BDV-Intron II +ssRNA (BDV-GP-N +ssRNA)

Bezüglich der regionalen Ausbreitung war BDV-GP-N +ssRNA 14, 28 und 42 Tage p.i. im gesamten Gehirn ohne Gruppenunterschiede zu finden. Nur die ntg Tiere zeigten eine signifikante Zunahme positiver Zellen bis 42 Tage p.i., nicht aber die tg Mäuse (p=0,0319;

Abb. 30). 28 Tage p.i. waren bei den ntg und tg+/- Tieren statistisch auffällig mehr Zellen positiv als bei den tg+/+ Mäusen (p=0,06). 42 Tage p.i. lagen signifikant mehr positive Zellen bei den ntg als bei den tg Mäusen vor (p=0,0302).

4.2.5.3 Nachweis korrespondierender Genomabschnitte

Als generelles Reaktionsschema fand sich die BDV genRNA in Kernen von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. 14 Tage p.i. waren häufiger punktförmige Kernreaktionen, ab 28 Tagen p.i. vermehrt diffuse Kernsignale zu finden. Im Gegensatz zur Lewis-Ratte waren keine Faser- oder Zytoplasmareaktionen zu erkennen.

Hinsichtlich der regionalen Ausbreitung war die genRNA war in allen Gruppen zu allen Zeitpunkten p.i. im gesamten Gehirn zu finden (Abb. 30c). Bei den ntg BDV-infizierten Tieren nahmen die positiven Zellen signifikant bis 42 Tage p.i. zu (p=0,0319); nicht aber bei den tg Gruppen. 28 Tage p.i. waren bei den ntg und +/- Tieren statistisch auffällig mehr Zellen positiv als bei den tg+/+ Mäusen (p=0,0600). 42 Tage p.i. waren bei den ntg Tieren signifikant mehr Zellen positiv als bei den tg Gruppen (p≤0,0457).

ERGEBNISSE 120

Abb. 30a: Nachweis der BDV-N +ssRNA und BDV-GP-N +ssRNA mittels ISH

Abb. 30b: Nachweis der BDV +ssRNAs mittels ISH 28 Tage p.i.

Abb. 30c: Nachweis der BDV-Genomabschnitte mittels ISH

x-Achse: a, c: dpi: days post infection, b: Tiergruppen; y-Achse: Ausmaß des RNA-Nachweises; BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP-BDV-N: N-terminaler Anteil der BDV-GP; genRNA: Genomische RNA;

+ssRNA: Positiv orientierte RNA; ntg: Nicht transgene Mäuse; tg+/-: Heterozygot transgene Mäuse;

tg+/+: Homozygot transgene Mäuse; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken: Minimaler/Maximaler Wert; p=0,0319: signifikante Zunahme RNA-haltiger Zellen bei ntg Tieren über die Zeit

0

ERGEBNISSE 121 4.2.6 REAL TIME RT-PCR ZUM NACHWEIS DER BDV +ssRNAS AUS

GEHIRNANSCHNITTEN

Die real time RT-PCR wurde zur Quantifizierung der BDV +ssRNAs durchgeführt und stellte somit eine wichtige Ergänzung der morphologischen Nachweise dar. Daten zur Menge subgenomischer RNAs in TNF-transgenen Tieren lagen bis dato nicht vor, obwohl bereits bekannt ist, dass TNF an der Viruselimination beteiligt sein kann. Die BDV +ssRNAs wurden 21 und 42 Tage p.i. aus Gehirnmaterial der Ebene III (3.2.4) aller drei Mausgruppen bestimmt.

Zusammenfassend waren die jeweiligen Transkriptmengen zwischen den Gruppen nicht signifikant unterschiedlich, wobei die Kopienzahlen der BDV-GP-N +ssRNA und BDV-Intron I +ssRNA niedriger als die der BDV-N +ssRNA waren. Die Werte der BDV-N +ssRNA stiegen nur bei den tg+/- Tieren an und blieben bei den ntg und tg+/+ Mäusen etwa konstant. Die Menge der BDV-GP-N +ssRNA fiel jedoch signifikant zwischen 21 zu 42 Tagen p.i. in allen Gruppen ab, die Kopien der BDV-Intron-I +ssRNA blieben an beiden Zeitpunkten in den Gruppen vergleichbar. BDV-LE +ssRNA stieg nur in den tg Gruppen deutlich bis 42 Tage p.i. an, nicht aber bei den ntg Mäusen. Bei allen drei Kohorten waren 21 und 42 Tage p.i. die BDV-N +ssRNA-Mengen signifikant am höchsten (Abb. 31; p≤0,0148) und die der BDV-LE +ssRNA signifikant am geringsten (p≤0,0001). Bei allen Mäusen war 21 und 42 Tage p.i.

mehr BDV-Intron I +ssRNA als BDV-GP-N +ssRNA messbar (tg+/- 42 Tage p.i. p=0,0005).

Detaillierte Darstellung der Quantifizierung der BDV +ssRNAs aus Gehirnanschnitten Die BDV-N +ssRNA-Kopienzahlen lagen in allen Gruppen bei etwa 10⁷. Bei tg+/- Tieren stiegen die Werte zwischen 21 und 42 Tagen p.i. an, bei ntg und tg+/+ Mäusen blieben sie nahezu konstant (Abb. 31). Bei ntg Tieren lagen 21 Tage p.i. 1,73 x 10⁷ und 42 Tage p.i.

1,60 x 10⁷ Kopien, bei den tg+/- und tg+/+ Mäusen 21 Tage p.i. 1,01 x 10⁷ bzw. 1,94 x 10⁷ und 42 Tage p.i. 1,83 x 10⁷ bzw. 1,46 x 10⁷ Kopien vor.

Für BDV-GP-N +ssRNA waren etwa 10⁵ Kopien sowie 21 Tage p.i. signifikant höhere Werte als 42 Tage p.i. (p=0,0300; Abb. 31) messbar. Bei ntg Mäusen fielen die Werte von 4,86 x 10⁵ Kopien (21 Tage p.i.) auf 3,03 x 10⁵ (42 Tage p.i.) Kopien, bei tg Tieren von 6,11 x 10⁵ Kopien (tg+/-) bzw. 3,76 x 10⁵ Kopien (tg+/+) am Tag 21 p.i. auf 2,16 x 10⁵ Kopien (tg+/-) bzw. 2,41 x 10⁵ Kopien (tg+/+) am Tag 42 p.i.

BDV-Intron I +ssRNA war in etwa 10⁵ Kopien ohne signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten messbar (Abb. 31). Bei ntg Tieren lagen 21 Tage p.i. 7,08 x 10⁵ und 42 Tage p.i.

6,34 x 10⁵ Kopien vor, bei den tg Tieren waren 21 Tage p.i. 9,22 x 10⁵ (tg+/-) bzw. 5,97 x 10⁵ Kopien (tg+/+) und 42 Tage p.i. 9,50 x 10⁵ (tg+/-) bzw. 5,62 x 10⁵ Kopien (tg+/+) vorhanden.

Für BDV-LE +ssRNA waren in allen Gruppen 21 und 42 Tage p.i. nur geringe Kopien (10¹ bis 10²; Abb. 31), messbar, wobei die BDV-LE +ssRNA bei allen statistisch auffällig (p=0,0821) zunahm. Bei den ntg Mäusen war der Anstieg geringgradig (1,11 x 10² 21 Tage

ERGEBNISSE 122

p.i.; 1,49 x 10² Kopien 42 Tage p.i.), bei den tg+/- und tg+/+ Tieren deutlich (21 Tage p.i. 61 bzw. 56 Kopien; 42 Tage p.i. 2,5 x 10² bzw. 1,9 x 10² Kopien).

Abb. 31a: Nachweis der BDV +ssRNAs bei ntg BDV-infizierten Mäusen

Abb. 31b: Nachweis der BDV +ssRNAs bei tg+/- BDV-infizierten Mäusen

Abb. 31c: Nachweis der BDV +ssRNAs bei tg+/+ BDV-infizierten Mäusen

x-Achse: dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl, logarithmische Skalierung; BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP-BDV-N: BDV-Glykoprotein, N-terminaler Abschnitt; BDV-Intron I: Intron I des BDV; BDV-LE: leader-haltige RNA; arithmetische Mittelwerte; : signifikant höhere BDV-N-Kopienzahlen als alle weiteren (p<0,05); : signifikant geringere BDV-LE-Kopienzahlen als alle weiteren (p<0,05); : signifikant höhere BDV-Intron I-Kopienzahlen als die der BDV-GP-N +ssRNA

Kopienzahl (normalisiert) Kopienzahl (normalisiert) Kopienzahl (normalisiert)

ERGEBNISSE 123 4.2.7 REAL TIME RT-PCR ZUM NACHWEIS DER mRNA VON TNF UND

TNF-REZEPTOREN AUS GEHIRNANSCHNITTEN UND DEFINIERTEN GEHIRNREGIONEN

Die real time RT-PCR diente dem Nachweis der basalen TNF-mRNA-Mengen in den nicht infizierten transgenen und nicht transgenen Tieren und der Bestimmung der TNF-mRNA-Werte nach BDV-Infektion in allen Gruppen. Detaillierte TNF-mRNA-TNF-mRNA-Werte der transgenen Tiere lagen bislang noch nicht vor, obwohl es wichtig war, zu untersuchen, ob die vermuteten Unterschiede im TNF-Expressionslevel zwischen heterozygot und homozygot transgenen Mäusen auch tatsächlich vorlagen. Erwartet wurde weiterhin eine Aufregulation der TNF-mRNA-Mengen nach BDV-Infektion, wobei insbesondere von Interesse war, auch zu ermitteln, inwieweit die transgene TNF-mRNA durch die Infektion und die entzündlichen Veränderungen weiter aufreguliert wird oder das transgene TNF endogenes TNF induziert.

Ergänzend wurde die mRNA der TNF-Rezeptoren-1 (TNFR1) und -2 (TNFR2) bestimmt, um Aussagen zur Rezeptorverfügbarkeit zu erhalten. Die mRNA-Mengen wurden jeweils aus Gehirnmaterial der Ebene II (3.2.4) 21 und 42 Tage p.i. und aus den Gehirnregionen (Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum, Cerebellum) am Tag 42 p.i. bestimmt.

Zusammenfassend konnte, wie erwartet, die transgene TNF (TNFtg)-mRNA nur bei tg Tieren amplifiziert werden (Abb. 32, 33). Weiterhin waren zwischen den tg+/- und tg+/+

Tieren, sowie zwischen den Gehirnregionen mit hoher TNFtg-Expression (Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum) und mit geringer TNFtg-Expression (Cerebellum) signifikante Unterschiede zu ermitteln. Nach BDV-Infektion kam es überraschenderweise in keiner Gruppe zu einem signifikanten Anstieg der TNFtg-mRNA.

Zur Bestimmung der Menge der Gesamt-TNF (TNFto)-mRNA wurden die Primerpaare so gewählt, dass sowohl die tg als auch die endogene TNF-mRNA gemessen wurde. Bei beiden tg Gruppen lagen in den Gehirnanschnitten und den Gehirnregionen signifikant höhere TNFto-mRNA-Kopienzahlen als bei den ntg Mäusen vor, sowohl in den nicht infizierten als auch den BDV-infizierten Gruppen (Abb. 34, 35). Nach BDV-Infektion waren nur bei den ntg Tieren höhere TNFto-mRNA-Mengen in den Gehirnanschnitten und den Gehirnregionen als bei den nicht infizierten ntg Tieren zu messen. Die BDV-Infektion führte bei den tg Tieren überraschenderweise zu keiner signifikanten Erhöhung der TNFto-mRNA-Werte im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten tg Tieren. Im Cerebellum waren die TNFto-mRNA-Mengen bei den tg Tieren signifikant geringer als in den TNFtg-exprimierenden Gehirnregionen.

Bei allen Tieren war eine konstitutive TNFR1-mRNA-Expression in den Gehirnanschnitten und in den Gehirnregionen messbar (Abb. 36, 37). Nach BDV-Infektion kam es in den Gehirnanschnitten bei den tg Tieren 21 und 42 Tage p.i. zu signifikant höheren TNFR1-mRNA-Werten im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Tieren. Nach BDV-Infektion

ERGEBNISSE 124

war zudem bei den tg Mäusen eine signifikante Aufregulation der TNFR1-mRNA in den Gehirnregionen mit TNF-Überexpression zu erkennen. Bei den BDV-infizierten ntg Tiere waren die Werte in Ammonshorn und Cerebellum signifikant höher als bei den nicht infizierten Mäusen.

Bei allen Tieren fand sich eine konstitutive TNFR2-mRNA-Expression sowohl in den Gehirnanschnitten als auch in den Gehirnregionen (Abb. 38, 39). Nach BDV-Infektion kam es im den Gehirnanschnitten 21 Tage p.i. bei den ntg und tg+/+ Tieren, am Tag 42 p.i. in allen Gruppen zu einem signifikanten Anstieg der TNFR2-Kopienzahlen. 42 Tage p.i. waren die TNFR2-mRNA-Werte bei tg+/+ Tieren signifikant höher als bei den ntg und tg+/- Mäusen.

Nach BDV-Infektion stiegen bei allen Gruppen in fast allen Gehirnregionen die TNFR2-mRNA-Kopienzahlen signifikant an, verglichen mit den nicht infizierten Tieren. Bei den tg nicht infizierten und BDV-infizierten Mäusen lagen signifikant höhere Werte in den Gehirnregionen mit TNFtg-Überexpression als im Cerebellum vor. Die detaillierte Darstellung der Quantifizierung der TNFtg-, TNFto-, TNFR1- und TNFR2-mRNA-Mengen findet sich unter 4.2.7.1-4.2.7.4

4.2.7.1 Transgene TNF (TNFtg)-mRNA

Die Mittelwerte der Kopienzahlen aus den Gehirnanschnitten lagen bei den tg+/- Mäusen zwischen 2,159 x 10³ – 3,445 x 10³ Kopien, bei den tg+/+ Tieren zwischen 3,866 x 10³ – 6,5 x 10³ Kopien. Die mittleren Kopienzahlen in den Gehirnregionen schwankten bei den tg+/- Mäusen zwischen 4,22 x 10² und 8,26 x 10² Kopien, bei den tg+/+ Tieren zwischen 5,84 x 10² und 8,89 x 10². Im Cerebellum waren bei den tg Mäusen die Werte generell geringer als in den übrigen Gehirnarealen (3-42 Kopien).

21 Tage p.i. lagen in den Gehirnanschnitten signifikant höhere Werte der TNFtg-mRNA bei tg+/+ Mäusen bei den nicht infizierten (p=0,0031) und bei den BDV-infizierten Tieren (p<0,0001) als bei den tg+/- Tieren vor (Abb. 32). 42 Tage p.i. waren bei den tg+/- und tg+/+

Tieren die TNFtg-mRNA-Werte bei den BDV-infizierten und den nicht infizierten tg Tieren nicht signifikant unterschiedlich, wobei die TNFtg-mRNA-Kopienzahlen bei den tg+/+

Mäusen jedoch höher waren als bei tg+/- Tieren. Allerdings ergaben sich im Gesamtvergleich bei den tg+/+ Mäusen signifikant höhere Werte der TNFtg-mRNA in den Gehirnanschnitten als bei den tg+/- Tieren (p<0,0001). Der Gesamtvergleich der TNFtg-mRNA-Menge zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten Tieren ergab sowohl bei den tg+/- als auch bei den tg+/+ Mäusen überraschenderweise keine signifikanten Unterschiede.

Die Kopienzahlen der TNFtg-mRNA in den Gehirnregionen waren bei den nicht infizierten tg+/- und tg+/+ Mäusen in Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum signifikant höher als im Cerebellum (p≤0,0294; Abb. 33). Bei den BDV-infizierten Tieren lag kein signifikanter Unterschied zu der jeweiligen nicht infizierten Gruppe in den Gehirnregionen vor.

ERGEBNISSE 125 Abb. 32: Nachweis von TNFtg-mRNA in Gehirnanschnitten

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; arithmetischer Mittelwert;

Fehlerbalken: Standardabweichung; **: p<0,01: signifikant höhere TNFtg-Kopienzahlen bei tg+/+ als bei tg+/- nicht infizierten Tieren, 21 Tage p.i.; ***: p<0,001: signifikant höhere TNFtg-Kopienzahlen bei tg+/+ als bei tg+/- BDV-infizierten Tieren, 21 Tage p.i.

Abb. 33: Nachweis von TNFtg-mRNA in definierten Gehirnarealen

x-Achse: Mausgruppen; dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; geometrischer Mittelwert;

Fehlerbalken: Streufaktor; **: p<0,01: Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum bei tg+/- nicht infizierten bzw. BDV-infizierten Mäusen; *: p<0,05: Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum bei tg+/+ nicht infizierten Mäusen; **: p<0,01:

Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum bei tg+/+ BDV-infizierten Mäusen

4.2.7.2 Gesamt TNF (TNFto)-mRNA

Die ntg nicht infizierten Mäuse wiesen in den Gehirnanschnitten und Gehirnregionen fast keine TNFto-mRNA-Expression auf (0-2,5 Kopien), bei den ntg BDV-infizierten Mäusen waren 32 bis 39 Kopien in den Gehirnanschnitten messbar. Bei den nicht infizierten und BDV-infizierten tg+/- Mäusen waren Werte von 3,068 x 10³ bis 7,085 x 10³ Kopien und bei den tg+/+ Tieren von 6,840 x 10³ bis 9,199 x 10³ Kopien in den Gehirnanschnitten nachweisbar. In den Gehirnregionen lagen die Werte bei den ntg BDV-infizierten Tieren bei 5 bis 49 Kopien, bei den tg nicht infizierten und BDV-infizierten Tieren bei 9,39 x 10² bis 3,508 x 10³ Kopien in Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum; im Cerebellum bei 51 bis 88 Kopien.

ERGEBNISSE

Nicht infiziert BDV-infiziert Nicht infiziert BDV-infiziert

21 dpi 42 dpi Vergleich der nicht infizierten als auch der BDV-infizierten Kohorten (alle p<0,0001; Abb. 34).

Nach BDV-Infektion stiegen nur bei den ntg Tieren die Werte signifikant an (p≤0,0012). Die TNFto-mRNA-Mengen nahmen in Cortex cerebri, Striatum und Ammonshorn bei den tg Tieren signifikant mehr zu als im Cerebellum und in allen Gehirnregionen signifikant mehr als bei den ntg Tieren (p<0,0001; Abb. 35), sowohl bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten tg Mäusen. Nach BDV-Infektion stiegen die Werte bei den tg Mäusen in allen Gehirnarealen unerwartet nicht signifikant an, sondern nur bei den ntg Tieren (p<0,0001).

Abb. 34: Nachweis von TNFto-mRNA in Gehirnanschnitten

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; geometrischer Mittelwert; Fehlerbalken: Streufaktor; **: p<0,01, ***: p<0,001: Vergleich zwischen ntg nicht infizierten und ntg BDV-infizierten Tieren, 21 Tage bzw. 42 Tage p.i.

Abb. 35: Nachweis von TNFto-mRNA in definierten Gehirnarealen

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; geometrischer Mittelwert;

Fehlerbalken: Streufaktor; ***: p<0,001: Vergleich zwischen ntg nicht infizierten und ntg BDV-infizierten Tieren; ***: p<0,001: Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum bei tg+/- nicht infizierten bzw. BDV-infizierten Tieren; ***. p<0,001: Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum bei tg+/+ nicht infizierten bzw. BDV-infizierten Tieren

ERGEBNISSE 127

0 2000 4000 6000 8000

ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+

Nicht infiziert BDV-infiziert Nicht infiziert BDV-infiziert

21 dpi 42 dpi

Kopienzahl (normalisiert)

4.2.7.3 TNF-Rezeptor-1 (TNFR1)-mRNA

In den Gehirnanschnitten lagen bei den nicht infizierten Gruppen von 1,015 x 10³ Kopien bis 1,319 x 10³ Kopien, bei den BDV-infizierten Tieren zwischen 1,686 x 10³ Kopien und 5,442 x 10³ Kopien vor. In den Gehirnarealen waren 79 bis 2,22 x 10² Kopien bei den nicht infizierten Tieren und 1,75 x 10² bis 7,59 x 10² Kopien bei den BDV-infizierten Mäusen messbar.

In den Gehirnanschnitten waren 21 Tage p.i. bei den tg BDV-infizierten Mäusen die Werte signifikant höher (p≤0,0265; Abb. 36) und 42 Tage p.i. bei allen BDV-infizierten Gruppen im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Tieren (p≤0,0004). Nach BDV-Infektion waren die Kopienzahlen 21 Tage p.i. bei den tg+/+ Tieren signifikant höher als bei den ntg Mäusen (p=0,0075). Die ntg BDV-infizierten Tieren zeigten einen signifikanten Anstieg zwischen 21 und 42 Tagen p.i. (p=0,0165). Nach BDV-Infektion waren die TNFR1-Werte in den Gehirnregionen verglichen mit den jeweiligen nicht infizierten Tieren bei den ntg Tieren im Ammonshorn und Cerebellum (p≤0,0391), bei den tg+/- und tg+/+ Mäusen in Cortex cerebri (p≤0,0086), Ammonshorn (p≤0,0019) und Striatum (p≤0,0431; Abb. 37) signifikant höher.

Abb. 36: Nachweis von TNFR1-mRNA in den Gehirnanschnitten

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; geometrischer Mittelwert; Fehlerbalken: Streufaktor; *: p<0,05: Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten tg+/- Tieren 21 Tage p.i.; ***: p<0,001: Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten tg+/+ Tieren 21 Tage p.i.; ***: p<0,001: Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten Tieren 42 Tage p.i.

ERGEBNISSE 128

0 200 400 600 800 1000 1200

ntg tg +/- tg +/+ ntg tg +/- tg +/+

Nicht infiziert BDV-infiziert

Kopienzahl (normalisiert)

Cortex cerebri Ammonshorn Striatum Cerebellum Abb. 37: Nachweis von TNFR1-mRNA in definierten Gehirnarealen

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; geometrischer Mittelwert; Fehlerbalken: Streufaktor; *: p<0,05: Vergleich zwischen Ammonshorn ntg nicht infizierter und ntg BDV-infizierter Tiere; *** p<0,001: Vergleich zwischen Cerebellum ntg nicht infizierter und ntg BDV-infizierter Tiere; *^-***: p<0,05 - p<0,001: Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum tg+/- nicht infizierter und tg+/- BDV-infizierter Tiere; *** p<0,001: Vergleich zwischen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum tg+/+ nicht infizierter und tg+/+ BDV-infizierter Tiere

4.2.7.4 TNF-Rezeptor-2 (TNFR2)-mRNA

Die konstitutive TNFR2-mRNA Expression lag zwischen 39 und 2,47 x 10² Kopien, nach BDV-Infektion waren zwischen 1,25 x 10² und 1,811 x 10³ Kopien messbar. In den Gehirnanschnitten ergaben sich 21 Tage p.i. signifikant höhere TNFR2-mRNA-Werte bei den BDV-infiziertenTieren bei den ntg Mäusen (p=0,0175) und tg+/+ Mäusen (p=0,0374) und am Tag 42 p.i. bei allen Gruppen (p≤0,0054; Abb. 38) jeweils im Vergleich zu den nicht infizierten Tieren. Bei den BDV-infizierten Gruppen ergaben sich 42 Tage p.i. signifikant höhere Werte bei den tg+/+ Tieren als bei den ntg (p=0,0001) und tg+/- Mäusen (p=0,0052).

Bei den tg+/+ BDV-infizierten Tieren war der Anstieg vom 21. zum 42.Tag p.i. signifikant (p=0,0002).

Nach BDV-Infektion kam es bei allen Gruppen in allen Gehirnregionen (außer ntg, Ammonshorn, p=0,0515) zu signifikant höheren TNFR2-mRNA-Werten als bei den jeweiligen nicht infizierten Tieren (p≤0,0493; Abb. 39). Bei den nicht infizierten und BDV-infizierten tg Mäusen waren die TNFR2-mRNA-Kopienzahlen in Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum signifikant höher als im Cerebellum (p≤0,0062). Die Werte bei den tg BDV-infizierten Tieren waren im Vergleich zu den ntg BDV-BDV-infizierten Mäusen in Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum signifikant höher (p≤0,0396).

ERGEBNISSE 129

0 400 800 1200 1600 2000

ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+

Nicht infiziert BDV-infiziert Nicht infiziert BDV-infiziert

21 dpi 42 dpi

Kopienzahl (normalisiert)

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

ntg tg +/- tg +/+ ntg tg +/- tg +/+

Nicht infiziert BDV-infiziert

Kopienzahl (normalisiert)

Cortex cerebri Ammonshorn Striatum Cerebellum Abb. 38: Nachweis von TNFR2-mRNA in Gehirnanschnitten

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl; ntg: Nicht transgen; tg+/-: Heterozygot transgen; tg+/+: Homozygot transgen; geometrischer Mittelwert; Fehlerbalken: Streufaktor; *: p<0,05: Vergleich zwischen ntg bzw. tg+/+ nicht infizierten und ntg bzw. tg+/+ BDV-infizierten Tieren 21 Tage p.i.; **: p<0,01: Vergleich zwischen ntg bzw. tg+/- nicht infizierten und jeweiligen ntg bzw. tg+/- BDV-infizierten Tieren 42 Tage p.i.; ***: p<0,001: Vergleich zwischen tg+/+ nicht infizierten und tg+/+ BDV-infizierten Tieren 42 Tage p.i.

Abb. 39: Nachweis von TNFR2-mRNA in definierten Gehirnarealen

x-Achse: Mausgruppen, dpi, days post infection; y-Achse: Normalisierte Kopienzahl, ntg: Nicht transgen, tg+/-: Heterozygot transgen, tg+/+: Homozygot transgen, geometrischer Mittelwert, Fehlerbalken: Streufaktor; *: p<0,05: Vergleich zwischen Cortex cerebri bei ntg nicht infizierten und ntg BDV-infizierten Tieren; *: p<0,05: Vergleich zwischen Striatum bei ntg nicht infizierten und ntg BDV-infizierten Tiere; ***: p<0,001: Vergleich zwischen Cerebellum bei ntg nicht infizierten und ntg BDV-infizierten Tieren; *^-***: p<0,05-p<0,001: Vergleich zwischen den Gehirnregionen bei tg+/- nicht infizierten und tg+/- BDV-infizierten Tieren;

**^-***: p<0,01-p<0,001: Vergleich zwischen den Gehirnregionen bei tg+/+ nicht infizierten und tg+/+ BDV-infizierten Tieren

ERGEBNISSE 130

4.2.8 REAL TIME RT-PCR ZUM NACHWEIS DER BDNF-mRNA, NR2B-REZEPTOR-mRNA UND PRODYNORPHIN-NR2B-REZEPTOR-mRNA

Zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen BDV-Infektion und BDNF wurde neben der immunhistologischen Darstellung der BDNF-Expression (4.2.3.3) auch die entsprechende mRNA quantifiziert. Die mRNA des NR2B-Rezeptors wurde bestimmt, da die Expression des transgenen TNF unter dem Promotor des NR2B-Rezeptors steht und überprüft werden sollte, ob durch das Transgenkonstrukt und/oder die BDV-Infektion eine Beeinflussung der Rezeptorexpression vorliegt. Prodynorphin-mRNA wurde als initialer Parameter möglicher Interaktionen von TNF und der BDV-Infektion mit Neuropeptiden untersucht, da nach BDV-Infektion adulter Ratten Krämpfe und eine verminderte Expression von Dynorphin im Ammonshorn beschrieben sind.

Zusammenfassend lag eine konstitutive BDNF-mRNA-Expression bei allen Tieren in Gehirnanschnitten und Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum (Abb. 40) vor, ohne signifikante Gruppenunterschiede in den Gehirnanschnitten. Bei den BDV-infizierten tg Tieren waren die BDNF-mRNA-Werte im Ammonshorn signifikant höher im Vergleich zu den tg nicht infizierten Tieren, den ntg BDV-infizierten Tieren und den anderen Gehirnregionen der tg BDV-infizierten Mäuse (Abb. 40).

Bei allen Tieren der NR2B-Rezeptor-mRNA in den Gehirnanschnitten und den Gehirnregionen (Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum, Cerebellum; Abb. 41) konstitutiv exprimiert. Zusammenfassend ergab sich kein Einfluß des Transgenstatus oder der BDV-Infektion auf die NR2B-Rezeptor-mRNA-Expression. Es lagen jedoch signifikant geringere mRNA-Werte im Cerebellum im Vergleich zu den anderen Gehirnregionen in allen Gruppen sowohl bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten Tieren vor. Dies entspricht dem Verteilungsmuster des NR2B-Rezeptors im Mausgehirn.

Bei allen Tieren fand sich eine konstitutive Expression der Prodynorphin-mRNA 42 Tage p.i. in Cortex cerebri und Ammonshorn (Abb. 42), die in der jeweiligen Tiergruppe in beiden Gehirnarealen vergleichbar war. Bei den nicht infizierten Tieren waren die Werte der tg Tiere höher als die der ntg Tiere. Nach BDV-Infektion war bei den tg Tieren ein signifikanter Abfall

Bei allen Tieren fand sich eine konstitutive Expression der Prodynorphin-mRNA 42 Tage p.i. in Cortex cerebri und Ammonshorn (Abb. 42), die in der jeweiligen Tiergruppe in beiden Gehirnarealen vergleichbar war. Bei den nicht infizierten Tieren waren die Werte der tg Tiere höher als die der ntg Tiere. Nach BDV-Infektion war bei den tg Tieren ein signifikanter Abfall

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