Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Primer zur initialen Amplifikation von BDV +ssRNA und zellulärer +ssRNA wurden mit dem Programm Primer3 input (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) ermittelt (Tab. 4). Die Primerlyophilisate (MWG Biotech, Ebersberg) wurden mit DEPC-Aqua bidest.

auf eine Konzentration von 15 µM eingestellt und bei -20 °C gelagert. Die Amplifikation der in 3.1.7.3 hergestellten cDNA oder der bereits vorhandenen Plasmid-DNA erfolgte in einem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik) unter Verwendung des GeneAmp^® PCR Core Kit (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Weiterstadt). Je 3 µl cDNA-Matrize wurden in einem 50 µl-PCR-Ansatz mit 1,25 mM MgCl2, 200 µM dNTP-Mix (Invitrogen), je 300 nM Primer und 1,25 U AmpliTaq^® DNA Polymerase eingesetzt. Bei Verwendung des Plasmides BDV-GP wurden 1 µl der Verdünnungen 1:10², 1:10³ und 1:10⁴ eingesetzt.

Als Matrize für BDV-N diente das Plasmid „BDV-N", als Matrizen für BDV-Intron II (BDV-GP-N, BDV-GP-C) das Plasmid „BDV-GP“ sowie die cDNA der BDV-infizierten Lewis-Ratte.

Da die BDV-GP-spezifische Sequenz des für den zur Infektion verwendeten Virusstock noch nicht bekannt war, wurden beide Ansätze gewählt. Als Matrize für BDV-Intron I (BDV-M, Intron I NEU), BDV-LE und BDV-S1 wurde cDNA der BDV-infizierten Lewis-Ratte, für Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A (SDHA),

Hypoxanthin-Phosphoribosyl-MATERIAL UND METHODEN 46

Transferase I (HPRT) und Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) die cDNA des Kontrolltieres verwendet. Als Negativkontrollen (no template control, NTC) diente ein PCR-Ansatz, der nur DEPC-Aqua bidest. enthielt.

Der PCR-Ansatz wurde bei folgendem Temperaturprogramm mit einem annealing bei 59,9

°C, außer für die Primerpaare p151/152 und 153/154 (annealing 55 °C) inkubiert: Initiale Denaturierung bei 94 °C für 1 Minute, 40 Zyklen; Denaturierung: 94 °C für 1 Minute; Primer-Anlagerung: 59,5 °C/55 °C für 1 Minute; Elongation: 72 °C für 1 Minute; Finale Elongation: 72

°C für 20 Minuten; Kühlung: 4 °C bis zur Entnahme der Proben. Zur Überprüfung der korrekten Amplifikation wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch aufgetrennt (10.2.5).

DNA-Banden der Amplifikate mit korrekter Größe wurden mit dem NucleoSpin^® Extract II-Kit (Macherey-Nagel, Düren) aufgereinigt.

Tab. 4: Verwendete Primer zur Herstellung von cDNA-Klonen

Name ID Sequenzen (5’ → 3’ Orientierung) Amplk Acc-No.

Basenpaare; Acc-No: GenBank^®-Accession-Nummer; Pos.: Position in der veröffentlichten Sequenz;

BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-M: BDV-Matrixprotein; BDV-LE:

leader-haltige +ssRNA; SDHA: Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A; HPRT:

Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I; GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

MATERIAL UND METHODEN 47 3.1.7.5 Klonierungsreaktion

Die Klonierung spezifischer PCR-Produkte erfolgte mittels des TOPO TA Cloning^® Kit for Sequencing mit dem pCR.4^®-TOPO-Sequenzierungsvektor (Invitrogen; GRÖTERS, et al.

2005; WERNER-KEIŠS, et al., 2008) und Plasmidvermehrung in One Shot TOP10 Chemically Competent-E.coli-Bakterien (Invitrogen). Pro PCR-Produkt wurden Ligationsansätze mit 1-4 µl des PCR-Produktes, 1 µl Salzlösung, 1 µl pCR.4^®-TOPO-Vektor (Invitrogen) und bis zu 3 µl sterilem Aqua dest. angesetzt. Die chemische Transformation der One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli (Invitrogen) erfolgte mit 2 µl des ligierten Plasmides. Pro Ansatz wurden je 30 µl und 100 µl der Bakteriensuspension auf Lauria-Bertani-Agarböden (10.2.2) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C im Wärmeschrank inkubiert. Von deutlich erkennbaren Einzelkolonien wurden insgesamt sechs Flüssigkulturen in 4 ml-Lauria-Bertani-Medium (10.2.2) angeimpft und über Nacht bei 37 °C im Schüttler (200 rpm) inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde mit dem das NucleoBond^® PC 20-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gewonnen. Nach Bakterienlyse und Aufreinigung der Plasmid-DNA erfolgte eine DNA-Präzipitation mit 0,8 Volumen eisgekühltem Isopropanol und Waschen des Plasmid-Pellets mit 70%igem Ethanol. Das Plasmid-Pellet wurde mit 25 bis 35 µl DEPC-Aqua bidest. resuspendiert und bei -80 °C asserviert. Von jeder angesetzten Flüssigkultur wurde ein Glycerolstock angelegt.

3.1.7.6 Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA

Der Einbau des PCR-Produktes in das Plasmid wurde durch eine Restriktionsspaltung mit EcoR I (Roche Diagnostics, Mannheim) überprüft. 0,2–0,5 µg Plasmid-DNA wurden mit 20 U EcoR I und 2 µl spezifischem Puffer vermischt, ad 20 µl mit DEPC-Aqua bidest. aufgefüllt und 90 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wurde durch 3 µl loading dye (ABgene^®) abgestoppt und das Gemisch wurde zur Überprüfung der korrekten DNA-Größe (Amplifikatgröße [Tab. 4] + 17 bp Vektoranteil) gelelektrophoretisch aufgetrennt.

3.1.7.7 Sequenzierung und weitere Verwendung der cDNA-Klone

Die Plasmidinserts wurden bei Sequence Laboratories, Göttingen sequenziert. Die Sequenzen der cDNA Klone spezifisch für BDV-N, BDV-Intron II (BDV-GP-N, BDV-GP-C), BDV-M und Intron I wurden mit dem BDV-Stamm H24 (BDV-rat-4p), ehemals als RW98 bezeichnet (GenBank^® Acc.-No. AF158629-AF158633, PLANZ et al., 2003b; DÜRRWALD et al., 2006) mittels GenBank^®: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ verglichen und die Orientierung im Vektor bestimmt (Tab. 5, 6). Die Sequenzierungen der cDNA Klone spezifisch für BDV-LE (BDV-LE, BDV-S1 391) wurden mit dem BDV-Stamm He80 (GenBank^® Acc.-No. AJ311522, PLESCHKA et al., 2001) verglichen. Die Homologien lagen zwischen 99-100%, nur für den cDNA Klon BDV-S1 391 bei 97% und für den Klon BDV-N bei 95% (Tab. 5).

Die Plasmide III von BDV-N, BDV-GP-N und BDV-GP-C, Plasmid V Intron I-NEU sowie BDV-GP-N* und BDV-GP-C* dienten zur Herstellung von DIG-markierten RNA Sonden

MATERIAL UND METHODEN 48

(3.1.8.1). Die Plasmide BDV-GP-N* und BDV-GP-C* bezeichnen die aus dem Plasmid „BDV-GP“ subklonierten cDNA Klone. Das Plasmid I BDV-M diente als Matrize für die Suche des Primerpaares p382/384 zur Konstruktion des cDNA Klons Intron I NEU (Tab. 4, 5). Alle cDNA Klone bis auf Intron I-NEU dienten als Grundlage für den jeweiligen Mengenstandard in der real time RT-PCR (3.1.10.1). Darüberhinaus wurden die Sequenzen der DNA-Inserts von Plasmid III BDV-N, BDV-GP-N, BDV-GP-C und Plasmid I BDV-M als Vorlage für die Suche von Primern und Taqman^®-Sonden für die real time RT-PCR benutzt (Tab. 11, 12).

Tab. 5: Verwendung der BDV- und zellspezifischen Plasmide Plasmid-ID Größe

M13R-M13F

Mengen-standard ISH Homologie Acc-No.

BDV-N 507 bp Plasmid III Plasmid III 95 % AF158629

BDV-M 438 bp Plasmid I 99 % AF158632

Intron I NEU 253 bp

Plasmid V-Intron

I-NEU

100 % AF158632 BDV-GP-N 480 bp Plasmid III Plasmid III 99 % AF158633 BDV-GP-C 648 bp Plasmid III Plasmid III 100 % AF158633

BDV-GP-N* 480 bp gp9/I 100 % AF158633

BDV-GP-C* 648 bp gp4/I 99 % AF158633

BDV-LE 275 bp Plasmid 385

I-B 99 % AJ311522

BDV-S1 391 500 bp Plasmid V 97 % AJ 311522

SDHA 260 bp Plasmid II 100 % AB072907

HPRT 251 bp Plasmid III 100 % X62085

GAPDH 247 bp Plasmid II 98 % NM_017008

Plasmid-ID: Bezeichnung des Plasmids; Größe M13R- M13F: Amplifikatgröße (Tab. 4 + 165bp Vektoranteil); M13R: M13 reverse Primer; M13F: M13 forward Primer; ISH: In-situ-Hybridisierung;

bp: Basenpaare; Plasmide BDV-GP-N*, BDV-GP-C* subkloniert aus Plasmid „BDV-GP“; BDV-N:

BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-LE: leader-haltige +ssRNA; SDHA:

Succinat-Dehydrogenase-Komplex Untereinheit A; HPRT: Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I; GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

MATERIAL UND METHODEN 49 3.1.8 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (ISH)

In der ISH wurden mittels Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden BDV-spezifische positiv orientierte (+ss) RNAs, vorwiegend mRNA, nachgewiesen, die für die Virusproteine, BDV-GP, BDV-M und BDV-N kodieren. Der Nachweis der BDV-Intron I bzw. BDV-Intron II +ssRNA diente der Detektion von BDV-M-mRNA bzw. von BDV-GP-mRNA. Die Detektion der N +ssRNA diente als Referenz für die virale Transkriptionseffizienz. Aus dem BDV-Intron II-Bereich wurden der für den N-terminalen Abschnitt des BDV-GP kodierende Teil sowie der für den C-terminalen Abschnitt kodierende Bereich verwendet. Der C-terminale BDV-GP-Genanteil entsprach dabei dem translatierten Peptidabschnitt der für die Herstellung des Anti-BDV-GP-Antikörpers (3.1.6.) verwendet wurde. Weiterhin wurde die jeweils komplementäre genomische negativ orientierte (-ss) RNA dargestellt.

3.1.8.1 Sondenherstellung und In-vitro-Transkription

Als Ausgangsmaterial dienten die unter 3.1.7 hergestellten cDNA Klone (Tab. 5). Die für die In-vitro-Transkription benötigten cDNA Klone (3.1.7.7) wurden vorab mit dem GeneAmp^® PCR Core Kit (Applied Biosystems) und dem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik) amplifiziert. Um PCR-Produkte herzustellen, die das spezifische Insert und Bindungsstellen für die T3- bzw. T7-RNA-Polymerase besitzen, wurden die BDV-Primer mit den Primern M13 forward (M13F) und M13 reverse (M13R, MWG Biotech) kombiniert (Tab. 6). Dies ergab eine Sondengröße von Insert-Länge + 36 Nukleotide (nt). Für einen 50 µl Reaktionsansatz wurden 0,1 ng/µl der nicht linearisierten Plasmide, 1,25 mM MgCl2, 200 µM dNTP-Mix (Invitrogen), je 150 nM Primer und 1,25 U AmpliTaq^® DNA Polymerase eingesetzt.

Tab. 6: Verwendete Plasmide für die Sondensynthese Sonde Plasmid Sonden- reverse; M13F: M13 forward; T3: T3-RNA-Polymerase; T7: T7-RNA-Polymerase; as: antisense; s:

sense; +ssRNA = positiv orientierte RNA (sense Polarität); -ssRNA: negativ orientierte RNA (antisense Polarität); *: siehe Tab. 5; BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein

MATERIAL UND METHODEN 50

Die Amplifikation wurde bei einer annealing-Temperatur von 55 °C durchgeführt (3.1.7.4).

Nach 40 PCR-Zyklen folgte eine finale Elongation bei 72 °C für 10 Minuten mit Kühlung der Amplifikate bei 4 °C. Je 10 µl des PCR-Reaktionsansatzes wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Sofern die Primerkombinationen einzelne, klar umschriebene Banden ergaben, diente der restliche Reaktionsansatz der DIG-RNA-Sondenherstellung. Die Amplifikate für wurden mit dem NucleoSpin^® Extract II-Kit (Macherey-Nagel) aufgereinigt.

Die DIG-RNA-Sonden wurden mit dem DIG-RNA Labeling Mix, 10 x conc. (Roche Diagnostics) und den DNA-abhängigen T3- bzw. T7-RNA-Polymerasen (Roche Diagnostics) synthetisiert. Für die In-vitro-Transkription wurde pro Reaktionsansatz ca. 200 ng aufgereinigte DNA aus 3.1.8.1. eingesetzt, wobei nach der Transkription ein DNase I- (20 U/Reaktion, Roche Diagnostics) Verdau für 15 Minuten bei 37 °C erfolgte. Nach RNA-Präzipitation über Nacht bei -20 °C und Waschen des RNA-Pellets mit 70%igem Ethanol wurde das Pellet mit 100 µl DEPC-Aqua bidest. resuspendiert, 40 U Ribonuklease-Inhibitor (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) zugesetzt und bei -80 °C asserviert.

3.1.8.2 Durchführung der ISH

Die ISH wurde mit den in Tabelle 7 aufgelisteten DIG-markierten RNA-Sonden durchgeführt (ZURBRIGGEN et al., 1993; GAEDKE et al., 1997; WERNER-KEIŠS et al. 2008). Nach proteolytischem Verdau, Postfixation, Acetylierung und Prähybridisierung erfolgte die Hybridisierung in einer feuchten Kammer bei 52 °C. Zur Detektion wurde ein AP-konjugierter Anti-DIG-Antikörper (Roche Diagnostics), das Substrat Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (Sigma Aldrich) und 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat, Sigma Aldrich) verwendet.

Tab. 7: Konzentrationen der einzelnen BDV-Sonden

Sonde Konzentration/100 µl HB-Mix

BDV-N s 3 µl

BDV-N as 3 µl

BDV Intron I (BDV-M) as 5 µl

BDV Intron I (BDV-M) s 5 µl, DM 7 µl BDV-Intron II (BDV-GP-N)* as 5 µl

BDV-Intron II (BDV-GP-N)* s 1 µl BDV-Intron II (BDV-GP-C)* as 5 µl**

BDV-Intron II (BDV-GP-C) as DM 4 µl BDV-Intron II (BDV-GP-C)* s 5 µl/**

BDV-GP-N*as/s, BDV-GP-C*as/s: DIG-markierte RNA Sonden subkloniert aus Plasmid „BDV-GP“, HB-Mix: Hybridisierungs-Mix; DM: Doppelmarkierung (3.1.8.3); **: BDV-GP-C-Sonden wurden 1: 2 mit DEPC-Wasser vorverdünnt

3.1.8.3 Doppelmarkierungen

Eine ISH/IH-Doppelmarkierung zum Nachweis von BDV +ssRNAs in Astrozyten und Oligodendrozyten wurde 24 und 42 Tage p.i. (n=2 pro Zeitpunkt) durchgeführt (ULRICH et

MATERIAL UND METHODEN 51 al., 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008). In diesen Zelltypen wurde +ssRNA spezifisch für BDV-N, BDV-GP (Intron II) und BDV-M (Intron I) detektiert. Genomische RNA wurde 42 Tage p.i. nachgewiesen. Zuerst wurde die ISH mittels der BDV-N as-, BDV-N s-, BDV-Intron II (BDV-GP-C) as- und BDV-Intron I (BDV-M) as-Sonde gemäß 3.1.8.2 durchgeführt. Danach erfolgte die IH zum Nachweis von GFAP in Astrozyten und CNPase in Oligodendrozyten (3.1.6.2).

Die Immunhistologie wurde wie folgt modifiziert:

1. Kontrollseren

Als Kontrollserum für die monoklonalen Antikörper wurde Aszites nicht immunisierter Balb/cJ-Mäuse (ABgene^®) verwendet (3.1.6).

2. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)

Es wurde das ABC-Kit Peroxidase Elite Standard PK-6100 (Vector Laboratories) verwendet.

3. Die Durchführung erfolgte gemäß WERNER-KEIŠS et al. (2008) anhand des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vector Laboratories) und DAB (Sigma Aldrich) als Chromogen.

3.1.8.4 Kontrollen

Die Spezifität der Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen überprüft:

1. Als Negativkontrolle wurden Folgeschnitte der BDV-infizierten Rattengehirne mit reinem Hybridisierungs-Puffer (HB-Mix) ohne Zusatz einer Sonde inkubiert.

2. Mock-infizierte und nicht infizierte Kontrollgehirne wurden mit den BDV-Sonden versetzt.

3. Um unspezifische Reaktionen durch Bindung der den insertanhängenden Sequenzen bis zur T3/T7-Bindungsstelle auszuschließen, wurden einige Schnitte mit einer staupevirusspezifischen Sonde, die den entsprechenden Plasmidanteil enthielt, inkubiert.

4. Die Gehirnschnitte der BDV-infizierten Ratten dienten in der ISH selbst als Positivkontrollen, da immunhistologisch bereits BDV-N und BDV-GP nachgewiesen wurde.

5. Für die Doppelmarkierungen wurden Folgeschnitte mit den BDV-Sonden inkubiert und in der IH lediglich mit dem Kontrollseren (Negativkontrolle der IH).

6. Für die Doppelmarkierungen wurden Folgeschnitte in der ISH mit reinem HB-Mix ohne Sondenzusatz inkubiert, in der IHC wurde das spezifische Antiserum verwendet (Negativkontrolle der ISH).

7. Für die Doppelmarkierungen wurden Folgeschnitte in der ISH mit reinem HB-Mix ohne Sondenzusatz inkubiert und in der IH mit den Kontrollseren (Doppelt-Negativkontrolle).

3.1.8.5 Auswertung

Die Auswertung der ISH-Signale erfolgte semiquantitativ gemäß dem Nachweis der BDV-Antigene (3.1.6.6). Die statistische Auswertung findet sich unter 3.1.12. Bei der Doppelmarkierung (3.1.8.3) wurden die Kolokalisation der BDV-RNAs und der zellspezifischen Marker anhand beider Farbreaktionen in einer Zelle oder einer blau-braunen Mischfarbe ermittelt. Diese Auswertung wurde qualitativ durchgeführt.

MATERIAL UND METHODEN 52

An BDV-infizierten Gehirnschnitten wurde 14, 24, 42 und 90 Tage p.i. zusätzlich eine quantitative Auswertung vorgenommen. Dazu wurden die Zellen im Ammonshorn, in denen BDV-N, BDV-Intron II (BDV-GP-N und BDV-GP-C) +ssRNA und die jeweilige genomische RNA nachgewiesen wurden, ausgezählt. Die weitere Erfassung erfolgte gemäß 3.1.6.6. Es wurden für jede eingesetzte BDV-spezifische Sonde alle positiven Zellen innerhalb des vermessenen Gebietes gezählt. Zellen am Rand des Messgrids wurden nur an zwei Seiten gezählt. Dabei wurde zwischen Zellen mit positiven Signalen im Kern, im Zytoplasma oder in beiden Zellkompartimenten unterschieden und die Gesamtzahl positiver Zellen ermittelt. Die immunhistologisch inkubierten Schnitte wurden gleichartig ausgezählt (3.1.6.6). Die weitere statistische Aufarbeitung findet sich unter 3.1.12.

3.1.9 LASER MICRODISSECTION (LM)

Das PALM^® MicroBeam System mit der zugehörigen PALM RoboSoftware, Version 1.2-0801 (EN; P.A.L.M. Microlaser Technologies, Bernried) wurde für die Isolation definierter Gehirnregionen (N.caudatus/Putamen [CPu], Ammonshorn [AH]) und Einzelzellen (Neuronen, Astrozyten) aus dem Rattengehirn verwendet (Tab. 8). Die Visualisierung erfolgte mittels des Axiovert 200 Inverse Microscope (Carl Zeiss, Oberkochem) und einer CCD-Kamera Hitachi HV-D30P (Hitachi Kokusai Electric Inc. Europe, Rodgau). Mit Hilfe des gepulsten UV-A Laserstrahls wurden die Gehirnareale bei einer Wellenlänge von 337 nm ausgeschnitten (Laser Microbeam Microdissection [LMM]) und in ein Sammelgefäß mit Lysierungspuffer transferiert. Die Gewinnung von Einzelzellen erfolgte mittels der kombinierten Schneide- und Katapultierfunktion des PALM^® MicroBeam System (Laser Microdissection and Pressure Catapulting [LMPC]). Dabei wurde das Gewebe mehrere Millimeter entgegen der Schwerkraft in ein Sammelgefäß mit Lysierungspuffer befördert. Alle Reagenzien wurden mit DEPC-Aqua bidest. angesetzt (10.2.4).

Tab. 8: Verwendete Einstellungen des PALM^® MicroBeam Systems Lasereinstellung

Laserfunktion

Energie Fokus speed

Gehirnareale (N.caudatus, Ammonshorn )

Schneiden (cut) 75 – 90%* 24-27** 100%

Positionierer ./. ./. 100%

Einzelzellen (Neurone, Astrozyten)

Schneiden (cut) 60-70%* 23-27** 1-6%*

Katapultieren (LPC) 80-83%* 27-29** 25%

Positionierer ./. ./. 30%

speed: Geschwindigkeit; *: Wert abhängig von Feuchtigkeitsgehalt des Gewebes,

**: Wert abhängig von unterschiedlicher Gewebedicke

MATERIAL UND METHODEN 53 3.1.9.1 Isolation definierter Gehirnareale, Laser Microbeam Microdissection (LMM) Die Regionen AH und CPu wurden aus OCT-eingebettetem Gefriermaterial BDV-infizierter Lewis-Ratten (OCT-GG) 14, 24, 42 und 90 Tage p.i (n=3 pro Zeitpunkt) auf Höhe der Ebenen II, III und/oder IV (3.1.4.1) gewonnen. Als Kontrolle diente OCT-GG von mock-infizierten Lewis-Ratten (14, 24, 42 und 90 Tage p.i.) und nicht infizierter Kontrolltiere (n=1 pro Zeitpunkt). Als Kontaminationsausschluss durch PEN-MembraneSlides (P.A.L.M.

Microlaser Technologies) wurde von diesen Objektträgern (n=3) die Membran gewonnen.

Die Gefrierschnitte wurden unter RNase freien Bedingungen angefertigt, HE gefärbt und wie die isolierten Membranen bei -80 °C asserviert. Zur Minimierung des RNA-Verlustes im Gehirngewebe durch die Färbung wurden fertige Lösungen und verkürzte Färbezeiten nach Angaben der PALM^® Microlaser Systems Protocols verwendet (POROMBKA et al., 2006, 2008b). Jedes PEN-MembraneSlide wurde zur Aufbewahrung und Durchführung der LMM in eine sterile Nunclone Surface Gewebekulturschale (LAT-Labor&Analyse-Technik, Garbsen) verbracht und bei -80 °C asserviert.

Pro Tier und Gehirnlokalisation wurden ca. zwei bis vier Areale mittels der Schneidefunktion (LMM) des P.A.L.M. MicroBeam Systems isoliert, dies entsprach insgesamt einer Gewebegröße von ca. 7,5 bis 36 Mio. µm². Unter visueller Kontrolle wurden in der 100fachen Vergrößerung die entsprechenden Gehirnlokalisationen mit der Freihandfunktion (freehand) eingezeichnet (Abb. 5). In der 400fachen Vergrößerung wurden mit der Schneidefunktion (cut) des gepulsten UV-A-Lasers pro Tier ca. 2 bis 4 Areale isoliert. Die isolierten Dissekate wurden in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß mit 350 µl Lysierungspuffer (buffer RLT (Qiagen) + 1%

β-Mercaptoethanol [β-ME]) überführt und in buffer RLT (Qiagen) bei -80 °C gelagert.

Abb. 5: Schematische Darstellung der mittels LMM isolierten Gehirnareale

CPu: N. caudatus/Putamen, AH: Ammonshorn, gestrichelte Linie: Schnittlinie für den Laserstrahl 3.1.9.2 Isolation von Einzelzellen

Zur Gewinnung von Neuronen und Astrozyten wurden BDV-infizierte Rattengehirne 14, 24, 42 und 90 Tage p.i. (n=3 pro Zeitpunkt) auf Höhe der Ebenen III und/oder IV (3.1.4.1) verwendet. Neurone bzw. Astrozyten wurden mittels Immunfluoreszenz (IF) dargestellt. Als

Striatum

B A

Striatum

B

B A A

CPu AH

MATERIAL UND METHODEN 54

Kontaminationsausschluss für die RNA-Isolation (3.1.10.2) durch PEN-MembraneSlides wurden von jedem Objektträger, der für die Isolation von Einzelzellen verwendet wurde, zusätzlich Membranstücke mittels LMPC (n=24) gewonnen. Zusätzlich wurde von nativen PENMembraneSlides (n=3) die Membran isoliert und wie die anderen Membranstücke bei -80 °C asserviert. Die Anfertigung der Gefrierschnitte erfolgte gemäß 3.1.9.1 mit 6 µm dicken Gehirnschnitten. Die PEN-MembraneSlides wurden einzeln bei -80 °C aufbewahrt.

3.1.9.2.1 Immunfluoreszenz (IF) zum Nachweis von Neuronen und Astrozyten

Zur IF zum Nachweis von Neuronen und Astrozyten in OCT-GG wurde ein modifiziertes Protokolls verwendet, um den RNA-Verlust zu minimieren (BURBACH et al., 2004a, b;

POROMBKA et al., 2008b).

1. Blocklösung

Um eine optimale Gewebegängigkeit der Antikörper bei kurzen Inkubationszeiten zu ermöglichen, wurde PBS-DEPC-Aqua bidest. mit 1% BSA und 3% Triton X-100 (VWR International, Darmstadt) versetzt (10.2.4).

2. Primärantikörper

Die verwendeten Primärantikörper finden sich in Tabelle 9. Die primären Antikörper wurden mit PBS-DEPC-Aqua bidest. verdünnt. Zusätzlich erfolgte eine Inhibition endogener bzw.

exogener RNasen durch Zugabe von RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen; 1 U/µl Primärantikörperlösung).

4. Kontrolllösung

Als Kontrolllösung wurde statt der Primärantikörper PBS-DEPC-Aqua bidest. aufgetragen.

5. Sekundäre Antikörper

Zu Detektion wurde ein rot fluoreszierender Indocarbocyanin 3 (Cy3)-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (GaM-Cy3, Dianova, Hamburg, Tab. 9) verwendet, der mit RNase freiem Wasser (Qiagen) resuspendiert und mit Glycerin (99,5%ig, Carl Roth) 1:2 vorverdünnt wurde (10.2.4). Das Absorptionsmaximum lag bei 550 nm, das Emissionsmaximum bei 570 nm.

Tab. 9: Übersicht über die in der IF eingesetzten Antikörper Antikörper NeuN: neuronales Nukleus-Protein; GFAP: glial fibrillary acidic protein; GaM-Cy3: Cy3-konjugierter Ziege-anti-Maus-Sekundär-Antikörper; OCT-GG: OCT-eingebettetes Gefriergewebe

MATERIAL UND METHODEN 55 Um den RNA-Verlust zu minimieren, betrugen die Inkubations- und Waschschritte mit PBS-DEPC-Aqua bidest nur je 3 x 15 Sekunden, die Inkubation mit Blocklösung oder Antikörper 3 bzw. 5 Minuten (POROMBKA et al., 2008b). Die Spezifität der IF-Reaktion wurde durch Inkubation von Folgeschnitten mit der Kontrolllösung statt des Primärantikörpers überprüft.

3.1.9.2.2 Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC)

Es wurden 100 NeuN-positive Neurone sowie 100 GFAP-positive Astrozyten aus dem (Gyrus dentatus) zufällig ausgewählt (Abb. 6). Als Negativkontrolle für die RNA-Isolation (3.1.10.3) wurde von PEN-MembraneSlides pro Objektträger ein ca. 65.000 -260.000 µm² großes Membranstück gewonnen.

Abb. 6: Einzelzellisolation von Neuronen und Astrozyten mittels LMPC-Technik

A, C, E: NeuN-markierte Neurone; A: Übersicht, B: Auswahl NeuN-positiver Neurone für LMPC; C:

Zustand nach Zellisolation mittels LMPC

B, D, F: GFAP-markierte Astrozyten, B: Übersicht; D: Auswahl GFAP-markierter Astrozyten für LMPC, F: Zustand nach Zellisolation mittels LMPC

Gyrus dentatus, BDV-infizierte Lewis-Ratte, 42 dpi. Immunfluoreszenzmarkierung mit Indocarbocyanin 3 (Cy3); Bar: A, B = 100 µm, C-F = 25 µm; aus: Porombka et al., J Virol Meth 2008, 148: 58-65

MATERIAL UND METHODEN 56

3.1.10 REAL TIME RT-PCR

Die Quantifizierung der BDV +ssRNAs aus Gehirnanschnitten, Gehirnlokalisationen (CPu, AH) und Zellen (Neuronen, Astrozyten) erfolgte mittels real-time RT-PCR durch absolute Quantifikation und Taqman^®-Sonden (BUSTIN, 2000; RUTLEDGERG und COTE, 2003).

3.1.10.1 Herstellung des Mengenstandards

Für die Quantifikation mittels real time RT-PCR wurde für jede virale bzw. zelluläre RNA ein entsprechender, logarithmisch verdünnter DNA-Mengenstandard in den Verdünnungsstufen 10⁷ bis 10¹ DNA-Kopien/µl simultan mit den Proben in der real time RT-PCR amplifiziert.

Dazu diente das PCR-Produkt der unter 3.1.7 hergestellten cDNA Klone (Tab. 4). Zur Herstellung einer Standard-Verdünnungsreihe wurden die Plasmidinserts (3.1.7.7, Tab. 5) mit dem GeneAmp^® PCR Core Kit (Applied Biosystems) und dem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik) unter Verwendung von 0,1 ng/µl der nicht linearisierten Plasmide, dem Reaktionsansatz aus 3.1.8.1 sowie der Primer M13 forward und M13 reverse (MWG Biotech) amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte wie unter 3.1.7.4 angegeben bei einer annealing-temperatur von 55 °C, 40 PCR-Zyklen, finaler Elongation bei 72 °C für 10 Minuten und Kühlung der Amplifikate bei 4 °C. Die korrekten Amplifikatgrößen (spezifisches DNA-Insert + 165 bp Plasmid-DNA) wurden in einer Gelektrophorese überprüft und die im Gel enthaltene DNA aufgereinigt (3.1.7.4). Anhand der DNA-Konzentration und der Amplifikatgröße wurde die Kopienzahl pro µl aufgereinigtes PCR-Produkt mit folgender Formel bestimmt (aus:

Roche, Molecular Biochemicals, Technical Note No. LC 11/2000):

*: Konzentration der aufgereinigten DNA

**: Molekulargewicht der DNA

Für die Kalkulation des Molekulargewichtes der DNA wurde ein Molekulargewicht (MW) von 660 D pro Basenpaar (D/bp) vorausgesetzt. Das MW der DNA-Amplifikate errechnet sich aus der Basenpaargröße des Amplifikates (Größe des DNA-Amplifikats [Tab. 4] + 165 bp Vektoranteil) multipliziert mit 660 D/bp. Die DNA wurde mit Aqua bidest. auf 10⁹ DNA-Kopien/µl eingestellt. Die weitere Verdünnung erfolgte logarithmisch (log10-Verdünnung).

3.1.10.2 RNA-Isolation

Die RNA-Isolation aus den Gehirnanschnitten (OCT-GG) BDV-infizierter Lewis-Ratten (14, 24, 42 und 90 dpi; n=3 pro Zeitpunkt) und mock-infizierter Tiere (24, 42 dpi, n=1 pro Zeitpunkt) erfolgte mit der Trizol^®-Methode (Invitrogen) und dem RNeasy^® Minikit (Qiagen) gemäß 3.1.7.1 und die Aufreinigung nach 3.1.7.2. Pro Tier und OCT-Negativkontrolle wurden 3 x 20 µm dicke OCT-Schnitte aus der Ebene III bzw. IV (Tab. 2, Abb. 4) angefertigt. Zur

6,02 x 10²³[Kopien/mol] x DNA-Konzentration* [ng/µl]

MW [g/mol]**

Kopienzahl/µl = 6,02 x 10²³[Kopien/mol] x DNA-Konzentration* [ng/µl]

MW [g/mol]**

6,02 x 10²³[Kopien/mol] x DNA-Konzentration* [ng/µl]

MW [g/mol]**

Kopienzahl/µl =

MATERIAL UND METHODEN 57 Elution der RNA wurde zweimal mit je 30 µl RNase freiem Wasser (Endvolumen ca. 60 µl) gewaschen. Die RNA wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 °C asserviert.

Die Isolierung der Gesamt-RNA aus den Gehirnarealen CPu und AH von BDV- und mock-infizierten Lewis-Ratten und den Kontrollratten erfolgte unter Verwendung des RNeasy^® Minikits (Qiagen) mit DNase I-Verdau (RNase-Free DNase I Sets, Qiagen). Vorab wurde das Gewebelysat in buffer RLT (3.1.9.1) im Eppendorf Thermomixer comfort (OMNILAB Laborzentrum, Gehrden) bei 30 °C und 300 x g aufgetaut. Zur Elution der RNA wurde

Die Isolierung der Gesamt-RNA aus den Gehirnarealen CPu und AH von BDV- und mock-infizierten Lewis-Ratten und den Kontrollratten erfolgte unter Verwendung des RNeasy^® Minikits (Qiagen) mit DNase I-Verdau (RNase-Free DNase I Sets, Qiagen). Vorab wurde das Gewebelysat in buffer RLT (3.1.9.1) im Eppendorf Thermomixer comfort (OMNILAB Laborzentrum, Gehrden) bei 30 °C und 300 x g aufgetaut. Zur Elution der RNA wurde

Im Dokument Untersuchungen zu Pathogenese, Neurotropismus und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit (Seite 63-0)