrixprotein; BDV-LE:
leader-haltige +ssRNA; +ssRNA: positiv orientierte RNA; RNAs: positiv und negativ orientierte RNA;
GFAP: glial fibrillary acidic protein; Mac-1α: CD11b-Antigen; NFқB: Nukleärer Faktor қB; ADNP:
activity-dependent neuroprotective protein; BDNF: brain derived neurotrophic factor; CNPase: 2’,3’-cyclic nucleotide-3’-Phosphodiesterase; TNF: Tumor-Nekrose-Faktor-α; TNFR: TNF-Rezeptor; NR2B:
NR2B-Rezeptoruntereinheit des NMDA Rezeptors; IIFT: Indirekte Immunfluoreszenz
MATERIAL UND METHODEN 70
3.2.4 PROBENENTNAHME, PRÄPARATION DER ORGANE UND UNTERSUCHTE GEHIRNREGIONEN
Die Gehirne wurden direkt nach der Tötung entnommen, sagittal in zwei Hälften geteilt und die linke Hälfte wurde in 10%igem, nicht gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur fixiert. Die formalinfixierten Gehirnhälften wurden auf Höhe der Ebenen A, B und C transversal geschnitten (Tab. 16; Abb. 10), gemäß 3.1.4 in Paraffin eingebettet und 3-4 µm dicke Serienschnitte hergestellt und für die histologischen und immunhistologischen Untersuchungen sowie für die ISH verwendet (3.2.5, 3.2.6, 3.2.8). Die rechte Hälfte wurde transversal in Ebene B (II, III) und C (IV) geschnitten und die Gehirnscheiben jeweils in OCT gemäß 3.1.4 eingebettet (Tab. 16; Abb. 10). Diese Proben dienten der Herstellung von 5 µm dicken Gefrierschnitten für die Immunhistologie und der RNA-Isolierung für die real time RT-PCR und dem Nachweis von infektiösem Virus (3.2.6, 3.2.9, 3.2.10).
3.2.4.1 Untersuchte Gehirnregionen
Die Schnittebenen A-C bzw. II bis IV entsprachen weitgehend den Ebenen nach PAXINOS und FRANKLIN (2001; Tab. 16).
Tab. 16: Schnittebenen nach PAXINOS und FRANKLIN (2001)
Ebene FFPE Bregma Interaural Ebene OCT Name OCT
A 1,34 mm 5,14 mm
Brost -2,18 mm 1,62 mm II AH rostral,
Striatum
Bcaud -2,18 mm 1,62 mm III AH caudal
C -5,88 mm -2,08 mm IV Cerebellum
Ebene FFPE: Ebenen der Coronarschnitte für formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe;
Bregma: Schnittpunkt der Sagittalnaht des Schädels mit dem Mittelpunkt der Coronarnaht; Interaural:
Linie zwischen beiden äußeren Öffnungen der knöchernen Gehörgänge; Ebene OCT: Ebenen der Anschnitte der in OCT eingebetteten Gehirnhälften; Brost: Anschnittfläche nach rostral; Bcaud: Anschnittfläche nach caudal, AH: Ammonshorn
Abbildung 10: Schematische Darstellung der verwendeten Schnittebenen
Ebene A-C, II und III: verwendete Schnittebenen (Tab. 16); Balken: 1 mm; Kreuz: Bregmapunkt. Aus:
Neurogenetics at UT Health Science Center©1999 RW Williams, Design A.G. Williams, Atlas T. Capra
A B
II,III
C IV
MATERIAL UND METHODEN 71 Folgende Gehirngebiete und -strukturen wurden in die morphologischen Untersuchungen einbezogen, sofern sie anhand der Gewebeschnitte eindeutig ansprechbar waren:
1. Neocortex 2. Corpus callosum
3. Ammonshorn, unterteilt in CA1-, CA2-, CA3-Region, Gyrus dentatus (DG) 4. Striatum, Nucleus caudatus/Putamen
5. Thalamus 6. Hypothalamus 7. Cerebellum
8. Medulla oblongata 9. Ependym
10. Leptomeninx
3.2.5 HISTOPATHOLOGISCHE PRÄPARATION
Die etwa 4 µm dicken Gehirnschnitte wurden HE gefärbt. Die HE-Färbung der Paraffinschnitte erfolgte automatisiert in einem Färbecenter Leica ST 4040 (Leica Mikrosystems, Nussloch) nach einem standardisierten Laborprotokoll. Die histologische Untersuchung diente, wie auch bei den BDV-infizierten Ratten, dem Nachweis der Entzündungszellinfiltration und der Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten sowie der Bewertung der degenerativen Veränderungen. Die Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-Färbung (LFB-KV, Markscheidenfärbung nach Klüver und Barrera) wurde wie bei ROMEIS (1989) beschrieben durchgeführt und zur Darstellung eventueller Demyelinisierungen oder neuronaler Degenerationen verwendet.
3.2.5.1 Auswertung
Die Auswertung der histopathologischen Veränderungen im Gehirn erfolgte semiquantitativ gemäß 3.1.5.1 aber mit einem eigens für BDV-infizierte Mäuse entwickeltem Schema:
0 = keine Veränderungen
1 = vereinzelte Infiltrate (maximal vier), wenige Gehirngebiete betroffen, perivaskulär maximal eine Schicht von Entzündungszellen, ≤5 aktivierte Mikroglia das Entzündungszellinfiltrat umgebend
2 = sieben oder mehr Infiltrate, verschiedene Gehirnregionen betroffen, perivaskulär überwiegend ein bis zwei Zellschichten, ≤20 aktivierte Mikroglia das Entzündungszellinfiltrat umgebend; oder wenige entzündliche Herde (max. vier) mit zwei bis drei Zelllagen von Entzündungszellen
3 = in vielen Gehirnregionen perivaskuläre Entzündungszellinfiltrate mit drei und mehr Zelllagen und parenchymaler Infiltration in der Umgebung der perivaskulären Infiltrate, deutliche Mikrogliaaktivierung mit ≥20 Stäbchen das Entzündungszellinfiltrat umgebend
MATERIAL UND METHODEN 72
Da die Entzündungsreaktion bei den BDV-infizierten Mäusen zwar prinzipiell den gleichen Charakter aufwies, aber im Vergleich zur BDV-Infizierten Lewis-Ratte Unterschiede in der Stärke der mononukleären Infiltration und der Mikrogliaaktivierung bestanden, wurde für das Mausmodell der zuvor angegebene Score entwickelt und angewendet. Zur Auswertung der Mikrogliaaktivierung wurde jeweils ein, das Zentrum eines Entzündungszellinfiltrat beinhaltendes, Gesichtsfeld in der 400fachen Vergrößerung ausgezählt und aus den einzelnen Werten eines Tieres und anschließend für die Infektionsgruppe ein arithmetischer Mittelwert gebildet.
Weitere degenerative Veränderungen wurden semiquantitativ wie folgt bewertet:
0 = keine Veränderungen
1 = geringgradige neuronale Nekrosen oder geringgradiger Hydrocephalus internus 2 = mittelgradige neuronale Nekrosen oder mittelgradiger Hydrocephalus internus 3 = hochgradige neuronale Nekrosen oder hochgradiger Hydrocephalus
Die statistische Aufarbeitung findet sich unter 3.2.11. Die Auswertung der LFB-KV-Färbung erfolgte qualtitativ in Hinlick auf deutliche erkennbare Aufhellung der dunkelblauen Anfärbung des Myelins.
3.2.6 IMMUNHISTOLOGIE (IH)
Die Immunhistologie diente wie unter 3.1.6 angegeben dem Nachweis der BDV-spezifischen Proteine, der Beurteilung der Astrogliose, der Mikrogliaaktivierung und der Charakterisierung neuroprotektiver Vorgänge und wurde mit den folgenden Modifikationen durchgeführt.
Ad 2. Primärantikörper
Die Verdünnung der anti-BDV-Antikörper erfolgte in phosphate buffered saline (PBS) mit Zusatz von 1% bovinem Serumalbumin (BSA) bei Verwendung des Anti-BDV-N Antikörpers Bo18. Bei Einsatz dieses Antikörpers wurde Ziegenserum als Blockserum verwendet. Da die weiteren verwendeten Primärantikörper entweder in anderen Verdünnungsstufen oder andere Vorbehandlungen notwendig waren als unter 3.1.6 beschrieben, findet sich eine entsprechende Auflistung in Tabelle 17.
Ad 3. Kontrollseren
Als Kontrollserum für die monoklonalen Antikörper diente Aszites nicht immunisierter Balb/c-Mäuse (ABgene®).
Ad 4. Sekundäre Antiseren
Bei Verwendung monoklonaler Antikörper aus der Ratte (Tab. 17) wurde ein biotiniliertes Kaninchen-anti-Ratte Antiserum (IgG, Vector Laboratories) verwendet.
Ad 5. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)
Es wurde das ABC-Kit Peroxidase Elite Standard PK-6100 (Vector Laboratories) verwendet.
MATERIAL UND METHODEN 73 Tab. 17: Verwendetes Gewebe, Spezifität und Verdünnungen der primären Antikörper
Primärantikörper Klonalität und PBS: phosphate buffered saline; SS: Schweineserum; ZS: Ziegenserum; BSA: Bovines Serumalbumin; DMa: Doppelmarkierung zum Nachweis der BDV-RNAs in Astrozyten bzw Oligodendrozyten (3.1.8.3); GFAP: glial fibrillary acidic protein; CNPase: 2’,3’-cyclic nucleotide-3’-Phosphodiesterase; *: Um diesen monoklonalen Antikörper auf Mausgewebe einsetzen zu können, wurde das Dako Cytomation Animal Research Kit (ARKTM) Peroxidase angewendet, das auf einer initialen In-vitro-Bindung von Erst- und Zweitantikörper beruht, um unspezifische Bindungen des gegen die Maus gerichteten Zweitantikörpers zu verhindern; Mac-1 alpha: Anti-CD11b; ADNP:
activity-dependent neuroprotective protein; BDNF: brain derived neurotrophic factor; NFкB: Nukleärer Faktor кB; FFPE: formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe; OCT-GG: OCT-eingebettetes Gehirngewebe
3.2.6.1 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Methode
Der Nachweis der BDV-spezifischen Antigene sowie der residenten Gehirnzellen erfolgte wie unter 3.1.6.1 beschrieben. Die Darstellung der Mac-1α-positiven Makrophagen/Mikroglia Entzündungszellen an OCT-GG wurde gemäß WÜNSCHMANN et al. (1999) durchgeführt.
Die Antikörperkomplexe wurden mittels des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Kit Peroxidase Elite Standard PK-6100, Vector Laboratories) und DAB detektiert.
3.2.6.2 Immunhistologische Kontrollen
Die Spezifität der Reaktionen wurde gemäß 3.1.6.3 mit zusätzlichen Kontrollen überprüft:
1. Zum Nachweis der BDV-Antigene wurden BDV-infizierte Mäusegehirne, bei denen bereits Virusproteine detektiert wurden mit dem entsprechenden Anti-BDV-Antikörper inkubiert.
2. Als Kontrolle der Makrophagen/Mikrogliamarkierung diente die Milz eines Kontrolltieres.
3.2.6.3 Auswertung
Die Auswertung der immunhistologischen Färbungen erfolgte wie unter 3.1.6.4 angegeben mit den angegebenen, an die Anzahl der bei der Maus immunhistologisch positiven Zellen adaptierten Auswertungsschemata. Die immunhistologischen Nachweise wurden nach der Bestimmung der geschätzten Zahl positiver Zellen/Gesichtsfeld für die unter 3.2.4.1 genannten Gehirnlokalisationen bewertet.
MATERIAL UND METHODEN 74
Der BDV-Antigennachweis wurde bei 100facher und 400facher Vergrößerung bewertet:
0 = keine Reaktion
1 = in Herden <80 positive Zellen/Gesichtsfeld bei 400facher Vergrößerung, positive Zellen in einzelnen Gehirngebieten, andere Areale positive Einzelzellen, keine Neuropilreaktion
2 = <150 positive Zellen bei 400facher Vergrößerung, deutliche Neuropilreaktion, viele bis alle Gehirnregionen betroffen
3 = zahlreiche positive Zellen (>150 Zellen/400facher Vergrößerung), ausgeprägte Neuropilreaktion, alle untersuchten Gehirngebiete betroffen
Das Vorhandensein einer Astrogliose wurde anhand der typischen Morphologie aktivierter Astrozyten sowie der vermehrten Anzahl GFAP-positiver Astrozyten bei 100 und 400facher Vergrößerung wie folgt bewertet:
1 = <30 positive Zellen bei 400facher Vergrößerung, positive Reaktion v.a. in Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum
2 = 30-60 positive Zellen bei 400facher Vergrößerung, einige Astrozytenkerne deutlich vergrößert
3 = >60 positive Zellen bei 400facher Vergrößerung, einige Astrozytenkerne deutlich vergrößert
Bei der Auswertung der GFAP-Reaktivität wurden die nicht infizierten ntg Kontrolltiere des jeweiligen Infektionstages als Nullwert definiert. Zusätzlich wurde der Kerndurchmessser von etwa 100 GFAP-positiven Zellen jeweils in Cortex cerebri, Striatum, Ammonshorn und Cerebellum mittels des Programms AxioVison LE Rel 4.3 (Carl Zeiss Vision) ermittelt.
Der Nachweis von ADNP und NFкB p50 erfolgte bei 100facher und 400fachen Vergrößerung nach folgendem Schema:
1 = <15 positive Zellen/400facher Vergrößerung 2 = 15-30 positive Zellen/400facher Vergrößerung 3 = >30 positive Zellen /400facher Vergrößerung
Als p50-positive Zellen wurden nur Zellen mit einer Translokalisation des p50 in den Zellkern angesehen. Die Zahl p50-positiver Zellen wurde für Cortex cerebri, Striatum, Ammonshorn und Cerebellum bestimmt. Die Bewertung des BDNF-Nachweises erfolgte qualitativ in Hinblick auf exprimierende Zelltypen und intrazelluläre Lokalisation in den entsprechenden Gehirnarealen (3.2.4.1). MAC1α-positive Zellen wurden in Ergänzung zur histologischen Auswertung qualitativ bewertet.
Die statistische Auswertung findet sich unter 3.2.11.
MATERIAL UND METHODEN 75 3.2.7 HERSTELLUNG VON cDNA-KLONEN
Zur Herstellung des Mengenstandards für die real time RT-PCR (3.2.9) wurden die unter 3.1.7 hergestellten BDV- und zellspezifischen cDNA Klone verwendet. Zur Erzeugung der
Zur Herstellung des Mengenstandards für die real time RT-PCR (3.2.9) wurden die unter 3.1.7 hergestellten BDV- und zellspezifischen cDNA Klone verwendet. Zur Erzeugung der