C. HERDEN P ATHOGE NESE , NEUR O TR OPISMUS UND PE RSISTE NZ DES BDV
VVB
9 7 8 3 8 3 5 9 5 4 6 8 7 ISBN 3-8359-5468-7 VVB LAUFERSWEILER VERLAG
STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de
VVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifique
CHRISTIANE HERDEN
UNTERSUCHUNGEN ZU PATHOGENESE, NEUROTROPISMUS UND PERSISTENZ DES
VIRUS DER BORNASCHEN KRANKHEIT
Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia legendi
an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
VVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifique
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1. Auflage 2009
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written permission of the Author or the Publishers.
1 Edition 2009st
© 2009 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany
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édition scientifique
Aus dem Institut für Pathologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu Pathogenese, Neurotropismus und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit
Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia legendi
an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dr. med. vet. Christiane Herden
Hannover 2009
Tag der nicht öffentlichen wissenschaftlichen Aussprache: 8. Mai 2009
We shall not cease from exploring And the end of all our exploring Will be to arrive where we started And know the place for the first time T.S. Eliot
INHALTSVERZEICHNIS I INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG...1
2 LITERATURÜBERSICHT ...3
2.1 VORKOMMEN UND EPIDEMIOLOGIE DER BORNASCHEN KRANKHEIT ...3
2.1.1 Bornasche Krankheit ...3
2.1.2 Wirtsspektrum und Epidemiologie ...3
2.2 EXPERIMENTELLE BDV-INFEKTION VON LEWIS-RATTEN ...5
2.2.1 Klinik ...5
2.2.2 Pathogenese ...6
2.3 EXPERIMENTELLE BDV-INFEKTION VON MÄUSEN ...11
2.3.1 Klinik ...12
2.3.2 Pathogenese ...12
2.4 NATÜRLICHE BDV-INFEKTIONEN ...14
2.4.1 Klinik ...14
2.4.2 Pathogenese ...15
2.5 DAS VIRUS DER BORNASCHEN KRANKHEIT (BDV) ...16
2.5.1 Infektionsweg und Virusausbreitung ...16
2.5.2 Viruscharakterisierung und Genomorganisation ...18
2.5.3 Infektionszyklus des BDV ...20
2.5.4 BDV-spezifische Proteine ...23
2.5.4.1 Proteine des viralen Polymerasekomplex ...23
2.5.4.2 Strukturproteine...26
2.5.5 Persistenz des BDV...27
2.6 TUMOR-NEKROSE-FAKTOR-α (TNF)...30
2.6.1 TNF und TNF-vermittelte Signalwege...30
2.6.2 Funktionen des TNF im ZNS ...32
2.6.3 Rolle des TNF bei viralen Infektionen des ZNS ...33
2.6.4 TNF-transgene Mausmodelle ...34
3 MATERIAL UND METHODEN ...35
3.1 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON LEWIS-RATTEN...35
3.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung ...35
3.1.2 Viruspräparation ...35
3.1.3 Versuchsdurchführung ...36
3.1.3.1 Infektion der Versuchstiere und Kontrollen ...36
3.1.3.2 Klinik, Versuchsablauf und Übersicht der durchgeführten Untersuchungen ...36
3.1.4 Probenentnahme, Präparation der Organe und untersuchte Gehirnregionen ....38
3.1.4.1 Untersuchte Gehirnregionen...38
3.1.5 Histopathologische Präparation ...40
3.1.5.1 Auswertung ...40
3.1.6 Immunhistologie (IH) ...41
3.1.6.1 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)–Methode ...42
3.1.6.2 Doppelmarkierungen ...42
3.1.6.3 Immunhistologische Kontrollen ...43
3.1.6.4 Auswertung der Immunhistologie...43
II INHALTSVERZEICHNIS
3.1.7 Herstellung von cDNA-Klonen ...44
3.1.7.1 RNA-Isolation ...45
3.1.7.2 Aufreinigung der RNA...45
3.1.7.3 Reverse Transkription...45
3.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...45
3.1.7.5 Klonierungsreaktion...47
3.1.7.6 Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA ...47
3.1.7.7 Sequenzierung und weitere Verwendung der cDNA-Klone ...47
3.1.8 In-situ-Hybridisierung (ISH) ...49
3.1.8.1 Sondenherstellung und In-vitro-Transkription ...49
3.1.8.2 Durchführung der ISH...50
3.1.8.3 Doppelmarkierungen ...50
3.1.8.4 Kontrollen ...51
3.1.8.5 Auswertung ...51
3.1.9 Laser Microdissection (LM)...52
3.1.9.1 Isolation definierter Gehirngebiete, Laser Microbeam Microdissection (LMM) ...53
3.1.9.2 Isolation von Einzelzellen ...53
3.1.9.2.1 Immunfluoreszenz (IF) zum Nachweis von Neuronen und Astrozyten ...54
3.1.9.2.2 Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC) ...55
3.1.10 Real time RT-PCR...56
3.1.10.1 Herstellung des Mengenstandards ...56
3.1.10.2 RNA-Isolation ...56
3.1.10.3 Spezifische reverse Transkription ...57
3.1.10.4 Durchführung der real time RT-PCR...58
3.1.10.4.1 Primer und Taqman®-Sonden ...59
3.1.10.4.2 Reaktionsansatz für die real time RT-PCR ...61
3.1.10.5 Quantifizierung und Normalisierung der Genexpression ...62
3.1.11 Nachweis von infektiösem BDV ...63
3.1.12 Statistische Auswertung ...63
3.2 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON TNF-TRANSGENEN MÄUSEN...65
3.2.1 Versuchstiere und Tierhaltung ...65
3.2.1.1 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels real time PCR ...66
3.2.2 Viruspräparation ...67
3.2.3 Versuchsdurchführung...67
3.2.3.1 Infektion der Versuchstiere und Kontrollen ...67
3.2.3.2 Klinik, Versuchsablauf und Übersicht der durchgeführten Untersuchungen ...68
3.2.4 Probenentnahme, Präparation der Organe und untersuchte Gehirnregionen ....70
3.2.4.1 Untersuchte Gehirnregionen...70
3.2.5 Histopathologische Präparation ...71
3.2.5.1 Auswertung ...71
3.2.6. Immunhistologie (IH) ...72
3.2.6.1 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)–Methode ...73
3.2.6.2 Immunhistologische Kontrollen ...73
3.2.6.3 Auswertung ...73
INHALTSVERZEICHNIS III
3.2.7 Herstellung von cDNA-Klonen ...75
3.2.7.1 RNA-Isolation ...75
3.2.7.2 Reverse Transkription ...75
3.2.7.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...75
3.2.7.4 Sequenzierung und weitere Verwendung der cDNA-Klone...76
3.2.8 In-situ-Hybridisierung (ISH) ...77
3.2.8.1 Sondenherstellung ...77
3.2.8.2 Durchführung der ISH...77
3.2.8.3 Doppelmarkierungen ...78
3.2.8.4 Kontrollen ...78
3.2.8.5 Auswertung ...78
3.2.9 Real time RT-PCR...78
3.2.9.1 Herstellung des Mengenstandards ...78
3.2.9.2 RNA-Isolation ...78
3.2.9.3 Spezifische reverse Transkription...79
3.2.9.4 Durchführung der real time RT-PCR mit Taqman®-Sonden ...79
3.2.9.5 Durchführung der real time RT-PCR mit SYBR-Green®...79
3.2.9.6 Auswertung und Normalisierung...80
3.2.10 Nachweis von infektiösem BDV ...80
3.2.11 Statistische Auswertung ...80
4 ERGEBNISSE...82
4.1 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON LEWIS-RATTEN...82
4.1.1 Klinik ...82
4.1.2 Histopathologische Befunde ...82
4.1.2.1 Entzündliche Veränderungen ...82
4.1.2.2 Degenerative Veränderungen...83
4.1.3 Charakterisierung residenter Zellen und neuroprotektiver Faktoren ...84
4.1.3.1 Nachweis aktivierter Astrozyten...84
4.1.3.2 Nachweis aktivierter Mikroglia und Makrophagen...84
4.1.3.3 Nachweis neuroprotektiver Faktoren ...85
4.1.4 Immunhistologischer Nachweis BDV-spezifischer Proteine ...86
4.1.4.1 BDV-Nukleoprotein (BDV-N) ...87
4.1.4.2 BDV-Matrixprotein (BDV-M) ...87
4.1.4.3 BDV-Glykoprotein (BDV-GP)...88
4.1.5 Nachweis BDV-spezifischer RNAs mittels In-situ-Hybridisierung (ISH)...89
4.1.5.1 BDV-N +ssRNA ...91
4.1.5.2 BDV-Intron I +ssRNA (BDV-M +ssRNA)...91
4.1.5.3 BDV-Intron II +ssRNA (BDV-GP-N +ssRNA und BDV-GP-C +ssRNA)...92
4.1.5.4 Nachweis korrespondierender Genomabschnitte ...93
4.1.6 Quantifizierung der morphologischen Nachweise BDV-spezifischer Proteine und RNAs...95
4.1.7 Real time RT-PCR zum Nachweis der BDV +ssRNAs...99
4.1.7.1 Real time RT-PCR zum Nachweis der BDV +ssRNAs aus Gehirnanschnitten ..99
IV INHALTSVERZEICHNIS
4.1.7.2 Real time RT-PCR zum Nachweis der BDV +ssRNAs aus
definierten Gehirnregionen ... 101
4.1.7.3 Real time RT-PCR zum Nachweis der BDV +ssRNAs aus verschiedenen Zellpopulationen ... 105
4.1.8 Nachweis von infektiösem BDV ... 108
4.2 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON TNF-TRANSGENEN MÄUSEN... 109
4.2.1 Klinik... 109
4.2.2 Histopathologische Befunde ... 110
4.2.2.1 Entzündliche Veränderungen... 110
4.2.2.2 Degenerative Veränderungen... 111
4.2.3 Charakterisierung residenter Zellen und neuroprotektiver Faktoren... 111
4.2.3.1 Nachweis aktivierter Astrozyten... 111
4.2.3.2 Nachweis aktivierter Mikroglia und Makrophagen ... 113
4.2.3.3 Nachweis neuroprotektiver Faktoren ... 114
4.2.4 Immunhistologischer Nachweis BDV-spezifischer Proteine ... 115
4.2.4.1 BDV-Nukleoprotein (BDV-N)... 116
4.2.5 Nachweis BDV-spezifischer RNAs mittels ISH... 118
4.2.5.1 BDV-N +ssRNA ... 119
4.2.5.2 BDV-Intron II +ssRNA (BDV-GP-N +ssRNA) ... 119
4.2.5.3 Nachweis korrespondierender Genomabschnitte... 119
4.2.6 Real time RT-PCR zum Nachweis der BDV +ssRNAs aus Gehirnanschnitten. 121 4.2.7 Real time RT-PCR zum Nachweis der mRNA von TNF und TNF-Rezeptoren aus Gehirnanschnitten und definierten Gehirnregionen ... 123
4.2.7.1 Transgene TNF (TNFtg)-mRNA... 124
4.2.7.2 Gesamt TNF (TNFto)-mRNA ... 125
4.2.7.3 TNF-Rezeptor-1 (TNFR1)-mRNA ... 127
4.2.7.4 TNF-Rezeptor-2 (TNFR2)-mRNA ... 128
4.2.8 Real time RT-PCR zum Nachweis der BDNF-mRNA, NR2B-Rezeptor-mRNA und Prodynorphin-mRNA ... 130
4.2.8.1 BDNF-mRNA ... 130
4.2.8.2 NR2B-Rezeptor-mRNA... 131
4.2.8.3 Prodynorphin-mRNA ... 132
4.2.9 Nachweis von infektiösem BDV ... 132
5 DISKUSSION ... 133
5.1 NEURODEGENERATION, NEUROPROTEKTION, KLINIK UND ENTZÜNDUNGSREAKTION NACH BDV-INFEKTION VON LEWIS-RATTEN UND TNF-TRANSGENEN MÄUSEN... 133
5.1.1 Klinik und histopathologische Befunde ... 133
5.1.2 Charakterisierung residenter Zellen und neuroprotektiver Faktoren... 137
5.1.3 Nachweis der mRNA von TNF und TNF-Rezeptoren nach BDV-Infektion von TNF-transgenen Mäuse... 143
5.1.4 Übergreifende Diskussion der Klinik, Entzündungsreaktion, neurodegenerativer und neuroprotektiver Effekte ... 145
INHALTSVERZEICHNIS V
5.2 VIRUSAUSBREITUNG UND VIRUSPERSISTENZ NACH BDV-INFEKTION
VON LEWIS-RATTEN UND TNF-TRANSGENEN MÄUSEN ... 149
5.2.1 Morphologischer Nachweis BDV-spezifischer Proteine und RNAs ... 149
5.2.1.1 Nukleoprotein und korrespondierende RNA ... 149
5.2.1.2 Matrixprotein und korrespondierende RNA ... 152
5.2.1.3 Glykoprotein und korrespondierende RNA ... 155
5.2.1.4 Genomische RNA... 158
5.2.2 Quantifizierung BDV-spezifischer RNAs ... 160
5.2.2.1 Quantifizierung der BDV +ssRNAs in Gehirnanschnitten der Ratten ... 160
5.2.2.2 Quantifizierung der BDV +ssRNAs in Gehirngebieten bei der Ratte ... 160
5.2.2.3 Quantifizierung der BDV +ssRNAs in definierten Zelltypen bei der Ratte... 161
5.2.2.4 Quantifizierung der BDV +ssRNAs in Gehirnanschnitten der Mäuse ... 163
5.2.3 Nachweis von infektiösem Virus ... 164
5.2.4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION UND BEDEUTUNG DER QUANTITATIVEN UND MORPHOLOGISCHEN VIRUSNACHWEISE FÜR DIE REGULATION DER VIRUSAUSBREITUNG UND VIRUSPERSISTENZ .. 164
5.2.4.1 Regulation der Virusreplikation und Transkription... 165
5.2.4.2 Regulation der Expression BDV-spezifischer Proteine ... 168
5.2.4.3 Einfluss neuroprotektiver und wirtseigener Faktoren auf die Virusreplikation, -transkription und Expression viraler Strukturproteine... 171
5.2.5 Schlussbetrachtung ... 172
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 173
7 SUMMARY... 177
8 ABBILDUNGEN ... 181
8.1 Experimentelle Infektion von Lewis-Ratten ... 181
8.2 Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen ... 189
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 197
10 ANHANG ... 226
10.1 Tierhaltung ... 226
10.2 Lösungen, Puffer und Validierung der real time RT-PCR... 226
10.2.1 Immunhistologie ... 226
10.2.2 Klonierung ... 228
10.2.3 Sondenherstellung und In-situ-Hybridisierung ... 228
10.2.4 Laser Microdissection... 232
10.2.5 RNA-Isolierung, reverse Transkription, real time RT-PCR ... 233
10.3 Tabellen ... 235
10.3.1 Experimentelle BDV-Infektion von Lewis-Ratten... 235
10.3.2 Experimentelle BDV-Infektion von TNF-transgenen Mäusen ... 252
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN VI
ABKÜRZUNGEN
A Adenin
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
Aca Acetanhydrid
ADNP activity-dependent neuroprotective protein AIF-1 allograft inflammatory factor-1
AP Alkalische Phosphatase
A. bidest. Aqua bidestillata
A. dest. Aqua destillata
as antisense
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat
BD Borna disease, Bornasche Krankheit
BDNF brain derived neurotrophic factor
BDV Borna disease virus, Virus der Bornaschen Krankheit
BDV-LE leader-haltige BDV +ssRNA
BDV-GP BDV-Glykoprotein
BDV-M BDV-Matrixprotein
BDV-N BDV-Nukleoprotein
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
C Cytosin
cDNA komplementäre DNA
cRNA komplementäre RNA
Ct threshold cycle
DAB 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Lösung
DEPC Diethylpyrocarbonat
DIG Digoxigenin
DMEM Dulbecco-Modifizierung von Eagle’s Medium
DMF Dimethylformamid
DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dpi days post infection, Tage nach Infektion
dRN relative Quantität
dsRNA double strand RNA, doppelsträngige RNA
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
FKS Fetales Kälberserum
G Guanin
g Gramm
x g Gravitation
GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
GFAP glial fibrillary acidic protein, saures Gliafaserprotein
GMEM Glasgow-Modifikation von Eagle’s Medium
GOI gene of interest
HE Hämatoxylin-Eosin
HB-Mix Hybridisierungs-Mix
HCl Salzsäure
HO-1 Häm-Oxygenase-1
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN VII
i.c. intracerebral
IH Immunhistologie
IIFT Indirekter Immunfluoreszenztest
IL Interleukin
ISH In-situ-Hybridisierung
kb Kilobasen
kDa Kilo Dalton
l Liter
M Molarität
mA MilliAmpere
MHC major histocompatibility complex,
Haupthistokompatibilitätskomplex
min Minuten
ml Milliliter
mRNA messenger RNA
MW molecular weight, Molekulargewicht
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
n Anzahl
N Normalität
NBF neutral buffered formalin, neutralgepuffertes Formalin
NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
Nr. Nummer
NTC no template control, PCR-Negativkontrolle
ntg nicht transgen (Wildtyp)
obB ohne besonderen Befund
OD optische Dichte
ORF open reading frame, offenes Leseraster
p Primer
PBS phosphate buffered saline,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
PFA Paraformaldehyd
PHB-Mix Prähybridisierungs-Mix
p.i. post infectionem, nach Infektion
PIPES Piperazin-N,N’bis[2-ethansulfatsäure]
PLP Perjodat-Lysin-Paraformaldehyd
PS Pferdeserum
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RNP ribonucleoprotein, Ribonukleoprotein
rpm rounds per minute, Umdrehungen pro Minute
RSq RSquared, Abweichung der Standardpunkte von der Standardkurve
RT Reverse Transkriptase
RTr Reverse Transkription
s sense
SS Schweineserum
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN VIII
SSC standard saline citrate, Standard-Natriumacetat
ssDNA single strand DNA, Einzelstrang-DNA
-ssRNA negativ orientierte genomische virale RNA
+ssRNA positiv orientierte virale RNA (Antigenom und mRNA)
T Thymin
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borsäure-EDTA
TBS tris buffered saline, trisgepufferte Kochsalzlösung
TEA Triethanolamin
tg +/+ homozygot TNF-transgen
tg +/- heterozygot TNF-transgen
TNF Tumor-Nekrose-Faktor-α
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UV Ultraviolett
V Volt
X-Phosphat s. BCIP
ZNS Zentrales Nervensystem
ZS Ziegenserum
PUBLIKATIONSLISTE IX
Teile der Habilitationsschrift wurden für folgende Publikationen verwandt:
Herden C, Schluesener H, Richt JA (2005):
Expression of AIF-1 and HO-1 in brains of rats after experimental infection with the neurotropic Borna disease virus.
Neuropathol Appl Neurobiol 31: 512-521
Porombka D, Herzog S, Baumgärtner W, Herden C (2006):
Preservation of RNA and destruction of infectivity in microdissected rat brains infected with the Borna disease virus.
J Virol Meth 135: 247-253
Schaudien D, Baumgärtner W, Herden C (2007):
High preservation of DNA standards diluted in 50% glycerol.
Mol Diagn Pathol 16: 153-157
Gennet N, Herden C, Bupp VJ, Quin JP, Kipar A (2008):
Expression of activity-dependent neuroprotective protein in the brain of adult rats.
Histology Histopathol 23: 309-317
Porombka D, Baumgärtner W, Eickmann M, Herden C (2008a):
Implications for a regulated replication of Borna disease virus in brains of experimentally infected Lewis rats.
Virus Genes 36: 415-420
Porombka D, Baumgärtner W, Herden C (2008b):
A rapid method for gene expression analysis of Borna disease virus in neurons and astrocytes using laser microdissection and real-time RT-PCR.
J Virol Meth 148: 58-65
Werner-Keišs N, Garten W, Richt JA, Porombka D, Algermissen D, Herzog S, Baumgärtner W, Herden C (2008):
Restricted expression of Borna disease virus glycoprotein in brains of experimentally infected Lewis rats.
Neuropathol Appl Neurobiol 34: 590-602
PUBLIKATIONSLISTE X
Teile der Habilitationsschrift wurden bereits als Kongressbeiträge präsentiert:
Herden C, Schluesener HJ, Richt JA:
Expression of allograft inflammatory factor-1 and heme oxygenase-1 in brains of rats infected with the neurotropic Borna disease virus.
(7th European Congress of Neuropathology, Helsinki, Finnland, Juli 2002) Werner-Keišs N, Herden C, Richt JA, Garten W, Baumgärtner W:
Expression of Borna disease virus structural proteins in brains of experimentally infected Lewis rats.
(20th Autumn Meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Turin, Italien, September 2002)
Herden C, Fluess M, Kramer K, Schaudien D, Marchetti L, Eisel U, Richt JA, Baumgärtner W:
Experimental infection of TNFα-transgenic mice with the neurotropic Borna disease virus.
(21th Autumn Meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Dublin, Irland, September 2003)
Werner-Keišs N, Garten W, Richt JA, Baumgärtner W, Herden C:
Restricted expression of Borna disease virus glycoprotein in brains of experimentally infected Lewis rats.
(21th Autumn Meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Dublin, Irland, September 2003)
Kramer K, Schaudien D, Marchetti L, Eisel U, Richt JA, Baumgärtner W, Herden C:
Effect of TNFα-overexpression in the CNS of mice infected with the neurotropic Borna Disease Virus.
(Molekulare Neuropathologie & 49. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie, Köln, September 2004, referiert in Acta Neuropathol Berl 108: 364)
Schaudien D, Herden C, Kramer K, Marchetti L, Eisel U, Richt JA, Baumgärtner W:
Unusual degenerative changes in the brain of TNFα-transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus.
(22th Autumn Meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Olsztyn, Polen, September 2004)
Porombka D, Herzog S, Baumgärtner W, Herden C:
Preservation of RNA and destroying of infectivity in microdissected brain tissues infected with the Borna disease virus.
(50. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie, Graz, Österreich, Oktober 2005, referiert in Acta Neuropathol Berl 110: 336)
PUBLIKATIONSLISTE XI
Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Richt JA, Baumgärtner W, Herden C:
Degenerative brain lesions of TNFα-transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus.
(Brainstorming: Interdisciplinary Aspects of Neuroscience, 1st International Neuroscience Congress, Hannover, Mai 2005)
Herden C, Schaudien D, Baumgärtner W:
Stability of DNA standards diluted in 50% glycerol after multiple „freezing and thawing“ cycles.
(24th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, Edinburgh, Schottland, September 2006)
Kramer K, Porombka D, Schaudien D, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Viral spread in brains of Borna Disease Virus-infected TNF-transgenic mice.
(24th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, Edinburgh, Schottland, September 2006)
Kramer K, Porombka D, Schaudien D, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Effect of TNF-overexpression on Borna disease viral spread in TNF-transgenic mice brains.
(51. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie, Mannheim, September 2006, referiert in Acta Neuropathol Berl 112: 372)
Porombka D, Eickmann M, Garten W, Baumgärtner W, Herden C:
Regional tropism of Borna disease virus transcription and replication in different brain areas of experimentally infected Lewis rats.
(24th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, Edinburgh, Schottland, September 2006)
Schaudien S, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Role of TNF and its receptor 1 and 2 in Borna disease virus infected TNF- transgenic mice.
(51. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie, Mannheim, September 2006, referiert in Acta Neuropathol Berl 112: 372)
Porombka D, Eickmann M, Garten W, Baumgärtner W, Herden C:
Implications of cell type-specific regulation of Borna disease virus transcription efficiency in neurons and astrocytes of experimentally infected Lewis rats.
(25th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, München, September 2007)
Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Caspase-dependent and -independent apoptosis in TNF-transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus.
(25th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, München, September 2007)
PUBLIKATIONSLISTE XII
Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Cytokine profile of TNF-transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus resembles incomplete Th1 response.
(25th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, München, September 2007)
Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Impact of TNF overexpression on the cytokine profile after infection with the neurotropic Borna disease virus.
(52. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie, Greifswald, September 2007, referiert in Acta Neuropathol Berl, 114: 324)
Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C:
Up-regulation of BDNF mRNA in the hippocampus of Borna disease virus-infected TNF-transgenic mice.
(52. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie, Greifswald, September 2007, referiert in Acta Neuropathol Berl, 114: 324)
EINLEITUNG 1
1 EINLEITUNG
Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) ist eine meist sporadisch auftretende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die histopathologisch durch eine nicht eitrige Polioenzephalomyelitis gekennzeichnet ist (ZWICK, 1939; HEINIG, 1969;
DANNER, 1982; ROTT und BECHT, 1995; RICHT und ROTT, 2001; RICHT et al., 2007).
Sie tritt vornehmlich bei Pferden und Schafen in endemischen Gebieten in Zentraleuropa auf und wird durch das Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV) verursacht. In jüngeren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass auch andere Nutztiere, Haus- und Zootiere für BDV-Infektionen empfänglich sind. Die geographische Verbreitung des BDV ist ebenfalls sehr viel größer ist als bisher angenommen (HERZOG et al., 1994; ROTT und BECHT, 1995; STAEHELI et al., 2000; RICHT et al., 2007). In neueren Untersuchungen konnte eindeutig gezeigt werden, dass Menschen zwar BDV- spezifische Serumantikörper aufweisen können, der Nachweis viraler RNA jedoch vermutlich Laborkontaminationen darstellt, der eine Beteiligung des BDV an bestimmten psychiatrischen Erkrankungen des Menschen mehr als fraglich erscheinen lässt (STAEHELI, 2000; LIEB und STAEHELI, 2001; RICHT und ROTT, 2001; IKUTA et al., 2002; BODE und LUDWIG, 2003; SCHWEMMLE und BILLICH, 2004; DÜRRWALD et al., 2007).
Das BDV weist einen ausgeprägten Neurotropismus und ein nicht zytolytisches Wachstum in der Zellkultur auf und induziert sowohl in vivo als auch in vitro eine persistierende Infektion (RICHT und ROTT, 2001; DE LA TORRE, 2002a, b). Die zugrunde liegenden Mechanismen, insbesondere die In-vivo-Strategien des Virus zur Ausbreitung im ZNS, Induktion der persistierenden Infektion und Vermeidung einer erfolgreichen antiviralen Immunabwehr sind derzeit immer noch unzureichend verstanden.
Innerhalb des Neurotropismus scheinen die eindeutige Präferenz für definierte Gehirngebiete und Zelltypen sowie deren Reaktionsmuster eine wesentliche Rolle für das Überleben des BDV im ZNS zu spielen. Daher war es Ziel der vorliegenden Habilitationsschrift, virale Ausbreitungs- und Persistenzmechanismen, Replikations- und Transkriptionsstrategien sowie zelluläre Virus-Wirts-Beziehungen anhand experimentell infizierter Lewis-Ratten näher zu untersuchen und durch eine Überexpression des proinflammatorischen Zytokins Tumor-Nekrose-Faktors-α (TNF) im Mausmodell zu modulieren. Da viralen Strukturproteinen entscheidende Funktionen bei der Virusausbreitung, Determination des Zelltropismus sowie Induktion der antiviralen Abwehr zugeschrieben werden und sie auch in die Regulation der Replikation und Transkription eingreifen können, wurden insbesondere die Expressionsstrategien des viralen Glykoproteins (BDV-GP) und Matrixproteins (BDV-M) untersucht.
EINLEITUNG 2
Die typische experimentelle BDV-Infektion von adulten Lewis-Ratten führt, wie auch im natürlich infizierten Wirt, zu einer nicht eitrigen Meningoenzephalitis mit Viruspersistenz im ZNS und stellt somit ein hervorragendes Modell zu Erforschung oben genannter Fragestellungen dar. Die klinische Erkrankung wird nicht durch die Virusreplikation selbst, sondern durch eine T-Zell-vermittelte, immunpathologische Reaktion im Sinne einer Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ ausgelöst, an der CD4+ als auch CD8+
T-Zellen maßgeblich beteiligt sind (NARAYAN et al., 1983a, b; DESCHL et al., 1990;
RICHT et al., 1989, 1994; STITZ et al., 2002). Die entzündlichen Veränderungen induzieren daher keine protektive Immunabwehr mit Viruseliminierung. Das BDV breitet sich typischerweise disseminiert im gesamten ZNS aus, wobei ein Tropismus zu bestimmten Gehirngebieten, wie dem limbischen System, zu beobachten ist. Diese Affinität kann je nach der zur Infektion verwendeten Viruspräparation sogar nur zu einer restriktiven Virusausbreitung im Gehirn führen (GOSZTONYI et al., 1993; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; HERDEN et al., 2000b). Die Mechanismen der Virusausbreitung und Persistenz beinhalten vermutlich eine gezielte Regulation der Virusreplikation, Transkription und Proteinexpression, wobei spezifische Einflüsse der jeweiligen Gehirnregion und des infizierten Zelltyps anzunehmen sind.
Die experimentelle BDV-Infektion von Mäusen, insbesondere von genetisch veränderten Tieren, wird heute ebenfalls zum Studium der Pathogenitätsmechanismen genutzt (HALLENSLEBEN et al., 1998; HAUSMANN et al., 2001). Im Mausmodell sollen CD8+ T Zellen die Haupteffektorzellen innerhalb des immunpathogenen Prozesses darstellen (HAUSMANN et al., 2001, 2005b; ENGELHARDT et al., 2005). Die in dieser Habilitation verwendeten Mauslinien zeigen eine selektive neuronale Überexpression von TNF in definierten Gehirngebieten, in denen auch BDV nach experimenteller Infektion regelmäßig zu finden ist, so dass eine gegenseitige Beeinflussung zu erwarten war. Durch die gezielte Infektion homozgoter und heterozygoter TNF-transgener Tiere konnte der Effekt verschieden hoher TNF-Spiegel im Gehirn beobachtet werden, da die neurodegenerativen und neuroprotektiven Wirkungen des TNF als dosisabhängig gelten.
TNF stellt ein wesentliches Zytokin in den verschiedenen Phasen der BD dar und kann an der Elimination von Viren beteiligt sein. Daher stellt die experimentelle Infektion TNF- transgener Mäuse ein geeignetes ergänzendes Modell zur Untersuchung einer potenziellen Modulation der Ausbreitung und Persistenz des BDV sowie zellulärer Virus- Wirtsbeziehungen im Gehirn dar.
LITERATURÜBERSICHT 3 2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 VORKOMMEN UND EPIDEMIOLOGIE DER BORNASCHEN KRANKHEIT 2.1.1 Bornasche Krankheit
Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) ist eine seit über 200 Jahren bekannte Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS; AUTHENRIETH, 1823; WÖRZ, 1858, zitiert nach HEINIG, 1969; ZWICK, 1939). Diese auch als „Hitzige Kopfkrankheit der Pferde“ oder
„Schlafsucht der Pferde“ bezeichnete Erkrankung ist histopathologisch durch eine nicht eitrige Poliomeningoenzephalitis gekennzeichnet, die das Korrelat der viral induzierten immunpathologischen Vorgänge darstellt (ZWICK, 1939; HEINIG, 1969; NARAYAN et al., 1983a; ROTT und BECHT, 1995; RICHT und ROTT, 2001; STITZ et al., 2002; RICHT et al., 2007). Die BD und das infektiöse Agens, das Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV), verdanken ihren Namen einer Epidemie unter Kavalleriepferden im Kreis Borna in Sachsen zwischen 1894 und 1896 (ZWICK, 1939). JOEST und DEGEN erhielten bereits Anfang des 20. Jahrhunderts durch den Nachweis intranukleärer Einschlußkörperchen erste Hinweise auf eine Virusätiologie (JOEST und DEGEN, 1909, 1911). ZWICK und SEIFRIED (ZWICK und SEIFRIED, 1925; ZWICK et al., 1927) gelang der Beweis der viralen Genese durch die experimentelle Übertragung der BD vom Pferd auf das Kaninchen und zurück auf das Pferd. Das BDV weist einen ausgeprägten Neurotropismus und sowohl in vitro als auch in vivo eine hohe Adaptation an einen nicht zytolytischen Vermehrungszyklus auf (DANNER und MAYR, 1979; HERZOG und ROTT, 1980; LUDWIG et al., 1988; DUCHALA et al., 1989).
2.1.2 Wirtsspektrum und Epidemiologie
Lange Zeit galten Pferde und Schafe als klassische Wirte für die natürliche BDV-Infektion.
Das Wirtsspektrum, die geographische Verteilung sowie die Seroprävalenz scheinen jedoch größer und weiter verbreitet als ursprünglich angenommen (HERZOG et al., 1994; ROTT und BECHT, 1995; STAEHELI et al., 2000; RICHT et al., 2007). Neueste Berichte lassen Zweifel an dem Vorkommen von BDV-Infektionen außerhalb endemischer Gebiete aufkommen und verweisen auf die Möglichkeit von Laborkontaminationen beim Nachweis viraler Gensequenzen (DÜRRWALD et al., 2006). Die klassische BD bei Pferden weist einen endemischen Charakter mit saisonal gehäuften Ausbrüchen in Frühling und Frühsommer auf. Als endemische deutsche Gebiete gelten Hessen, Baden-Württemberg, Bayern und Sachsen, weitere Endemiegebiete existieren in der Schweiz, Liechtenstein und Österreich (ZWICK, 1939; HEINIG, 1969; METZLER et al., 1979; DANNER, 1982; HERZOG et al., 1994; WEISSENBÖCK et al., 1998; CAPLAZI et al., 1999; KOLODZIEJEK et al., 2005).
Daneben gibt es unbestätigte Berichte von klinischen Erkrankungen von Pferden in Japan und Russland (TANIYAMA et al., 2001; WEISSENBÖCK et al., 2002; YUROV et al., 2005).
Das geographisch limitierte Vorkommen der klinisch manifesten BD und die jahreszeitlich
LITERATURÜBERSICHT 4
erhöhte Inzidenz der BD deuten auf die Existenz eines oder mehrerer Erregerreservoire hin (STAEHELI et al., 2000; KOLODZIEJEK et al., 2005; DÜRRWALD et al., 2006). Die meisten Studien zum Vorkommen des BDV in Wildnagerbeständen verliefen bislang negativ (VAHLENKAMP et al., 2002; KOLODZIEJEK et al., 2005; HERZOG, persönliche Mitteilung).
Jüngst wiesen HILBE et al. (2006) erstmals BDV-Antigen und virale RNA in Feldspitzmäusen (Crocidura leucodon) aus einem Endemiegebiet in der Schweiz nach.
Natürliche BDV-Infektionen mit klinischer Erkrankung wurden indessen auch bei einem Hund, einem Luchs, bei Kaninchen, Rindern, anderen Equiden, Ziegen und Zootieren wie Lama, Alpaka, Zwergflußpferd, Faultier und Vari beschrieben (ERNST und HAHN, 1927;
OTTA und JENTZSCH, 1960; IHLENBURG, 1962; METZLER et al., 1978; BODE et al., 1994; CAPLAZI et al., 1994; SCHÜPPEL et al., 1994, 1995; WEISSENBÖCK et al., 1998;
DEGIORGIS et al., 2000). Bei Katzen mit dem Bild der staggering disease sollen BDV- spezifische Serumantikörper, BDV-Antigene und infektiöses Virus im Gehirn auftreten (LUNDGREN et al., 1995a, b; NOWOTNY und WEISSENBÖCK, 1995; JAUNIN et al., 1998), was in anderen Studien nicht bestätigt werden konnte (NOWOTNY und WEISSENBÖCK, 1995; HERZOG und HERDEN, persönliche Mitteilung).
In verschiedenen Studien wurde eine Seroprävalenz bei klinisch gesunden Pferden in ganz Deutschland, der Schweiz, Liechtenstein, Österreich sowie außerhalb endemischer Gebiete, wie z.B. der Türkei, Frankreich, Polen, Finnland, Frankreich, Luxemburg, Indien, Iran, Israel, Japan, Russland, China und den USA beschrieben (ROTT und BECHT, 1995; STAEHELI et al., 2000; RICHT und ROTT, 2001; KINNUNEN et al., 2007; RICHT et al., 2007). Weiterhin wurden aus z.B. Pferde-, Katzen-, und Luchsgewebe aus nichtendemischen Gebieten Virussequenzen veröffentlicht, die hohe Homologien zu BDV-Laborstämmen aufweisen (DÜRRWALD et al., 2006). Dies verdeutlicht die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen zum Vorkommen der BD außerhalb der klassischen Endemiegebiete, insbesondere da detailierte Daten zur klinischen Erkrankung fehlen.
Eine ätiologische Beteiligung des BDV bei bestimmten psychiatrischen Erkrankungen des Menschen (Schizophrenie, Depressionen, chronisches Erschöpfungssyndrom) und die mögliche Bedeutung als Zooanthroponose wurden lange Zeit kontrovers diskutiert (ROTT et al., 1985; RICHT et al., 1997b; BECHTER et al., 1987; LIEB und STAEHELI, 2001;
CARBONE, 2001; STAEHELI et al., 2000; STAEHELI, 2002; BODE und LUDWIG, 2003;
DÜRRWALD et al., 2007). In Seren und Liquor cerebrospinalis von Humanpatienten wurden BDV-spezifische Antikörper nachgewiesen (AMSTERDAM et al., 1985; ROTT et al., 1985, 1991; BECHTER et al., 1987; BODE et al., 1992, 1993; RICHT et al., 1993c; WALTRIP et al., 1995; SAUDER et al., 1996; TERAYAMA et al., 2003). Die Relevanz dieser serologischen Befunde wurde in Frage gestellt, da in multizentrischen Ringversuchen Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen auftraten und die humanen BDV-spezifischen
LITERATURÜBERSICHT 5 Antikörper meist eine niedrige Avidität besitzen (NÜBLING et al., 1999; ALLMANG et al., 2001). Die Spezifität der humanen Antiseren gilt jedoch inzwischen als gesichert (BILLICH et al, 2002; SCHWEMMLE und BILLICH, 2004). Über den Nachweis von viraler RNA aus peripheren Blutmonozyten und dem Gehirn psychiatrisch erkrankter Patienten wurde ebenfalls widersprüchlich berichtet (BODE et al., 1996; DE LA TORRE et al., 1996; RICHT et al., 1997a; PLANZ et al., 1999; NAKUMURA et al., 2000; MIRANDA et al., 2006; WOLFF et al., 2006). Aufgrund hoher Sequenzübereinstimmungen mit BDV-Laborstämmen wurde bereits über eine Laborkontamination diskutiert (SCHWEMMLE et al., 1999a; STAEHELI et al. 2000; STAEHELI, 2002; PLANZ et al., 2003b; HOFER et al., 2006), was sich in einer Überprüfung aller 193 publizierten, aus humanem Gewebe isolierten Virussequenzen weiter bestätigte (DÜRRWALD et al., 2007).
2.2 EXPERIMENTELLE BDV-INFEKTION VON LEWIS-RATTEN
Die experimentelle BDV-Infektion ist bei einem weiten, phylogenetisch unterschiedlichen Wirtsspektrum beschrieben (ROTT und BECHT, 1995; RICHT et al., 1997b; LUDWIG und BODE, 2000; STAEHELI et al., 2000). So lässt sich das BDV experimentell auf Ratten, Mäuse, Hamster, Spitzhörnchen, Gerbils, Kaninchen, Meerschweinchen Hühner und Rhesusaffen übertragen (ZWICK und SEIFRIED, 1925; ZWICK et al., 1927, 1939; ANZIL et al., 1973; SPRANKEL et al., 1978; STITZ et al., 1980; NARAYAN et al., 1983a, b; KAO et al., 1984; RUBIN et al., 1993; HALLENSLEBEN et al., 1998; WATANABE et al., 2001). Die Empfänglichkeit der Tiere variiert je nach Spezies und verwendeter Viruspräparation (RICHT et al., 1997b; HERDEN et al. 2000b). Als hochempfänglich für die experimentelle BDV- Infektion gelten Kaninchen, Lewis-Ratten und Meerschweinchen (ROTT und BECHT, 1995), die typische neurologische Symptome entwickeln. Bestimmte Mausstämme, Hamster, Frettchen und black hooded Ratten zeigen eine asymptomatische Infektion mit Viruspersistenz (ANZIL et al., 1973; KAO et al., 1984; HERZOG et al., 1991; ROTT und BECHT et al., 1995; HALLENSLEBEN et al., 1998). Spitzhörnchen entwickeln trotz Viruspersistenz nur Störungen im Sozialverhalten (SPRANKEL et al., 1978). Je nach verwendeter Viruspräparation können neben der klassischen neurologischen Erkrankung auch lediglich Paralysen oder eine Fettsucht auftreten (BIESENBACH et al., 1990; HERDEN et al., 2000b). Dies unterstreicht die hohe biologische Variabilität des BDV. Aufgrund ihrer Empfänglichkeit stellen Lewis-Ratten das klassische Tiermodell zum Studium der Pathogenese und der Immunpathogenese der BDV-Infektion dar.
2.2.1 Klinik
Nach experimenteller Infektion von Lewis-Ratten variiert das Krankheitsbild je nach Alter der Tiere, Immunstatus, Art der Virusapplikation (intracerebral i.c., intranasal i.n.) und verwendeter Viruspräparation. Adulte, immunkompetente Lewis-Ratten entwickeln typischerweise einen biphasischen Verlauf der BD (NITZSCHKE, 1963; NARAYAN et al.,
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1983a, b). Nach i.c. Inokulation zeigen die Tiere etwa zwischen 20 und 40 Tagen post infectionem (p.i.) Aggressivität, Hyperaktivität, Hypersensitivität, Desorientierung, Ataxie und eventuell auch Paralysen. Danach geht die BD bis etwa Tag 60 p.i. in die die zweite, chronische Phase mit Apathie, Somnolenz und Viruspersistenz über. Bis zum Tag 100 p.i.
zeigen die Ratten zunehmend Erblindung (NARAYAN et al., 1983a). Je nach verwendeter Viruspräparation können im Anschluss an die akute Phase auch Paresen und Paralysen der Hintergliedmaßen (BIESENBACH et al., 1990) oder eine Obesitas auftreten (NARAYAN et al., 1983b; KAO, 1985; BREDTHAUER et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995;
ROTT und BECHT, 1995; HERDEN et al., 2000b). Eine Obesitas kann auch ohne die vorherige akute neurologische Symptomatik vorkommen (HERDEN et al., 2000b).
Bei neonatal immuninkompetenten Lewis-Ratten kommt es nach experimenteller BDV- Infektion zu einer Viruspersistenz ohne auffällige neurologische Symptome (HIRANO et al., 1983; NARAYAN et al., 1983a), es treten aber Störungen der emotionalen und kognitiven Funktionen, im Sozialverhalten sowie der physiologischen und neurologischen Entwicklung auf (RUBIN et al., 1999 a, b; PLETNIKOV et al., 1999, 2001; LANCESTER et al., 2007).
2.2.2 Pathogenese
Pathologisch-anatomische und histopathologische Befunde
Als einziger pathologisch-anatomischer Befund bei BDV-infizierten Ratten tritt zu späten Zeitpunkten p.i. ein Hydrocephalus internus auf (NARAYAN et al., 1983a, b; KAO, 1985;
IRIGOIN et al., 1990; HERZOG et al., 1991). Bei natürlich und experimentell infizierten, an BD erkrankten Tieren wird regelmäßig eine nicht eitrige Poliomeningoenzephalitis und Myelitis beobachtet (JOEST und DEGEN, 1911; DESCHL et al., 1990; BILZER et al., 1995;
GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; ROTT und BECHT, 1995; RICHT et al., 2007). Die intranukleären, azidophilen Joest-Degenschen-Einschlußkörperchen in Ganglienzellen und Astrozyten sind pathognomonisch für eine BDV-Infektion (JOEST und DEGEN, 1909), treten jedoch bei experimentell als auch bei spontan infizierten Tieren nur noch inkonstant auf (HERDEN et al., 1999, 2000b; RICHT et al., 2007).
Bei experimentell infizierten Ratten korreliert der Beginn der klinischen Symptomatik mit dem Auftreten der entzündlichen Veränderungen im ZNS, wobei die bevorzugte Lokalisation der Läsionen von der verwendeten Viruspräparation und der Art der Inokulation abhängig ist.
Nach Infektion mit dem die biphasische BD induzierenden Virusstock sind vor allem Hippocampus, Thalamus, Bulbus olfactorius, Cortex cerebri, Nucleus caudatus sowie periventrikuläre Gebiete, besonders in der Medulla oblongata, betroffen (NARAYAN et al., 1983a, b; DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000b). Demyelinisierungen werden interessanterweise nicht beobachtet. Die Enzephalitis erreicht ihr Maximum ca. zwischen 30 und 40 Tagen p.i., typischerweise tritt eine massive perivaskuläre, parenchymatöse und meningeale Infiltration von Makrophagen, CD4+ und CD8+ T-Zellen auf, an der in späteren
LITERATURÜBERSICHT 7 Stadien der Infektion auch Plasmazellen beteiligt sind (NARAYAN et al., 1983a, b; DESCHL et al., 1990; STITZ et al., 1991a; HERDEN et al., 2000b). Bei adulten Lewis-Ratten nimmt in der späten Phase der BD die entzündliche Infiltration trotz disseminierter Virusausbreitung im ZNS ab (NARAYAN et al., 1983a, b; DESCHL et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; HERDEN et al., 2000b). Je nach verwendeter Viruspräparation können mit Zunahme der entzündlichen Infiltrate neuronale Nekrosen, vorwiegend in frontalem und parietalem Cortex, der CA3-Region oder Gyrus dentatus des Ammonshorn mit nachfolgender Ausdünnung der jeweiligen Ganglienzellschicht auftreten (DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000b). Nach BDV-Infektion adulter Lewis-Ratten wird auch eine nicht eitrige Retinitis mit progressiver Zerstörung der Photorezeptoren und der Körnerschicht mit Erblindung der Tiere beobachtet (NARAYAN et al., 1983b; GEISS et al., 1990; KACZA et al., 2000).
Im Gegensatz dazu verläuft die experimentelle BDV-Infektion von neonatal infizierten immuninkompetenten Lewis-Ratten als tolerierte, persistierende Infektion ohne auffällige entzündliche Veränderungen im ZNS. Im Gyrus dentatus sind Ganglienzelldegenerationen mit konsekutiver Ausdünnung der Körnerzellschicht, im Cortex cerebri eine Ausdünnung von Neuronen und im Cerebellum Verlust von Purkinjezellen sowie eine Ausdünnung der Molekularschicht und der inneren Granularzellschicht zu beobachten (NARAYAN et al., 1983a, b; MORALES et al., 1988; HORNIG et al., 1999; RUBIN et al., 1999a, b;
GONZALES-DUNIA et al., 2000; LANCESTER et al., 2007).
Residente Gehirnzellen und neuroprotektive Faktoren
Die Aufregulierung der entzündlichen Infiltrate im Gehirn ist bei der adult infizierten Lewis- Ratte auch regelmäßig von einer Mikrogliaaktivierung und Astrogliose begleitet (DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000b). Trotz Rückgang der Immunzellinfiltration in der späten Phase der BD besteht die Astrogliose weiter und die aktivierten Mikroglia/Makrophagen gehen ebenfalls nur leicht zurück (DESCHL et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995;
HERDEN et al., 2000b).
Bei neonatal infizierten Tieren tritt ebenfalls eine reaktive Astrogliose und Mikrogliaaktivierung auf, die auf die virusinduzierte Zytokinexpression residenter Gehirnzellen zurückgeführt wird (WEISSENBÖCK et al., 2000; DIETZSCHOLD et al., 2001).
Neue Studien haben gezeigt, dass diese Mikrogliaaktivierung auf komplexen Interaktionen mit BDV-infizierten Neuronen und Astrozyten beruht (OVANESOV et al., 2006, 2008).
Zum Nachweis von aktivierten Astrozyten wird regelmäßig die Expression des sauren Gliafaserproteins (GFAP) sowie die typische Morphologie aktivierter Astrozyten herangezogen (DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000b; VINTERS und KLEINSCHMIDT-DEMASTERS, 2008). Die Mikrogliaaktivierung nach BDV-Infektion wurde bisher mittels des rattenspezifischen Markers ED1 oder OX42 durchgeführt (DESCHL et al., 1990; WEISSENBÖCK et al., 2000; SOLBRIG et al., 2002). ED1 gilt als CD68-Homolog und
LITERATURÜBERSICHT 8
OX42 stellt den Komplement-Rezeptor Typ 3 dar. Untersuchungen mittels anderer Marker, wie der Einsatz des allograft inflammatory factor-1 (AIF-1), der schon in vielen anderen Modellen wie traumatische Gehirnschäden, experimenteller autoimmuner Enzephalitis (EAE), experimenteller autoimmuner Neuritis und Uveitis (EAN, EAU) erfolgreich zur Bestimmung des funktionellen Status der Makrophagen/Mikroglia eingesetzt wurde (SCHLUESENER et al., 1998; POSTLER et al., 2000), lagen bislang für die experimentelle BDV-Infektion nicht vor. AIF-1 stellt ein durch Interferon γ (IFNγ) induzierbares, Ca2+- bindendes Protein dar, das eventuell identisch zu dem ionisierten Ca2+-bindendem Adaptor Protein Iba-1 ist. Iba-1 wurde bisher zur Darstellung der Mikrogliaaktivierung nach Infektion mit Influenzavirus und jüngst auch bei BDV-Infektionen eingesetzt (IMAI et al., 1996; UTANS et al., 1996; MORI et al., 2000; DEININGER et al., 2002; OVANESOV et al., 2006, 2008).
Die Rolle der residenten Gehirnzellen, insbesondere für die Sekretion neuroprotektiver Faktoren während der BDV-Infektion ist bislang wenig untersucht. Häufig werden interessanterweise derartige Faktoren nicht nur von residenten Zellen sondern auch von den einwandernden Immunzellen, zumindest zeitweise, sezerniert (KERSCHENSTEINER et al., 1999; SCHLUESENER und SEID, 2000; HERDEN et al., 2005).
Häm-Oxygenase-1 (HO-1) oder auch heat shock protein-32, ist ein induzierbares Enzym des Häm-Abbaus in Kohlenmonoxid und Biliverdin (MAINES, 1997; PLATT und NATH, 1997). Kohlenmonoxid ist an der Modulation entzündlicher Prozesse über Regulation der cGMP-Synthese, NO-Synthasen und Cyclooxygenasen involviert (MAINES, 1997; SNYDER et al., 1998). Im Gehirn kann HO-1 je nach Stimulus und Insult von Mikroglia, Astrozyten und Neuronen sowie einwandernden Makrophagen exprimiert werden (KOISTINAHO et al., 1996; MATZ et al., 1997; MATSUOKA et al., 1998a; SCHLUESENER und SEID, 2000). HO- 1 kommt bei neuroinflammatorischen, neurodegenerativen und neurotraumatischen Prozessen vor, wie z.B. Ischämien, Blutungen, EAE, Alzheimerscher Krankheit und Parkinsonscher Krankheit (SCHIPPER et al., 1995; KOISTANAHO et al., 1996; MATSUOKA et al., 1998b; PAPOLLA et al., 1998; SCHIPPER et al., 1998; SCHLUESENER und SEID, 2000). Dabei wirkte die HO-1-Überexpression immer protektiv gegen oxidativen Stress, so dass eine potenzielle neuroprotektive Funktion von HO-1 auch bei der BD in Betracht kam.
Dem brain derived neurotrophic factor (BDNF) wird eine wichtige Rolle für das Überleben und die Differenzierung von Neuronen zugewiesen, die auch das wichtigste Reservoir von BDNF darstellen (LEWIN und BARDE, 1996; HOFER et al., 1990). BDNF wirkt dabei über die Volllängen-Form des TrkB-Rezeptors (gp145trkB; KLEIN et al., 1991). Die neuroprotektive Wirkung des BDNF wurde durch BDNF-Gaben gezeigt, die eine neuronale Degeneration nach Axotomie und anderen Formen von neuronalen Schädigungen verhinderte (GRAVEL et al., 1997; KOBAYASHI et al., 1997; MCTIGUE et al., 1998).
Interessanterweise konnte bei der Multiplen Sklerose (MS) eine BDNF-Synthese auch bei
LITERATURÜBERSICHT 9 Immunzellen beobachtet werden, um axonale und neuronale Schäden zu vermeiden (KERSCHENSTEINER et al., 1999). In vitro wird BDNF nicht nur von Neuronen und reaktive Astrozyten, sondern auch von CD4+ und CD8+ T-Zellen, B-Lymphozyten und Monozyten produziert. Da Immunzellen vermutlich Neurotrophinrezeptoren exprimieren, können sie als bidirektionale Mediatoren zwischen dem ZNS und dem Immunsystem fungieren (KERSCHENSTEINER et al., 2003). Weiterhin gilt die Produktion von BDNF durch T- und NK-Zellen bei EAE ebenfalls als neuroprotektiv (HAMMARBERG et al., 2000).
Das BDV soll auch mit Neurotrophinen zur Steigerung der viralen Replikation interagieren, da neurotrophe Faktoren wie der nerve growth factor (NGF) die BDV-Replikation in Neuronen und Gliazellen fördern (CARBONE et al., 1993; IBRAHIM et al., 2002). Andere Studien weisen auf Interaktionen des BDV mit der Signalkaskade Ras/MEK/ERK hin, wobei eine Inhibition dieser Kaskade die Virusausbreitung hemmte, während die BDV-Infektion diese Signalkaskade aktivierte (CARBONE et al., 1993; HANS et al., 2001, 2004; PLANZ et al., 2001b). Daher scheint das BDV Neurotrophin-Signalwege zur Steigerung der Virusproduktion zu nutzen (GONZALEZ-DUNIA et al., 2005).
Das activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) ist ein vasoactive intestinal peptide (VIP)-reguliertes Gen, das eine wichtige Rolle während der Gehirnentwicklung spielt (PINHASOV et al., 2003). ADNP besitzt die kurze Aminosäurensequenz NAP, die dem aktiven Peptid ADNF-14 gleicht, das von dem glialen Faktor activity-dependent neurotrophic factor (ADNF) abstammt. ADNF ist ein Mediator der VIP-vermittelten Neuroprotektion (BRENNEMAN et al., 1998). Da ADNF-14 eine starke neuroprotektive Wirkung besitzt, wurde dies auch für NAP vermutet und mittlerweile bestätigt, wobei NAP in vivo bisher nicht nachgewiesen wurde (GOZES et al., 2000; BENI-ADANI et al., 2001; LEKER et al., 2002).
Daher gilt auch ADNP als neuroprotektiv, wobei der Wirkmechanismus derzeit nicht bekannt ist (GOZES et al., 2000). Dies wurde durch die Veränderungen der ADNP-mRNA-Werte nach Stress und Insulten bestätigt (SIGALOV et al., 2000; ZALTZMAN et al., 2004). ADNP- mRNA wurde bisher in Hippocampus, Cortex cerebri und Cerebellum sowie in nicht neuralem Gewebe nachgewiesen (BASSAN et al., 1999; ZAMOSTIANO et al., 2001). Jüngst konnte ADNP in vivo in Neuronen, aber auch Astrozyten und anderen Gliazellen detektiert werden (GENNET et al., 2008). Untersuchungen zur ADNP-Expression nach Virusinfektionen des ZNS, insbesondere nach BDV-Infektionen, liegen bislang nicht vor.
Immunpathogenese
Die klinische Symptomatik der BD ist keine direkte Folge der Virusinfektion, sondern beruht auf virusinduzierten immunpathologischen Vorgängen, die einer Hypersensibilitätsreaktion vom Typ IV entsprechen (NARAYAN et al., 1983a, b; RICHT et al., 1989, 1994, 2007; RICHT und ROTT, 2001; DESCHL et al., 1990; STITZ et al., 1991, 2002). Dies konnte anhand zahlreicher experimenteller Studien an neugeborenen, athymischen, Cyclosporin-A-,
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Cyclophosphamid- oder Dexamethason-immunsupprimierten Lewis-Ratten gezeigt werden, die nach BDV-Infektion keine auffälligen klinischen Symptome trotz hoher Antikörpertiter, Viruspersistenz und hohen Infektiositätstitern im Gehirn aufwiesen (NARAYAN et al., 1983a, b; HERZOG et al., 1984, 1985; MORALES et al., 1988; CARBONE et al., 1991b; STITZ et al., 1989, 1991; RICHT und ROTT, 2001). Adult infizierte, immunkompetente Lewis-Ratten hingegen entwickeln regelmäßig eine Meningoenzephalitis und klinische Symptome. Die zentrale Bedeutung von T-Zellen für die Immunpathogenese der BD wurde durch den adoptiven Transfer von Milzzellen immunkompetenter, BDV-infizierter Spendertiere auf immuninkompetente BDV-infizierte Tiere bewiesen, der entzündliche Läsionen und klinische Symptome hervorrief (NARAYAN et al., 1983a, b; STITZ et al., 1989). Die Übertragung von Seren von BDV-infizierten Tiere zeigte keine Wirkung (NARAYAN et al., 1983a, b; HERZOG et al., 1985; STITZ et al., 1989). Zur Rolle neutralisierender Antikörper liegen kontroverse Daten vor. So verhinderte ein Serumtransfer bei immunsupprimierten Lewis-Ratten zwar nicht die persistierende ZNS-Infektion, begrenzte jedoch die Virusausbreitung auf das neuronale Gewebe (STITZ et al., 1998). In anderen Studien wurden neutralisierende Antikörper wenn erst zu späten Zeitpunkten p.i. beobachtet (RICHT und ROTT, 2001).
Die beteiligten Immunzellen bei adulten, immunkompetenten Ratten bestehen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen und Makrophagen, zu späteren Zeitpunkten p.i. sind auch vermehrt B-Zellen und Plasmazellen zu finden (NARAYAN et al., 1983a; DESCHL et al., 1990). Dabei sind Makrophagen/aktivierte Mikrogliazellen und CD4+ T-Zellen über den gesamten Zeitraum der BDV-Infektion dominant, während CD8+ T-Zellen seltener auftreten (DESCHL et al., 1990).
Antigenspezifität für das virale Nukleoprotein konnte sowohl für CD4+ T-Zellen (RICHT et al., 1994), als auch für CD8+ T-Zellen (PLANZ et al., 1995, 2001a; PLANZ und STITZ, 1999;
STITZ et al., 1995, 2002) erzielt werden. Sowohl CD4+ T-Zellen als auch CD8+ T-Zellen wird eine wichtige Rolle bei den immunpathogenen Vorgängen zugesprochen (RICHT et al., 1994; PLANZ et al., 1995; STITZ et al., 1992, 2002). So führt der Transfer virusspezifischer CD4+ T-Zelllinien in immunsupprimierte Trägertiere zu klinischen Symptomen und entzündlichen Veränderungen im ZNS; eine Übertagung dieser Zellen vor der BDV-Infektion kann die BD verhindern und das Virus eliminieren (RICHT et al., 1994). Dies spricht dafür, dass CD4+ T-Zellen zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion protektiv wirken, aber einen immunpathologischen Mechanismus hervorrufen, wenn bereits viele Zellen infiziert sind (RICHT et al., 1994; NÖSKE et al., 1998). Inwieweit die Viruseliminierung durch die Gabe von CD4+ T-Zellen vor der Infektion auf einer perforinvermittelten und durch CD4+ T-Zellen aktivierten CD8+ T-Zellwirkung beruht (NÖSKE et al., 1998), bedarf weiterer Abklärung.
Durch die Applikation monoklonaler Antikörper gegen CD4+ T-Zellen vor und nach BDV- Infektion wurden die klinischen Symptome und die entzündlichen Läsionen im ZNS verringert und traten verzögert auf (STITZ et al., 1992). CD8+ T-Zellen aus Gehirnen erkrankter Ratten
LITERATURÜBERSICHT 11 und Mäuse weisen in vitro eine zytolytische Aktivität gegenüber BDV-infizierten Zellen bzw.
virusantigenexprimierenden Zellen auf (PLANZ et al., 1993; HAUSMANN et al., 1999;
SCHAMEL et al., 2001), die in vivo jedoch nicht beobachtet werden kann. Durch die Depletion von CD8+ T-Zellen kann bei der Ratte die klinische BD und die entzündlichen Veränderungen verzögert werden (STITZ et al., 1992, 2002). Weiterhin soll die Infiltration von CD8+ T-Zellen ins Gehirn einen direkten Zusammenhang mit der Schwere des Krankheitsverlaufes aufweisen (FURRER et al., 2001).
Zytokine spielen in der Pathogenese der BD unumstritten eine zentrale Rolle. Bei Dexamethason-immunsupprimierten Ratten ließen sich nach BDV-Infektion erhöhte mRNA- Level von TNF, Interleukin (IL)-6, macrophage inflammatory protein (MIP)-1β und dem CXC- Chemokin mob-1 nachweisen, was als initiale Zytokinantwort der residenten Zellen bewertet wird (MORIMOTO et al., 1996). Nach BDV-Infektion adulter immunkompetenter Lewis- Ratten liegt eine Aufregulierung der mRNA der proinflammatorischen Zytokine TNF, IL-1α, IL-6, TNF und Interferon (IFN)γ vor, die mit der Stärke der Enzephalitis korreliert (SHANKAR et al., 1992; STITZ et al., 1995; HATALSKI et al., 1998). In der späten Phase der Infektion geht bei der Ratte die Entzündung im ZNS trotz Viruspersistenz zurück (NARAYAN et al., 1983a, b; DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000b). Dies könnte durch einen Wechsel von einer Th1- zu einer Th2-Immunantwort verursacht sein und den Übergang von der akuten in die chronische Phase der BD verursachen. Hier sollen vermehrt NK-Zellen, B-Zellen und aktivierte Mikroglia sowie hohe Mengen IL-4-spezifischer mRNA und niedrigere Werte proinflammtorischer Zytokine wie TNF vorliegen (HATALSKI et al., 1998). Da jedoch auch in dieser Phase der BDV-Infektion eine anhaltende Mikrogliaaktivierung und Astrogliose zu beobachten ist, können Zytokine wie IL-1 und TNF weiterhin eine Rolle spielen.
Detaillierte Studien zum Einfluss des TNF auf das biphasische Krankheitsgeschehen der experimentell infizierten Lewis-Ratte liegen nicht vor.
Insgesamt kann bislang eine Kontrolle der BDV-Infektion durch die Immunantwort nur durch ein Antigen-spezifisches priming oder den adoptiven Transfer BDV-spezifischer T-Zellen erreicht werden (RICHT et al., 1994; LEWIS et al., 1999; HAUSMANN et al., 2005a;
HENKEL et al., 2005).
2.3 EXPERIMENTELLE BDV-INFEKTION VON MÄUSEN
Mäuse galten lange als ungeeignetes Modell, da adult infizierte Tiere keine Enzephalitis und keine klinischen Symptome entwickeln (KAO et al., 1984; RUBIN et al., 1993).
HALLENSLEBEN et al. (1998) konnten erstmals in neonatalen BDV-infizierten Mäusen eine schwere neurologische Erkrankung erzeugen. Im Gegensatz zum Rattenmodell, bei dem eine klinische Erkrankung nur bei adult infizierten Tieren auftritt, erkranken Mäuse nur, wenn sie neonatal infiziert werden. Worauf dieser unterschiedliche Verlauf bei Mäusen und Ratten beruht, ist bislang nicht zufriedenstellend geklärt. Der Einsatz transgener Mäuse ermöglicht
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es, die Mechanismen der Immunpathogenese, insbesondere den Effekt einzelner Zytokine und Entzündungsmediatoren auf den Verlauf der BDV-Infektion gezielt zu analysieren.
2.3.1 Klinik
Neonatal BDV-infizierte Mäuse entwickeln vier bis sechs Wochen p.i. erste neurologische Symptome, ähnlich denen akut erkrankter Ratten. Bei entsprechender Empfindlichkeit des verwendeten Mausstammes treten gesträubtes Fell, Kopfschiefhaltung, Kümmern, Gewichtsverlust sowie eine abnormale Haltung der Hinterbeine auf (HALLENSLEBEN et al., 1998). Werden dagegen adulte Mäuse infiziert, verhalten sie sich klinisch unauffällig und zeigten histologisch nur minimale entzündliche Veränderungen im Gehirn (KAO et al., 1984;
RUBIN et al. 1993). Die Inzidenz und Schwere der Erkrankung neonatal infizierter Mäuse variiert je nach Mausstamm, obwohl bei allen untersuchten Mauslinien eine ähnliche Ausbreitung des BDV im Gehirn auftritt (HALLENSLEBEN et al.; 1998). Insbesondere MRL- Mäuse mit dem Haplotyp H-2K des MHCI zeigen eine besonders deutliche Empfänglichkeit mit ausgeprägten Symptomen. B10.BR-Mäuse mit dem gleichen Haplotyp zeigen jedoch keine spontane Erkrankung (HAUSMANN et al., 1999). C57BL/6- (Haplotyp H-2b) und SJL- Mäuse weisen eine dezente Symptomatik auf und wenige Tiere erkranken. CBA- und C3H- Mäuse entwickeln ebenfalls nur zu einem geringen Teil Krankheitsanzeichen, betroffene Tiere zeigen jedoch einen mit MRL-Mäusen vergleichbar schweren Krankheitsverlauf (RUBIN et al., 1993; HALLENSLEBEN et al., 1998). BALB/c Mäuse weisen eine ähnliche Inzidenz der Erkrankung wie CBA- und C3H-Mäuse auf, entwickeln jedoch nur eine moderate Klinik (HALLENSLEBEN et al., 1998).
2.3.2 Pathogenese
Pathologisch-anatomische und histopathologische Befunde
Pathologisch-anatomische Befunde sind bisher bei experimentell infizierten Mäusen nicht beobachtet worden. Die ersten klinischen Symptome treten bei BDV-infizierten Mäusen, wie bei den Ratten, parallel mit der entzündlichen Infiltration im Gehirn auf. Histologisch zeigen BDV-infizierte Mäuse mononukleäre, perivaskuläre, parenchymatöse und meningeale Infiltrate vor allem in Cortex cerebri und Ammonshorn, die in Cerebellum und Thalamus meist geringer ausgeprägt sind (HALLENSLEBEN et al., 1998; FREUDE et al., 2002).
Residente Gehirnzellen und neuroprotektive Faktoren
Nach experimenteller BDV-Infektion von Mäusen ist ebenfalls eine Schwellung der Astrozyten beobachtet worden, die jedoch nicht mit einer vermehrten GFAP-Immunreaktion einherging (HALLENSLEBEN et al., 1998). In initialen Untersuchungen an TNF-transgenen Mäusen war eine Astrogliose und deutliche Mikrogliaaktivierung in TNF-überexprimierenden Gehirnarealen zu erkennen (HERDEN et al., 2003). Bei der Maus wird prinzipiell zur Charakterisierung des Mikrogliaaktivierung meist der Marker F4/80 oder der Nachweis von MAC-1 eingesetzt, der das CD11b-Antigen darstellt. Bei BDV-infizierten Mäusen ist derzeit
LITERATURÜBERSICHT 13 die Mikrogliaaktivierung sowie das korrespondierende Expressionsprofil weder bei verschiedenen Mauslinien noch bei transgenen oder knock out Tieren für verschiedene Zytokine oder Entzündungsmediatoren detaillierter beschrieben.
Bei der BDV-Infektion von Mäusen ist die Expression verschiedener neuroprotektiver Faktoren wie BDNF, ADNP oder die Aktivierung des nukleären Faktors кB (NFкB) bisher ebenfalls nicht untersucht. Daher ist auch nicht bekannt, ob residente Gehirnzellen oder einwandernde Immunzellen diese Faktoren während der murinen BDV-Infektion exprimieren.
Immunpathogenese
Für die murine BDV-Infektion werden ebenfalls virusinduzierte, immunpathologische Mechanismen zugrunde gelegt, wobei die Ausprägung der klinischen Symptome mit der Stärke der Entzündungsreaktion korrelieren soll (HALLENSLEBEN et al., 1998). So konnte, wie bei der Ratte, gezeigt werden, dass nicht das Virus, sondern die Immunreaktion über eine Hypersensibilitätsreaktion vom Typ IV zur Entstehung der BD führt (HALLENSLEBEN et al., 1998). Die Schwere der Erkrankung soll an den Haplotyp des MHCI-Antigens gekoppelt sein, während die Empfänglichkeit für die BD auf anderen, unbekannten genetischen Faktoren beruhen soll (HALLENSLEBEN et al., 1998). Alle Mausstämme, die schwere klinische Symptome zeigen, gehören dem H-2k Haplotyp an. Ursächlich wird dies auf die Erkennung eines spezifischen T-Zellepitops (TELEISSI) des BDV-N zurückgeführt, das von den meisten infiltrierenden zytotoxischen CD8+ T-Zellen bei Mäusen des H-2k Haplotyps erkannt wird (SCHAMEL et al., 2001). Eine transgene Expression des BDV-N in Neuronen oder Astrozyten bei Mäusen mit B10.BR-Hintergrund (H-2k Haplotyp) führt per se zu keiner Erkrankung (RAUER et al., 2004). Nach BDV-Infektion wurden die transgenen Neuronen nicht infiziert, die astrozytäre BDV-N-Expression beeinflusste die Virusausbreitung jedoch nicht. Die transgene BDV-N-Expression verhindert jedoch die Induktion von BDV-N- spezifischen CD8+ T-Zellen, vermutlich auf der Basis einer Immuntoleranz.
Bei BDV-infizierten MRL-Mäusen sind CD4+ und CD8+ T-Zellen im Gehirn nachweisbar, wobei CD8+ T-Zellen vor allem Antigenspezifität für BDV-N zeigen (HAUSMANN et al., 1999; SCHAMEL et al., 2001). Studien an neonatal infizierten, CD8+ T-Zell-defizienten MRL- und C57Bl/6-Mäusen zeigten, dass die neurologischen Symptome vorwiegend auf einem CD8+ T-Zell-vermittelten Prozess beruhen (HALLENSLEBEN et al., 1998; HAUSMANN et al., 2005b). Die Kinetik der Induktion und Einwanderung der CD8+ T-Zellen in das Gehirn soll dabei die Ausprägung der klinischen BD bestimmen. Die in persistierend BDV-infizierten Mäusen nachgewiesenen BDV-N-spezifischen CD8+ T-Zellen zeigen eine verminderte funktionale Avidität, was die Entzündungsreaktion beeinflussen und die virale Persistenz begünstigen soll (ENGELHARDT et al., 2005). BDV-infizierte Neurone werden auch bei der Maus, wie bei der Ratte, nicht von T-Zellen lysiert (NARAYAN et al., 1983a; DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000b, 2003; HAUSMANN et al., 2001). So beeinflusst Perforin die
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Kinetik der Virusausbreitung oder die Ausprägung der Symptome nach BDV-Infektion von Mäusen nicht (HAUSMANN et al., 2001). Vielmehr scheinen, wie bei der Ratte, proinflammatorische Zytokine und Entzündungsmediatoren essentiell für die Entstehung der entzündlichen Veränderungen zu sein. SAUDER et al. (2000) beobachten eine starke Aufregulierung von TNF in Gehirnen BDV-infizierter Mäuse (MRL- und AGR-Mäuse). Die Überexpression von IL-12 in Mäusen mit einem weniger empfänglichen genetischen Hintergrund (C57Bl/6 x SJL) führt zu einer klinisch manifesten Erkrankung (FREUDE et al., 2002). Dieser Effekt wird vermutlich über IFNγ vermittelt, wobei IFNγ alleine keine Erkrankung auslöst, sondern nur bei Anwesenheit von IFNγ-sezernierenden Lymphozyten (HOFER et al., 2004). Anhand von hippocampalen und cerebellären slice cultures wurde gezeigt, dass IFNγ alleine noch nicht infizierte Zellen vor der Infektion schützen kann, in bereits infizierten Zellen jedoch das Virus nicht eliminieren kann (FRIEDL et al., 2004).
Hinweise auf eine neuroprotektive Wirkung des IFNγ ergaben sich durch die Infektion adulter, IFNγ-defizienter Mäuse (MRL- und BALB/c-Mäuse), da diese Tiere neurologische Symptome entwickeln; adult infizierte Wildtyptiere jedoch nicht (HAUSMANN et al., 2005b).
Die Ausschaltung der Gene für Fas/FasL, Chemokinrezeptor CXCR3 und induzierbare NO- Synthase sowie eine CXCL10-Expression (T-Zell anlockendes Chemokin) in Astrozyten beeinflusst die Virusausbreitung und Erkrankung nach BDV-Infektion in MRL-Mäusen nicht (HAUSMANN et al., 2004). Insgesamt belegen die bisherigen Studien für einige Zytokine (IL-12, IFNγ) eine Beteiligung an der Immunpathogenese der BDV, andere Faktoren (Fas/FasL, CXCR3, NO-Synthase) scheinen für die Initiierung und Aufrechterhaltung des immunpathogenen Prozesses nicht essentiell zu sein. Ob eine TNF-Überexpression oder ein knock out des TNF-Gens die Immunpathogenese der BD modulieren, ist nicht untersucht.
2.4 NATÜRLICHE BDV-INFEKTIONEN 2.4.1 Klinik
Natürliche Infektionen sind schon seit langem bei Pferd und Schaf bekannt (ZWICK, 1939;
HEINIG, 1969; DANNER, 1982; ROTT und BECHT, 1995; RICHT und ROTT, 2001; RICHT et al. 2007). Die Mehrheit der infizierten Tiere entwickelt eine klinisch inapperente Infektion (HERZOG et al., 1994; ROTT und BECHT, 1995; GRABNER et al., 2002), was durch die Seroprävalenz ohne klinische Symptomatik belegt wird (2.1.2). Bei Pferden treten klinisch manifeste Erkrankungen meist bei Einzeltieren auf und verlaufen perakut, akut oder subakut und enden in der Regel nach ein bis vier Wochen in etwa 80 % der Fälle letal (SCHMIDT, 1912, 1952; UHLIG und KINNE, 1998; GRABNER und FISCHER, 1991; DÜRRWALD und LUDWIG, 1997; RICHT et al., 2007). Bis zu 10 % der erkrankten Tiere sollen einen chronischen, z.T. rekurrierenden Krankheitsverlauf entwickeln (UHLIG und KINNE, 1998;
GRABNER et al., 2002). Daneben sind milde Enzephalitisformen ohne klinische Symptome beschrieben (GRABNER und FISCHER, 1991). Die Inkubationszeit ist variabel, sie soll
