BDV-Glykoprotein (BDV-GP)

Die zeitliche und regionale Ausbreitung von BDV-GP war im Vergleich zum Vorkommen von BDV-N und BDV-M signifikant geringer und erreichte nie eine vergleichbare disseminierte Ausbreitung. Der zeitlich differierende Nachweis von BDV-GP wies eine hohe Signifikanz auf (p=0,0003). BDV-GP war erstmals 7 Tage p.i. im Zytoplasma einzelner hippocampaler und corticaler Neuronen zu beobachten. 12 Tage p.i. fanden sich einzelne oder kleine Gruppen BDV-GP-positiver Neurone, vor allem in der CA3-Region des Ammonshorns, Cortex cerebri, Amygdala und Thalamus, 14 Tage p.i. auch in Mesencephalon, Medulla oblongata und Cerebellum. Das Maximum des BDV-GP-Nachweises war bereits zwischen 18 und 28 Tagen p.i. erreicht (Abb. 13). In diesem Zeitraum waren deutlich mehr positive Neurone vor allem in Cortex cerebri (Pyramidenzellenschichten), Ammonshorn (CA3-Region, Gyrus dentatus), Thalamus und Amygdala zu erkennen. In N. caudatus/Putamen, Septum und Hypothalamus war kaum BDV-GP zu finden, während im Bulbus olfactorius fast bis 90 Tage p.i. BDV-GP in einzelnen Neuronen auftrat. Ab 31 Tagen p.i. nahm der BDV-GP-Nachweis stetig ab, so dass BDV-GP nur noch in einzelnen corticalen und hippocampalen Neuronen zu finden war.

Abb. 13: Immunhistologische Nachweise von BDV-N, BDV-M und BDV-GP

x-Achse: dpi: days post infection; y-Achse: Immunhistologische Reaktion; BDV-N: BDV-Nukleoprotein;

BDV-M: BDV-Matrixprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken:

Minimaler/Maximaler Wert; signifikante Unterschiede über die Zeit: BDV-N p=0,0007, BDV-GP p=0,0003, BDV-M p=0,0006; p-Werte für die Vergleiche gegeneinander: BDV-N zu BDV-GP p<0,0001, BDV-GP zu BDV-M p=0,0002, BDV-N zu BDV-M p=0,0290

0 0,5

1 1,5

2 2,5

3 3,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

dpi

Immunhistologische Reaktion

BDV-N BDV-M BDV-GP

ERGEBNISSE 89 4.1.5 NACHWEIS BDV-SPEZIFISCHER RNAs MITTELS IN-SITU-HYBRIDISIERUNG

(ISH)

Zum Nachweis viraler RNAs wurden die In-situ-Hybridisierung (ISH) und real time RT-PCR verwendet.Mittels ISH wurde die Expression der positiv orientierten RNAs BDV-N +ssRNA, BDV-Intron II +ssRNA und ergänzend BDV-I Intron +ssRNA hinsichtlich des zeitlichen und topografischen Verteilungsmuster im Gehirn, des zellulären Tropismus und der intrazellulären Lokalisation untersucht. Damit wurde vor allem die jeweilige mRNA detektiert.

Dies diente dazu, morphologische Daten zu viralen Transkriptionsstrategien zu gewinnen, die eine Grundlage zum Verständnis der In-vivo-Persistenz und des Neurotropismus darstellen. Die Anwendung der real time RT-PCR erlaubte eine präzise Quantifizierung der viralen RNAs aus Gehirnanschnitten, definierten Gehirnarealen und Zelltypen (4.1.7). Durch eine Gegenüberstellung mit den immunhistologischen Nachweisen der viralen Proteine konnten die Erkenntnisse zur In-vivo-Regulation viraler Transkription und Translation vertieft werden. Der Nachweis der korrespondierenden, negativ orientierten Genomabschnitte (BDV –ssRNA, genRNA) lieferte morphologische Daten zur Virusreplikation.

Der Nachweis der BDV-N +ssRNA diente als Referenz für die virale Transkriptionseffizienz.

Der Nachweis der BDV-Intron I bzw. BDV-Intron II +ssRNA diente der Detektion von BDV-M-mRNA bzw. von BDV-GP-BDV-M-mRNA. Dabei muss beachtet werden, dass im Rahmen der ISH lediglich der entsprechende intronhaltige Abschnitt der RNA detektiert werden kann, eine Aussage über den Spleißzustand des jeweilig anderen BDV-Introns ist damit nicht möglich.

So kodiert die Intron I-haltige RNA mit und ohne Intron II für M, die BDV-Intron II-haltige RNA jedoch nur bei effizientem Spleißen von BDV-BDV-Intron I für BDV-GP.

Spleißen von BDV-Intron II bzw. BDV-Intron I und II dient der Bereitstellung viraler Transkripte, die für die virale Polymerase kodieren, wobei eine effiziente Transkription von BDV-L auch ein Spleißen des BDV-Intron I benötigen soll. Daher kann mit Sonden spezifisch für BDV-Intron II +ssRNA die die für BDV-GP-kodierende RNA aber auch unreife und intron-I-haltige RNA nachgewiesen werden. Gleiches gilt für den Nachweis der BDV-Intron I +ssRNA. Die ISH zur Detektion der BDV-N +ssRNA und BDV-Intron II +ssRNA wurde 3, 7, 14, 24, 42, 60 und 90 Tage p.i. und der Nachweis der BDV-Intron I +ssRNA 14, 24, 42 und 90 Tage p.i. durchgeführt.

Zusammenfassend waren BDV-N +ssRNA, BDV-Intron I +ssRNA und BDV-Intron II +ssRNA in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen nachweisbar (Abb.

48-51). Herausstechend war der Unterschied in der intrazellulären Verteilung von BDV-N +ssRNA und BDV-Intron II +ssRNA. So lag BDV-N +ssRNA vor allem in Zytoplasma und Fortsätzen vor, BDV-Intron II +ssRNA hingegen meist nur im Kern. BDV-Intron I +ssRNA zeigte eine zeitlich und regional differierende intrazelluläre Verteilung (Abb. 48b, 49b, 50, 51b). Alle BDV genRNAs waren zu allen Zeitpunkten p.i. im Nukleus von Neuronen,

ERGEBNISSE 90

Astrozyten und Oligodendrozyten zu finden, was dem intranukleären Replikationsmodus des BDV entspricht (Abb. 48e, 49e, 51e). Nur vereinzelt traten Zytoplasma- und Faserreaktionen auf. Alle viralen RNAs waren in rundovalen bis spindelförmigen Zellen der Leptomeninx zu finden, als virales Protein war hier nur BDV-N nachweisbar. BDV-N +ssRNA und BDV-N traten im Kern und Zytoplasma dieser Zellen auf, alle anderen viralen RNAs nur im Kern.

Keine virale RNA war in mononukleären Entzündungszellen, neuronalen Satellitenzellen oder im Gehirn der Kontrolltiere und der mock-infizierten Ratten zu finden.

BDV-N und BDV-N +ssRNA waren hinsichtlich des zeitlichen Nachweises, Ausbreitung und Lokalisation im Gehirn nahezu identisch, so dass sich keine signifikanten Unterschiede ergaben. BDV-N und +ssRNA waren im gesamten Gehirn nachweisbar und die hohe Anzahl positiver Zellen blieb bis 90 Tage p.i. erhalten (Abb. 14-16, 48). Das Maximum positiver Zellen und Ausbreitung der BDV-N +ssRNA lag zwischen 24 bis 60 Tagen p.i. Der maximale Nachweis von BDV-N war etwas später (31-42 Tage p.i.) erreicht. Bis 90 Tage p.i. gingen der Protein- und RNA-Nachweis nur geringgradig zurück. Die BDV-N genRNA zeigte eine gleichartige Ausbreitung, war aber insgesamt in etwas weniger Zellkernen zu finden, während BDV-N und +ssRNA vor allem in Zytoplasma und Fortsätzen auftraten.

BDV-M war ähnlich disseminiert im Gehirn zu finden wie BDV-N. BDV-Intron I +ssRNA kam ebenfalls im gesamten Gehirn vor, zeigte aber eine Präferenz für Ammonshorn (CA3-Region), Cortex cerebri und Thalamus (Abb. 49b). Nach dem Maximum (31-50 Tage p.i.) ging die BDV-M-Expression deutlich zurück, ab 24 bis 90 Tagen p.i. war ein vermehrtes Auftreten von BDV-M in Astrozyten, kleinen Neuronen und Neuropil zu beobachten, während große Neurone weniger BDV-M aufwiesen. Der zeitliche Verlauf der BDV-M-Expression ähnelte dem BDV-Intron I +ssRNA-Nachweis. Dieser erreichte sein Maximum 24 Tage p.i.

und nahm bereits ab 42 Tage p.i. und damit früher und statistisch auffällig als die BDV-M-Expression ab (p=0,0593). Der Rückgang BDV-Intron I +ssRNA-positiver Zellen war in den bevorzugten Gehirngebieten jedoch geringer als in anderen Gehirnarealen. Während BDV-Intron I +ssRNA zu früheren Zeitpunkten p.i. in neuronalem Zytoplasma und nur teilweise intranukleär vorlag, war sie ab 42 Tage p.i. vor allem auf Zellkerne beschränkt. Nur im Ammonshorn zeigten bis 90 Tage p.i. Kerne und Zytoplasma von Neuronen positive Signale.

BDV-Intron I +ssRNA kam wie BDV-M und BDV-N sowie dessen RNAs disseminiert im Gehirn vor, zeigte jedoch eine Präferenz für Ammonshorn, Cortex cerebri und Thalamus.

Der Nachweis von BDV-GP unterschied sich signifikant von der Detektion der korrespondierenden RNAs (Abb. 14, 15; Vergleich BDV-GP zu BDV-GP-C +ssRNA p=0,0060), da wesentlich mehr Zellen BDV-Intron II +ssRNA als BDV-GP aufwiesen (Abb.

17, 51). BDV-Intron II +ssRNA war in allen Gehirnregionen anzutreffen, jedoch in geringerem Ausmaß als die BDV-N +ssRNA. In Cortex cerebri, Amygdala, Ammonshorn und Thalamus fanden sich mehr positive Zellen als in den übrigen Gehirngebieten (Abb. 51b). BDV-GP war

ERGEBNISSE 91 vor allem im Zytoplasma einzelner großer Neurone in Ammonshorn, Cortex cerebri, Thalamus und Amygdala zu finden. Das Maximum war bereits zwischen 18 und 28 Tagen p.i. erreicht, danach gingen die BDV-GP-positiven Zellen stetig zurück. BDV-Intron II +ssRNA war im Unterschied zu BDV-GP vorrangig in Kernen lokalisiert, Zytoplasmasignale traten, wenn überhaupt, vor allem zu späteren Zeitpunkten p.i. auf. Das Maximum des Nachweises der BDV-Intron II +ssRNA reichte von 24 bis 60 Tagen p.i. 90 Tage p.i. nahmen, wie beim Nachweis der BDV-N RNAs, die positiven Zellen etwas ab. Die detaillierte Darstellung der Nachweise der viralen RNAs findet sich unter 4.1.5.1.-4.1.5.4.

4.1.5.1 BDV-N +ssRNA

Als generelles Reaktionsschema war BDV-N +ssRNA vor allem in Zytoplasma und Fortsätzen von Neuronen detektierbar, bei ca. 50-80 % der Neuronen waren zusätzlich die Kerne meist schwächer positiv (Abb. 48b). Auch in Ependymzellen, Astrozyten und Oligodendrozyten war in Kernen, seltener zusätzlich im Zytoplasma, BDV-N +ssRNA vorhanden (Abb. 48c, d). Eine Neuropilreaktion trat nicht auf. Im Kern zeigten sich gerade zu den frühen Zeitpunkten p.i. häufig nur ein einzelnes punktförmiges Signal, morphologisch möglicherweise dem Nukleolus entsprechend, und später auch diffuse Kernreaktionen. In der Leptomeninx fanden sich meist punktförmige nukleäre und selten zytoplasmatische Reaktionen in rundovalen bis spindelförmigen Zellen.

Die zeitliche und regionale Ausbreitung der BDV-N +ssRNA ergab eine signifikante Zunahme über die Zeit (p=0,0064). Bereits 3 Tage p.i. war bei einem Tier im Zytoplasma einzelner Neuronen in der Nähe der Inokulationsstelle BDV-N +ssRNA nachweisbar. Am Tag 7 p.i. war in deutlich mehr Neuronen, kleineren Zellen und Ependymzellen BDV-N +ssRNA, vorwiegend in der CA3-Region des Ammonshorns, periventrikulär und im Thalamus anzutreffen. Die Zahl der positiven Zellen stieg weiterhin an und erreichte 24 Tage p.i. ihr Maximum (Abb. 14). BDV-N +ssRNA fand sich in allen Gehirnregionen, wobei die Reaktionen im Zytoplasma und in den Fortsätzen von Neuronen besonders stark waren.

Dies verringerte sich bis 90 Tage p.i. nur geringgradig. In der Leptomeninx traten 7 bis 90 Tage p.i. zunächst vereinzelt positive Zellkerne, später auch herdförmig positive Zellen auf.

4.1.5.2 BDV-Intron I +ssRNA (BDV-M +ssRNA)

Als generelles Reaktionsmuster war BDV-Intron I +ssRNA in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen zu finden. In Neuronen traten feingranuläre bis diffuse Signale im Kern und/oder Zytoplasma auf, während die anderen Zellen vor allem Kernreaktionen aufwiesen (Abb. 49b-d, 50). Bis 24 Tage p.i. wiesen Neuronen größtenteils zytoplasmatische Signale auf, während ab 42 Tagen p.i., außer im Ammonshorn, bemerkenswerterweise vor allem intranukleäre Aggregate vorlagen. In der Leptomeninx fanden sich punktförmige Signale in Kernen einzelner rundovaler bis spindelförmiger Zellen.

ERGEBNISSE 92

Die zeitliche und regionale Ausbreitung der BDV-Intron I +ssRNA ergab zwischen den einzelnen Zeitpunkten p.i. eine statistisch auffällige Variation des Nachweises (p=0,0788). 14 Tage p.i. war in den meisten Gehirnregionen BDV-Intron I +ssRNA vor allem im Zytoplasma kleiner Neuronen nachweisbar. Im Ammonshorn wiesen vor allem die Neuronen der CA3-Region zytoplasmatische und teilweise intranukleäre Signale auf. Im Stratum granulosum des Gyrus dentatus traten nur punktförmige Kernreaktionen auf, dies war, kombiniert mit schwachen zytoplasmatischen Signalen, über den gesamten Untersuchungszeitraum zu beobachten. Einzelne Ependymzellen zeigten ab 14 Tagen p.i. punktförmige Kernsignale. 24 Tage p.i. war ein deutlicher Anstieg BDV-Intron I +ssRNA-positiver Zellen zu verzeichnen (Abb. 14). Vor allem Neuronen des Cortex cerebri, Thalamus und Ammonshorn sowie teilweise auch des Mesencephalons und Medulla oblongata zeigten Zytoplasmareaktionen, die in der CA3- und CA1-Region mit nukleären Signalen kombiniert sein konnten. Ab 42 Tage p.i. nahmen die BDV-Intron I +ssRNA-positiven Zellen ab, vor allem in Cortex cerebri, Striatum, Cerebellum und Gyrus dentatus, jedoch nicht in den CA-Regionen des Ammonshorns, Thalamus, Mesencephalons und Bulbus olfactorius. Im Corpus callosum waren vermehrt positive Astrozyten- und Oligodendrozytenkerne zu erkennen. Positive Signale fanden sich nun generell eher im Kern. Deutliche Zytoplasmareaktionen waren nur noch in Pyramidenzellen der CA3- und teilweise der CA1-Region und im Thalamus vorhanden. 90 Tage p.i. nahm die Anzahl positiver Zellen weiter ab, vor allem in Cortex cerebri, Thalamus und Cerebellum, aber kaum im Ammonshorn, wo vermehrt Zellen der CA1-Region positiv waren. 14 bis 90 Tage p.i. traten einzelne punktförmige Kernsignale in der Leptomeninx auf.

4.1.5.3 BDV-Intron II +ssRNA (BDV-GP-N +ssRNA und BDV-GP-C +ssRNA)

Das generelle Reaktionsmuster unterschied sich erheblich von dem der BDV-N +ssRNA, da BDV-Intron II +ssRNA vor allem in Zellkernen von Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen als punktförmige oder diffuse Signale nachzuweisen war (Abb. 51b-d). Nur bei etwa 30 % der Neuronen trat auch in Perikarya und Fortsätzen ein positives Signal auf, besonders zahlreich waren derartige Reaktionen in hippocampalen Neuronen (Abb. 51b). In rundovalen bis spindelförmigen Zellen der Leptomeninx fanden sich meist punktförmige Kernreaktionen.

Die zeitliche und regionale Ausbreitung der BDV-Intron II +ssRNA war statistisch signifikant (BDV-GP-N +ssRNA p=0,0097, BDV-GP-C +ssRNA p=0,0145). BDV-Intron II +ssRNA war erstmals 7 Tage p.i. in vereinzelten Kernen von Neuronen der CA3-Region, des Cortex cerebri und periventrikulären Arealen des III. Ventrikels sowie im Kern einzelner Ependymzellen zu erkennen. 14 Tage p.i. nahm die Anzahl BDV-Intron II +ssRNA-haltiger Zellen zu. BDV-Intron II +ssRNA kam weiterhin fast nur in Zellkernen vor, vor allem in Ammonshorn, Thalamus und Cortex cerebri. Die Anzahl positiver Zellen stieg weiter an und

ERGEBNISSE 93 erreichte am Tag 24 p.i. ihr Maximum (Abb. 14). Zellen mit BDV-Intron II +ssRNA waren nun in allen Gehirngebieten vorhanden, besonders häufig jedoch in Ammonshorn, Amygdala und Cortex cerebri. Der Nachweis von BDV-Intron II +ssRNA im Zytoplasma oder Fortsätzen von Neuronen stieg 60 und 90 Tage p.i. etwas an. 90 Tage p.i. nahm die Anzahl positiver Zellen und deren Ausbreitung im Gehirn geringgradig ab. In der Leptomeninx traten 7 bis 90 Tage p.i. vereinzelt oder herdförmig punktförmige Kernsignale auf.

4.1.5.4 Nachweis korrespondierender Genomabschnitte

Für den Nachweis der viralen Genomabschnitte wird das generelle Reaktionsmuster der BDV-N genRNA beschrieben, da sich in Vorauswertungen die erwartete vergleichbare Lokalisation der verschiedenen Genomabschnitte ergeben hatte (Abb. 48e, 49e, 51e). BDV-N genRBDV-NA war in Kernen von BDV-Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen vorhanden. Gerade zu Beginn der Untersuchung (7-24 Tage p.i.) war vermehrt eine punktförmige nukleäre Anfärbung, die möglicherweise den Nukleolus darstellte, vorhanden, während im weiteren Verlauf zunehmend häufiger eine diffuse Kernreaktion auftrat.

Zusätzlich waren in einzelnen Gebieten, wie dem Stratum lucidum der CA3-Region des Ammonshorns, granuläre Faserreaktionen (ab 24 Tage p.i.) zu erkennen. Ab etwa 24 Tagen p.i. war die genRNA auch im neuronalen Zytoplasma anzutreffen, vor allem im Ammonshorn.

In der Leptomeninx fanden sich vereinzelt bis herdförmig, meist punktförmige Kernsignale in rundovalen bis spindelförmigen Zellen.

Bei der Dokumentation der zeitlichen und regionale Ausbreitung fand sich BDV-N genRNA erstmals in neuronalen Kernen im Ammonshorn 7 Tage p.i. Ab 14 Tagen p.i. war BDV-N genRNA in Kernen von Ependymzellen zu finden und vor allem in Ammonshorn, Thalamus und Cortex cerebri traten schon deutlich mehr punktförmige Kernreaktion in Neuronen auf. Ab 24 Tagen p.i. trat BDV-N genRNA im Zytoplasma vereinzelter Neuronen und im Neuropil auf, vor allem im Ammonshorn, aber auch in Amygdala, Thalamus und Hypothalamus. Am Tag 24 p.i. stieg der Nachweis an, das Maximum positiver Zellen war 42 Tage p.i. erreicht und verringerte sich bis 90 Tage nur p.i. geringgradig (Abb. 14).

ERGEBNISSE 94

Abb. 14a: Nachweis der BDV-N +ssRNA und BDV-Intron II +ssRNA mittels ISH

Abb. 14b: Nachweis der BDV-Intron I +ssRNA mittels ISH

Abb. 14c: Nachweis der BDV-Genomabschnitte mittels ISH

ISH: In-situ-Hybridisierung; x-Achse: dpi, days post infection; y-Achse: Ausmaß des RNA-Nachweises;

N: Nukleoprotein; GP-C: Glykoprotein, C-terminaler Abschnitt; GP-N: BDV-GP, N-terminaler Abschnitt; BDV-Intron I: Intron I des BDV; BDV-Intron II: Intron II des BDV; genRNA:

genomische RNA; +ssRNA: positiv orientierte RNA, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken:

Minimaler/ Maximaler Wert; signifikante Unterschiede über die Zeit: BDV-N +ssRNA p=0,0064; BDV-N genRNA p=0,0083; BDV-GP-N +ssRNA p=0,0097; BDV-GP-C +ssRNA p=0,0145

0

ERGEBNISSE 95 4.1.6 QUANTIFIZIERUNG DER MORPHOLOGISCHEN NACHWEISE

BDV-SPEZIFISCHER PROTEINE UND RNAs

Die quantitative Auswertung des Nachweises von BDV-N, BDV-GP und korrespondierender RNAs mittels IH und ISH beruhte auf einer Auszählung von Zellen mit positivem Protein- bzw. RNA-Nachweis im Hippocampus an Tag 14, 24, 42 und 90 p.i. Die statistische Analyse basierte auf der Anzahl positiver Zellen pro Fläche (mm²). Die Anzahl positiver Zellen/mm² wurde als Mittelwert aus den drei untersuchten Tieren eines Zeitpunktes angegeben.

Im Vergleich des Nachweises von BDV-N, BDV-GP und korrespondierender RNAs ergab die Quantifizierung im Ammonshorn höchst signifikante Unterschiede in der intrazellulären Lokalisation von BDV-N, BDV-GP und den jeweiligen RNAs (p=0,0005). Der BDV-GP-Nachweis war über den gesamten Beobachtungszeitraum höchst signifikant niedriger als der des BDV-N (p<0,0001, Abb. 15). Auch die intrazelluläre Verteilung unterschied sich, wie bereits beschrieben. BDV-N war vor allem in Zytoplasma und Kern nachweisbar, BDV-GP nur im Zytoplasma. Die Anzahl der BDV-GP-N +ssRNA-positiven Zellen war höchst signifikant geringer als die der BDV-N +ssRNA-positiven Zellen (p=0,0007). Der Vergleich der genRNAs zeigte keine Signifikanz, sie waren alle fast nur im Kern zu finden. Ein deutlicher Unterschied in der intrazellulären Lokalisation war zwischen BDV-N +ssRNA und BDV-GP-C +ssRNA bzw. BDV-GP-N +ssRNA festzustellen: BDV-N +ssRNA war in Zytoplasma bzw. Zytoplasma und Kern nachweisbar, BDV-Intron II +ssRNA nur im Kern oder teilweise in Kern und Zytoplasma.

Detaillierte Darstellung der quantitativen morphologischen Nachweise

Die Auszählung von Zellen mit Nachweis von BDV-N und BDV-N +ssRNA im Ammonshorn ergab 14 und 24 Tage p.i. 190 Zellen BDV-N-positive Zellen/mm², am Tag 90 p.i. im Mittelwert 260 Zellen/mm². Am Tag 24 p.i. war die Zahl positiver Zellen mit 120/mm² am geringsten. BDV-N war fast nur in Zytoplasma und Nukleus gleichzeitig vorhanden (14 Tage p.i. 174 Zellen/mm², 24 Tage p.i. 114 Zellen/mm², 42 Tage p.i. 190 Zellen/mm², 90 Tage p.i. 260 Zellen/mm²; Abb. 15). BDV-N war 14 Tage p.i. bei durchschnittlich 24 Zellen/mm² nur im Kern zu finden. Am Tag 24 p.i. waren es nur noch 3 Zellen/mm², 90 Tage p.i. traten keine mehr auf. Dieser Unterschied zwischen den einzelnen Zeitpunkten war signifikant (p=0,0145). Zellen mit BDV-N-Nachweis nur im Zytoplasma traten selten auf.

Die Gesamtzahl BDV-N +ssRNA-positiver Zellen stieg von 87 Zellen 14 Tage p.i. auf knapp 190 Zellen/mm² an Tag 90 p.i. BDV-N +ssRNA war 14 Tage p.i. in ca. 46 Zellen/mm² im Zytoplasma und in ca. 41 Zellen/mm² in Zytoplasma und Nukleus vorhanden. Der Anteil von Zellen mit rein zytoplasmatischer Reaktion wurde immer weniger (22 Zellen/mm² 90 Tage p.i.), während der Anteil der Zellen mit zytoplasmatischer und nukleärer Reaktion steil anstieg (166 Zellen/mm² an Tag 90 p.i.; Abb. 16). Zellen mit rein nukleärem Nachweis von BDV-N +ssRNA traten kaum auf, der größte Wert waren 1,9 Zellen/mm² an Tag 90 p.i.

ERGEBNISSE 96

Beispielhaft für den Nachweis genomischer viraler RNA wurden BDV-N gen RNA-positive Zellen ausgezählt. BDV-N genRNA trat im Kern auf, nur ganz vereinzelte Zellen wiesen eine zytoplasmatische oder zusätzliche nukleäre Reaktion auf. 14 Tage p.i. enthielten ca. 43 Zellen/mm² BDV-N genRNA, diese Zahl stieg auf 233 Zellen/mm² an den Tagen 42 und 90 p.i. Die Anzahl BDV-N genRNA-positiver Zellen war 14 Tage p.i. niedriger, 24 Tage p.i. ungefähr gleich und 42 und 90 Tage p.i. höher als die BDV-N +ssRNA-positiver Zellen.

Die Gesamtzahl der BDV-N-positiven Zellen war fast zu allen Zeitpunkten höher als die Anzahl von Zellen, in denen die entsprechenden RNAs nachweisbar waren. Diese Beobachtung entspricht der semiquantitativen Auswertung in den Gehirnanschnitten.

Die Auszählung von Zellen mit Nachweis von BDV-GP und BDV-Intron II +ssRNA (BDV-GP-N +ssRNA, BDV-GP-C +ssRNA) ergab, dass im Gegensatz zu BDV-N BDV-GP nur in wenigen Zellen des Ammonshorns zu finden war. 14 Tage p.i. waren es durchschnittlich 8 Zellen/mm², 24, 42 und 90 Tage p.i. zwischen 30 und 32 Zellen/mm² (Abb.

15). BDV-GP war fast nur im Zytoplasma lokalisiert. Zellen mit BDV-GP-Nachweis nur im Kern waren nicht vorhanden, die Anzahl von Zellen mit BDV-GP in Zytoplasma und Kern war unbedeutend (Maximum 0,7 Zellen/mm² 24 Tage p.i.).

BDV-GP-C +ssRNA war 14 Tage p.i. in ca. 70 Zellen/mm² nachzuweisen. Diese Zahl stieg kontinuierlich an und erreichte 90 Tage p.i. bis zu 284 Zellen/mm². Das Vorkommen von BDV-GP-C +ssRNA war auf den Nukleus beschränkt, und in deutlich weniger Zellen trat zusätzlich ein Signal im Zytoplasma auf (maximal 40 Zellen/mm² 90 Tage p.i.). Die Anzahl von Zellen mit BDV-GP-N +ssRNA war im Vergleich zur BDV-GP-C +ssRNA an Tag 14 p.i.

mit 65 Zellen/mm² etwa gleich, stieg dann aber weniger steil an (Maximum 175 Zellen/mm² 42 dpi) und fiel 90 Tage p.i. auf 131 Zellen/mm² ab. Die intrazelluläre Verteilung der BDV-GP-N +ssRNA wies im Vergleich zur BDV-GP-C +ssRNA mehr Zellen mit Reaktion in Kern und Zytoplasma (maximal 95 Zellen/mm² 42 Tage p.i.) auf. Verglichen mit der BDV-GP-N

mit 65 Zellen/mm² etwa gleich, stieg dann aber weniger steil an (Maximum 175 Zellen/mm² 42 dpi) und fiel 90 Tage p.i. auf 131 Zellen/mm² ab. Die intrazelluläre Verteilung der BDV-GP-N +ssRNA wies im Vergleich zur BDV-GP-C +ssRNA mehr Zellen mit Reaktion in Kern und Zytoplasma (maximal 95 Zellen/mm² 42 Tage p.i.) auf. Verglichen mit der BDV-GP-N

Im Dokument Untersuchungen zu Pathogenese, Neurotropismus und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit (Seite 106-0)