Untersuchungen zur
Transkription, Replikation und
Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit im Gehirn von experimentell infizierten Lewis Ratten mittels
real-time RT-PCR
Doris Porombka Institut für Pathologie
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung eines Doktorgrades der Veterinärmedizin
ISBN 3-939902-17-9
Verlag: DVG-Service GmbH Frankfurter Straße 89 · 3 392 Gießen
Telefon (0641) 2 44 66 · Telefax (0641) 2 3 7 · E-mail: info@dvg.net · http://www.dvg.net 200 6 D oris Poromb BDV · real -t im e RT PCR
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2006
© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 3-939902-17-9
Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.net
www.dvg.net
Institut für Pathologie
Untersuchungen zur Transkription, Replikation und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit im Gehirn
von experimentell infizierten Lewis Ratten mittels real-time RT-PCR
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung eines Doktorgrades der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Doris Porombka
Düsseldorf
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, PhD
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, PhD 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Georg Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2006
Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes gefördert.
Ein Text ist nicht dann vollkommen, wenn man nichts mehr hinzufügen kann, sondern dann, wenn man nichts mehr weglassen kann
.Antoine de Saint-Exupéry, 1900-1944
Teile der hier vorliegenden Studie wurden bereits vorab veröffentlicht bzw. auf Kongressen vorgestellt:
POROMBKA D., HERZOG D., BAUMGÄRTNER W., HERDEN C. (2006)
Preservation of RNA and destruction of infectivity in microdissected brain tissue of Lewis rats infected with the Borna disease virus. J Virol Meth 135: 247-253
POROMBKA D., EICKMANN M., GARTEN W., HERDEN C., BAUMGÄRTNER W. (2006)
Regional tropism of Borna disease virus transcription and replication in different brain areas of experimentally infected Lewis rats.
24. Jahrestagung der European Society of Veterinary Pathology, Edinburgh, GB POROMBKA D., HERZOG S., BAUMGÄRTNER W., HERDEN C. (2005)
RNA-isolation of microdissected brain tissues of Lewis rats infected with the Borna disease virus after various pre-treatments to destroy infectivity.
50. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Neuroanatomie und Neuropathologie, veröffentlicht in: Acta Neuropathol 110: 336
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 5
2.1 DIE BORNASCHE KRANKHEIT 5
2.1.1 KLINIK 7
2.1.2 PATHOGENESE 8
2.2 ÄTIOLOGIE 9
2.2.1 TAXONOMIE UND MORPHOLOGIE 9
2.2.2 GENOMORGANISATION 10
2.2.3 TRANSKRIPTION 12
2.2.4 REGULATION DER GENEXPRESSION 13
2.2.5 PROTEINE DES BDV 16
2.2.5.1 Nukleoprotein 16
2.2.5.2 Phosphoprotein 17
2.2.5.3 X-Protein 18
2.2.5.4 Matrixprotein 18
2.2.5.5 Glykoprotein 19
2.2.5.6 Large protein (Polymerase) 22
2.2.6 DER VIRALE POLYMERASE-KOMPLEX 22
2.2.7 VIRUSAUSBREITUNG IM ZNS 24
2.2.8 PERSISTENZ 25
2.3 LASERMICRODISSECTION 26
2.3.1 DIE MIKRODISSEKTION IM ÜBERBLICK 26
2.3.2 FORMEN DER LASER MICRODISSECTION 29
2.3.2.1 Laser Microdissection 29
2.3.2.2 Laser Pressure Catapulting (LPC) 29
2.3.2.3 Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC) 29
2.3.2.4 Laser Capture Microdissection (LCM) 30
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 VERSUCHSTIERE 31
3.1.1 BDV-INFEKTION 31
3.1.2 KONTROLLTIERE 31
3.1.3 TÖTUNG DER TIERE 32
3.1.4 GEWEBEPROBEN 32
3.2 UNTERSUCHTEGEHIRNAREALE 34
3.2.1 IN SITU-HYBRIDISIERUNG UND DOPPELMARKIERUNG 34
3.2.2 LASER MICRODISSECTION UND RNA-ISOLIERUNG 34
3.3 ALLGEMEINEMOLEKULARBIOLOGISCHEARBEITSSCHRITTE 35
3.4 VERSUCHSPLANUNG 35
3.4.1 PRIMER UND TAQMAN®-SONDEN 35
3.4.2 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 36
3.5 HERSTELLUNGVONPLASMIDEN 41
3.5.1 RNA-ISOLIERUNG UND -AUFREINIGUNG 42
3.5.2 REVERSE TRANSKRIPTION ZUR HERSTELLUNG VON CDNA ZUR KLONIERUNG 42
3.5.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 42
3.5.4 GELELEKTROPHORESE 43
3.5.5 AUFREINIGUNG DER DNA AUS DEM AGAROSEGEL 44
3.5.6 KLONIERUNGSREAKTION 44
3.5.7 RESTRIKTIONSSPALTUNG UND SEQUENZIERUNG DER PLASMID-DNA 46
3.6 HERSTELLUNGDERSTANDARDVERDÜNNUNGSREIHEN 47
3.6.1 PCR ZUR AMPLIFIKATION DES SPEZIFISCHEN PLASMID-INSERTS 47
3.6.2 BESTIMMUNG DER DNA-KOPIENZAHL 48
3.7 LASERMICRODISSECTION 49
3.7.1 ISOLIERUNG DEFINIERTER GEHIRNAREALE 50
3.7.2 ISOLIERUNG VON EINZELZELLEN 54
3.8 RNA-ISOLIERUNGUNDDNASE I-BEHANDLUNG 60
3.8.1 RNA-ISOLIERUNG AUS DEM GEHIRNSCHNITT 60
3.8.2 RNA-ISOLIERUNG AUS DEN GEHIRNAREALEN 60
3.8.3 RNA-ISOLIERUNG AUS EINZELZELLEN 60
3.8.4 RNA-ISOLIERUNG AUS PROBEN FÜR DEN KONTAMINATIONSAUSSCHLUSS 61
3.9 REAL-TIME RT-PCR 61
3.9.1 SPEZIFISCHE REVERSE TRANSKRIPTION 61
3.9.2 REAL-TIME PCR 63
3.9.2.1 Reaktionsbedingungen 63
3.9.2.2 Reaktionsansatz 64
3.9.2.3 Kontrollen 66
3.9.3 QUANTIFIZIERUNG UND NORMALISIERUNG DER GENEXPRESSION 66 3.9.4 STATISTISCHE DATENANALYSE DER REAL-TIME RT-PCR 67
3.10 INSITU-HYBRIDISIERUNG(ISH) 68
3.10.1 SONDENHERSTELLUNG 68
3.10.1.1 PCR für die Herstellung von DIG-RNA-Sonden 68
3.10.1.2 DNA-Aufreinigung aus dem PCR-Ansatz 69
3.10.1.3 In vitro-Transkription 69
3.10.2 DURCHFÜHRUNG DER IN SITU-HYBRIDISIERUNG 69
3.10.3 KONTROLLEN DER ISH 71
3.10.4 AUSWERTUNG DER ISH 71
3.10.5 STATISTISCHE DATENANALYSE DER ISH 72
3.11 IN SITU-HYBRIDISIERUNG-IMMUNHISTOLOGIE-DOPPELMARKIERUNG 73
3.11.1 BDV-SPEZIFISCHE DIG-RNA-SONDEN 73
3.11.2 SEREN UND ANTIKÖRPER 73
3.11.3 DURCHFÜHRUNG DER ISH/IH-DOPPELMARKIERUNG 74
3.11.4 AUSWERTUNG 75
4 ERGEBNISSE 77
4.1 SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT DER REAL-TIME RT-PCR 77
4.1.1 SENSITIVITÄT 77
4.1.2 SPEZIFITÄT 78
4.1.2.1 No template control (NTC) 78
4.1.2.2 BDV-AG-spezifische +ssRNA 78
4.1.2.3 Ausschluss einer potentiellen Kontamination 80
4.2 ALLGEMEINEAMPLIFIZIERBARKEITDER PROBEN 80
4.2.1 HOUSEKEEPING GENE 80
4.2.2 BDV-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 82
4.3 NACHWEIS BDV-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE IM GEHIRNSCHNITT 83
4.3.1 BDV-N-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 83
4.3.2 BDV-GP-N-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 84
4.3.3 BDV-GP-C-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 84
4.3.4 BDV-INTRON I-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 84
4.3.5 BDV-AG+SSRNA 84
4.3.6 ZUSAMMENFASSENDER VERGLEICH 85
4.4 NACHWEIS BDV-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE IN GEHIRNAREALEN 88
4.4.1 BDV-N-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 89
4.4.2 BDV-GP-N-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 91
4.4.3 BDV-GP-C-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 92
4.4.4 BDV-INTRON I-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 94
4.4.5 BDV-AG-SPEZIFISCHE +SSRNA 95
4.4.6 ZUSAMMENFASSENDER VERGLEICH 97
4.5 NACHWEIS BDV-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE IN EINZELZELLEN 99
4.5.1 BDV-N-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 100
4.5.2 BDV-GP-N-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 101
4.5.3 BDV-GP-C-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 103
4.5.4 BDV-INTRON I-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE 104
4.5.5 ZUSAMMENFASSENDER VERGLEICH 106
4.6 NACHWEISINTRONI-SPEZIFISCHERRNAMITTELSISH 108
4.6.1 NACHWEIS VON INTRON I-SPEZIFISCHER +SSRNA 108
4.6.1.1 Generelles Reaktionsschema 108
4.6.1.2 Ausbreitung und Lokalisation 109
4.6.2 NACHWEIS VON GENOMISCHER RNA 112
4.6.2.1 Generelles Reaktionsschema 112
4.6.2.2 Ausbreitung und Lokalisation 112
4.6.3 DOPPELMARKIERUNGEN 114
4.6.3.1 Nachweis von BDV-RNA in Astrozyten 114
4.6.3.2 Nachweis von BDV-RNA in Oligodendrozyten 115
4.6.4 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER ISH 117
5 DISKUSSION 125
5.1 SPEZIFITÄT UND SENSITIVITÄT DER REAL-TIME RT-PCR 126
5.2 EXPRESSION BDV-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE 129
5.2.1 TRANSKRIPTEXPRESSION IM GEHIRNSCHNITT 129
5.2.2 TRANSKRIPTEXPRESSION IN DEN GEHIRNREGIONEN 130
5.2.3 TRANSKRIPTEXPRESSION IN EINZELZELLEN 132
5.2.4 RELATIONEN DER BDV+SSRNAS 134
5.3 SUBZELLULÄRE VERTEILUNG UND VIRUSAUSBREITUNG 137
5.4 KONSEQUENZ DER VIRALEN TRANSKRIPTION FÜR DIE PROTEINEXPRESSION 142 5.4.1 BDV-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE DER ERSTEN TRANSKRIPTIONSEINHEIT 142 5.4.2 BDV-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTE DER DRITTEN TRANSKRIPTIONSEINHEIT 144 5.5 BEDEUTUNG DER ANTIGENOM-EXPRESSION FÜR DIE VIRALE REPLIKATION 147
6 ZUSAMMENFASSUNG 149
7 SUMMARY 153
8 LITERATURVERZEICHNIS 157
9 ANHANG 183
9.1 BEZUGSQUELLENFÜRREAGENZIENUNDEINMALWARE 183
9.2 BEZUGSQUELLENFÜRGERÄTE 187
9.3 LÖSUNGENUNDPUFFER 188
9.3.1 IN SITU-HYBRIDISIERUNG-IMMUNHISTOLOGIE-DOPPELMARKIERUNG 188
9.3.2 KLONIERUNGSREAKTION 189
9.3.3 LASER MICRODISSECTION 189
9.3.4 RNA-ISOLIERUNG,RT-PCR, REAL-TIME RT-PCR UND GELELEKTROPHORESE 190
9.3.5 SONDENSYNTHESE UND IN SITU-HYBRIDISIERUNG 191
9.4 TABELLEN 197
9.5 ABKÜRZUNGEN 213
1 EINLEITUNG
Virale Glykoproteine behüllter Viren spielen eine besondere Rolle bei der viralen Anheftung an die Wirtszelle, sowie bei der Fusion von Virushülle und Zellmembran und determinieren auf diese Weise den Wirts- und Gewebetropismus. Des Weiteren dienen sie der antiviralen Immunabwehr als Zielstrukturen und sind somit essentiell für die Viruselemination aus dem Wirtsorganismus. Aufgrund dessen muss im Fall einer Viruspersistenz eine gezielte Regulation der Glykoproteinexpression erfolgen (OLDSTONE und BUCHMEIER et al., 1982;
Übersicht bei OLDSTONE, 1991; KIERMAYER et al., 2002; EICKMANN et al., 2005). Diese Mechanismen werden ebenfalls für das Glykoprotein des Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV) angenommen, das als einziges Oberflächenprotein auf der Hüllmembran des BDV zu finden ist (KOHNO et al., 1999; Übersichten bei DE LA TORRE et al., 2002a und TOMONAGA et al., 2002).
Das BDV ist durch einen ausgeprägten Neurotropismus gekennzeichnet und führt nach spontaner oder experimenteller Infektion zu einer Viruspersistenz im zentralen Nervensystem (ZNS; Übersichten bei RICHT und ROTT, 2001; DE LA TORRE, 2002a/ b).
Die Rolle des BDV-Glykoproteins für die Determination des Neurotropismus, der Virusausbreitung sowie die für die Entwicklung der Viruspersistenz ist derzeit nur unvollständig geklärt.
Das BDV ist ein einzelsträngiges, behülltes RNA-Virus mit negativer Polarität des Genoms und als Prototyp der neu etablierten Familie der Bornaviridae innerhalb der Ordnung der Mononegavirales klassifiziert (DE LA TORRE et al., 1990; VAN DE WOUDE et al., 1990;
BRIESE et al., 1992; PRINGLE, 1996). Das Genom des BDV besitzt mindestens sechs offene Leseraster (open reading frames, ORF), welche in 3´-5´-Richtung für das Nukleoprotein BDV-N (ORF I), das Phosphoprotein BDV-P (ORF II), das X-Protein (ORF x1), das Matrixprotein BDV-M (ORF III), das Glykoprotein BDV-GP (ORF IV) und am 5‘-Ende für die RNA Polymerase BDV-L (ORF V) kodieren. Das BDV-GP wird von zwei primär polycistronischen subgenomischen RNAs kodiert, die ebenfalls für das BDV-M und gegebenenfalls für die virale Polymerase kodieren. Die Expression dieser Proteine wird durch posttranskriptionelles Spleißen reguliert (SCHNEIDER et al., 1994; SCHNEIDER et al., 1997b; KIERMEYER et al., 2002). Das ORF III des BDV-M enthält das virale Intron I.
Transkripte, die Intron I enthalten kodieren vor allem für BDV-M, während Spleißen von Intron I zur Expression des BDV-GP führt (SCHNEIDER et al., 1994; SCHNEIDER et la., 1997b; Übersichten bei DE LA TORRE et al., 2002a und TOMONAGA et al., 2002).
Die experimentelle BDV-Infektion adulter Lewis Ratten führt zu einer nicht-eitrigen Meningoenzephalomyelitis mit klassischem, biphasischen Krankheitsverlauf (NARAYAN et
al., 1983a/ b; HERDEN et al., 2000). Im Rattengehirn sind virales Antigen, virale RNA und infektiöses Virus konstant über mehrere Monate in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen nachweisbar. Die Mechanismen, die für den Neurotropismus des BDV, die Virusausbreitung sowie für die Regulation der BDV-Replikation und seiner Persistenz im ZNS verantwortlich sind, sind derzeit nur unzureichend bekannt. Die Expression und Lokalisation des BDV-GP im Gehirn im Verlauf der Infektion wurden bereits in einer vorangegangenen Studie untersucht (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003). Im Gehirn wurde das Vorkommen des Glykoproteins (BDV-GP) und des Nukleoproteins (BDV-N) nach experimenteller Infektion von Lewis Ratten verglichen. Im Unterschied zu der disseminierten Expression des BDV-N wurde bei der Expression des BDV-GP eine Beschränkung vorwiegend auf das Ammonshorn, Thalamus, cerebralen Cortex und Amygdala beobachtet.
In der Verteilung und subzellulären Lokalisation der entsprechenden kodierenden +ssRNAs waren ebenfalls Unterschiede zu erkennen. Während BDV-N +ssRNA disseminiert im Gehirn vorlag und vorwiegend im Zytoplasma von Neuronen zu finden war, waren BDV-GP +ssRNA-Signale vor allem im Zellkern von Neuronen des Ammonshorns, Thalamus, cerebralen Cortex und Amygdala zu finden (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003).
Ziel dieser Arbeit war deshalb die systematische und vergleichende Untersuchung der Transkription und Replikation des BDV in definierten Gehirnarealen und Zellpopulationen von experimentell infizierten Lewis Ratten. Insbesondere sollte analysiert werden, ob die lokal begrenzte und temporär differierende BDV-GP-Expression ursächlich mit einer regulierten Transkription der entsprechenden BDV-GP-kodierenden +ssRNA in den betroffenen Gehirnarealen im Zusammenhang steht.
Dazu wurden bei experimentell infizierten Lewis Ratten Gehirnareale mit immunhistologisch nachweislich hoher BDV-GP-Expression (Ammonshorn) versus Gehirnareale, die kaum oder kein BDV-GP aufweisen (Nucleus caudatus/ Putamen) mittels Laser-basierter Mikrodissektions-Technologie (Laser Microdissection) selektiv gewonnen. Außerdem wurden zwei Zielzellpopulationen des BDV (NARAYAN et al., 1983b; DESCHL et al., 1990;
CARBONE et al., 1989, 1991; HERDEN et al., 2000) mit nachweisbarer (Neuronen der CA3- Region) und nicht darstellbarer BDV-GP-Expression (Astrozyten) durch Laser Microdissection and Pressure Catapulting einzeln isoliert, um mögliche zellspezifische Effekte auf die virale Transkriptionseffizienz zu analysieren. Als Referenzwerte für das Vorkommen von BDV-spezifischen Transkripten wurde virale RNA zusätzlich aus kompletten Gehirnschnitten isoliert. Die in den Proben enthaltenen BDV-N- und BDV-GP-spezifischen Transkripte sollten mit Hilfe der real-time reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) präzise quantifiziert werden. Da das posttranskriptionelle Spleißen von Intron I essentiell für die effektive Translation des BDV-GP ist, wurde der Anteil BDV-Intron I-
enthaltender +ssRNA-Sequenzen ebenfalls bestimmt. Die Quantifizierung des viralen Antigenoms (BDV-AG), das als vollständige komplementäre +ssRNA-Matrize für die de novo-Synthese des Virusgenoms benötigt wird, sollte zusätzliche Informationen zur Effizienz der viralen Replikation in den untersuchten Gehirnregionen zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion geben. Ergänzend zur bereits durchgeführten morphologisch-topographischen Analyse der Verteilung von BDV-N- und BDV-GP-spezifischen RNAs (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003) wurde das Vorkommen der BDV-Intron I-spezifischen RNA systematisch untersucht, um diese Daten mit den quantitativen Messwerten korrelieren zu können.
Durch den gezielten Vergleich der Expression der BDV-N-, BDV-GP-, BDV-Intron I- und BDV-AG-spezifischen +ssRNAs im gesamten Gehirnschnitt, in definierten Gehirnarealen und in einzelnen Zellpopulationen im akuten versus chronischen Stadium der BDV-Infektion sollten somit wichtige Aussagen zu der Effizienz und Regulation der viralen Transkription und Replikation gewonnen werden, die wesentlich zum Verständnis des Virustropismus, der Virusausbreitung und Persistenz im ZNS beitragen können.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 DIE BORNASCHE KRANKHEIT
Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) ist eine seit über 200 Jahren bekannte und meist tödlich verlaufende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS; AUTHENRIETH, 1823; WÖRZ, 1858, zitiert nach HEINIG, 1969; ZWICK, 1939). Diese auch als „Hitzige Kopfkrankheit der Pferde“ oder „Schlafsucht der Pferde“ bezeichnete Erkrankung ist histopathologisch durch eine nicht-eitrige Meningoenzephalitis charakterisiert (ZWICK, 1939;
HEINIG, 1969; RICHT et al., 1993; ROTT und BECHT, 1995).
Die Erkrankung und das infektiöse Agens sind nach der gleichnamigen Stadt Borna in Sachsen benannt worden, in deren Umgebung Ende des 19. Jahrhunderts zahlreiche Kavalleriepferde einem seuchenhaften Ausbruch der BD zum Opfer fielen (ZWICK, 1939). In den zwanziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts gelang den Gießener Virologen ZWICK und SEIFRIED (1925) die experimentelle Übertragung der BD, indem bakterienfreies Gehirnhomogenat eines erkrankten Pferdes einem Kaninchen appliziert und nachfolgend wieder zurück übertragen wurde. Durch diesen Infektionsversuch konnte die Virusätiologie der BD eindeutig bewiesen werden (ZWICK et al., 1927). Das Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV) verfügt über einen ausgeprägten Neurotropismus und eine hohe Adaptation an einen nicht-zytolytischen Vermehrungszyklus in vivo und in vitro (DANNER und MAYR, 1979; HERZOG und ROTT, 1980; LUDWIG et al., 1988; DUCHALA et al., 1989).
Lange Zeit galten Pferde und Schafe als klassische Wirte für die natürliche BDV-Infektion.
Das Spektrum der empfänglichen Spezies, die geographische Verteilung sowie die Seroprävalenz sind jedoch wesentlich breiter gestreut als ursprünglich angenommen (STITZ und ROTT, 1999; HERZOG et al., 1994; RICHT et al., 1995; ROTT und BECHT, 1995;
Übersicht bei STAEHELI et al., 2000; RICHT et al., 2006). Natürliche BDV-Infektionen sind sporadisch bei vielen verschiedenen Tierarten beschrieben worden (Tab. 1).
Tab. 1: Übersicht der beschriebenen natürlichen BDV-Infektionen
Tierart Publikation
Equiden ALTMANN et al., 1976
DÜRRWALD, 1993
Rinder ERNST und HAHN, 1927
BODE et al., 1994 CAPLAZI et al., 1994
Ziegen IHLENBURG, 1962
DÜRRWALD, 1993
Rehe ERNST und HAHN, 1927
Hund WEISSENBÖCK et al., 1998
Katze NOWOTNY und WEISSENBÖCK, 1995
JAUNIN et al., 1998
Luchs DEGIORGIS et al., 2000
Kaninchen OTTA und JENTZSCH, 1960
METZLER et al., 1978 Zootiere
(Alpakas, Faultiere, Vari-Äffchen, Zwergflusspferde, Zweifingerfaultiere)
ALTMANN et al., 1976
SCHÜPPEL et al., 1994, 1995 Übersicht bei STAEHELI et al., 2000
Eine ätiologische Beteiligung des BDV bei bestimmten psychiatrischen Erkrankungen des Menschen (z. B. Schizophrenie, Depressionen, Chronic Fatigue Syndrom) und die mögliche Bedeutung als Zooanthroponose werden nach wie vor kontrovers diskutiert (ROTT et al., 1985; Übersicht bei RICHT et al., 1997b; BECHTER et al., 1987; LIEB und STAEHELI, 2001;
CARBONE, 2001; Übersicht bei STAEHELI, 2000, 2002; BODE und LUDWIG, 2003). In Seren und Zerebrospinalflüssigkeiten von Humanpatienten konnten BDV-spezifische Antikörper gefunden werden (AMSTERDAM et al., 1985; ROTT et al., 1985, 1991;
BECHTER et al., 1987; BODE et al., 1992, 1993; RICHT et al., 1993; WALTRIP et al., 1995;
SAUDER et al., 1996; GONZALEZ-DUNIA et al., 1997; TERAYAMA et al., 2003; GÜNDÖR et al., 2005). Die Relevanz dieser serologischen Befunde wurde jedoch in Frage gestellt, da in multizentrischen Ringversuchen Diskrepanzen zwischen den einzelnen Ergebnissen auffällig wurden (ALLMANG et al., 2001; NÜBLING et al., 1999). Die Virus-Spezifität der humanen Antiseren gilt jedoch inzwischen als gesichert (BILLICH et al., 2002;
SCHWEMMLE und BILLICH, 2004). Berichte über den Nachweis von viraler RNA aus peripheren Blutmonozyten (BODE et al., 1996; PLANZ et al., 1999; MIRANDA et al., 2006) bzw. dem Gehirn (DE LA TORRE et al., 1996; NAKAMURA et al., 2000) psychiatrisch erkrankter Patienten führten zu kontroversen Resultaten. Eine hohe Sequenzübereinstimmung mit Laborstämmen legt die Möglichkeit einer Laborkontamination nahe (SCHWEMMLE et al., 1999a; Übersicht bei STAEHELI et al. 2000, 2002; PLANZ et al.,
2003; HOFER et al., 2006). In anderen Berichten wurden keine Hinweise auf eine BDV- Infektion bei entsprechenden Probanden festgestellt (RICHT et al., 1997a; EVENGARD et al., 1999; HOFER et al., 2006; WOLFF et al., 2006). Zusammenfassend weisen die serologischen Daten auf die Möglichkeit humaner BDV-Infektionen hin, über deren Relevanz für die menschliche Gesundheit derzeit lediglich spekuliert werden kann. Letztlich wird diese Fragestellung nur durch weitere Forschungsarbeiten zu klären sein.
Die experimentelle BDV-Infektion ist bei einem weiten und phylogenetisch unterschiedlichen Wirtsspektrum beschrieben. Dieses reicht von Vögeln über Nager bis hin zu nicht-humanen Primaten und wird in der Regel durch intrazerebrale Inokulation hoher Virusdosen erzielt (LUDWIG et al., 1985; Übersicht bei ROTT und BECHT, 1995; Übersicht bei RICHT et al., 1997b; LUDWIG und BODE, 2000; Übersicht bei STAEHELI et al., 2000). Die Empfänglichkeit der Tiere gegenüber dem BDV und die Fähigkeit zur Ausbildung einer klinischen Symptomatik variiert jedoch zwischen den verschiedenen Spezies und Virus- Stämmen (Übersicht bei RICHT et al., 1997b). Hochempfänglich für die experimentelle BDV- Infektion sind Kaninchen, Lewis Ratten und Meerschweinchen (RICHT et al., 1992; ROTT und BECHT, 1995), während bestimmte Mausstämme, Hamster, Frettchen und black hooded Ratten eine asymptomatische Infektion mit Viruspersistenz durchlaufen (ANZIL et al., 1973; HERZOG et al., 1991; RICHT et al., 1992; ROTT und BECHT et al., 1995;
HALLENSLEBEN et al., 1998).
2.1.1 Klinik
Bei der natürlichen BDV-Infektion sollte zwischen einer klinisch apparenten Verlaufsform, die beim Pferd häufig als Einzeltiererkrankung auftritt, und der weit häufigeren und geographisch weit verbreiteten asymptomatischen Infektion mit begleitender Serokonversion differenziert werden. Innerhalb einer Schafherde können auch mehrere Tiere mit der Symptomatik einer BD erkranken (HEINIG, 1969; METZLER et al., 1976).
Die klinisch manifeste Form bei Pferden äußert sich in einer perakuten, akuten, subakuten oder auch chronisch-rezidivierenden BD mit Ausbildung einer nicht-eitrigen Meningoenzephalitis, die innerhalb von ein bis vier Wochen nach Beginn der klinischen Symptomatik zum Tode führt (SCHMIDT, 1912, 1952; IHLENBURG, 1969; GRABNER et al., 2002; RICHT et al., 2001, 2006). Ca. 10% der klinisch apparent erkrankten Tiere sollen einen chronisch-rezidivierenden Krankheitsverlauf entwickeln. Insgesamt treten jedoch die asymptomatischen Verlaufsformen beim Pferd deutlich häufiger auf (HERZOG et al., 1994;
ROTT und BECHT, 1995; GRABNER et al., 2002).
Bei Lewis Ratten variiert das Krankheitsbild nach experimenteller Infektion in Abhängigkeit von dem Alter der Tiere, dem Immunstatus zum Zeitpunkt der Infektion, der gewählten
Virusapplikation (intrazerebral, intranasal), sowie von der jeweils verwendeten Viruspräparation. Adulte, immunkompetente Lewis Ratten entwickeln typischerweise eine immunvermittelte biphasische Verlaufsform der BD mit einem akuten und chronischen Stadium (NITZSCHKE, 1963; NARAYAN et al., 1983 a/ b). Ca. 20 Tage nach intrazerebraler Inokulation treten klinische Symptome in Form von aggressivem Verhalten, Hyperaktivität, Desorientierung, Ataxie und teilweise auch Paralysen auf (NARAYAN et al., 1983b). Diese erste Phase dauert bis zum ca. 40. Tag post infectionem (p.i.) an. Die zweite, chronische Phase beginnt ab dem 60. Tag p.i., die durch Apathie und Somnolenz und Viruspersistenz gekennzeichnet ist. Einige Tiere erblinden bis zum 100. Tag p.i. (NARAYAN et al., 1983a).
Die Ausbildung von Paresen bzw. Paralysen der Hintergliedmaßen (BIESENBACH et al., 1990; BIESENBACH, 1994) oder einer Obesitas (NARAYAN et al., 1983b; KAO, 1985;
KOMPTER, 1987; BREDTHAUER et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; ROTT und BECHT, 1995; HERDEN et al., 2000) ist ebenfalls beschrieben.
Immuninkompetente Lewis Ratten entwickeln nach experimenteller BDV-Infektion spezifische Antikörper und eine lebenslängliche Viruspersistenz, die durch das Fehlen klassischer klinischer Symptome und Entzündungszellinfiltrate gekennzeichnet ist (HIRANO et al., 1983; NARAYAN et al., 1983a; MORALES et al., 1988).
2.1.2 Pathogenese
Die klinische Symptomatik der BD ist keine direkt Folge der Virusreplikation, sondern entsteht vielmehr durch virusindizierte immunpathologische Reaktionen des Wirtsorganismus, die einer Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV) entspricht (RICHT et al., 1989, 1990, 1992, 1995, 2006; DESCHL et al., 1990; STITZ et al., 2002). Als histopathologisches Korrelat der BD nach natürlicher und experimenteller Infektion findet man eine nicht-eitrige Poliomeningoenzephalitis und Myelitis mit perivaskulären und parenchymalen mononukleären Infiltraten (JOEST und DEGEN, 1911;
GOSZTONYI und LUDWIG, 1984; DESCHL et al., 1990; BILZER et al., 1995). Die intranukleären eosinophilen Joest-Degen-Einschlusskörperchen sind pathognomonisch für eine BDV-Infektion und können sowohl in Neuronen und Astrozyten gefunden werden (JOEST und DEGEN, 1909). Heutzutage treten diese jedoch kaum noch auf. Nach intrazerebraler Infektion adulter immunkompetenter Lewis Ratten treten mit Beginn der klinischen Symptomatik zunächst perivaskuläre und später auch parenchymale entzündliche Infiltrate im ZNS auf. Diese sind vor allem im Ammonshorn, Thalamus, Bulbus olfactorius, Cortex cerebri, Nucleus caudatus/ Putamen und periventrikulären Gebieten in der Medulla oblongata lokalisiert. Weniger betroffen sind das Cerebellum und das Spinalmark (NARAYAN et al., 1983a/ b; DESCHL, 1988; HERDEN et al., 2000). Die
Entzündunszellinfiltrate bei der Lewis Ratte bestehen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen und Makrophagen, zu späteren Zeitpunkten p.i. sind auch vermehrt Plasmazellen und B- Lymphozyten zu finden.
In den letzten Jahren konnte mehrfach demonstriert werden, dass das BDV zur Interaktion mit zellulären Proteinen und Signalkaskaden bzw. zu einer Induktion der antiviralen Interferon-Antwort fähig ist (Übersicht bei GONZALEZ-DUNIA et al., 2005). Dazu gehört die in vitro nachgewiesene Aktivierung der Raf/MEK/ERK Signalskaskade (PLANZ et al., 2001), die Bindung des BDV-P und damit verbundene Funktionsalteration des Neuriten-Auswuchs- Faktor Amphotericin/HMG-1 (KAMITANI et al., 2001), wodurch die Reifung und Kommunikation neuronaler Zellen gestört wird, die Hemmung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-КB (BOURTEELE et al., 2005) und Interaktion mit der Kinase TNK-1 (UNTERSTAB et al., 2005), was beides möglicherweise an einer Schwächung der Abwehrfunktionen des Wirtes beteiligt sein kann.
2.2 ÄTIOLOGIE
2.2.1 Taxonomie und Morphologie
Das BDV ist ein behülltes, einzelsträngiges, lineares RNA-Virus mit negativer Polarität des Genoms (non-segmented, negative single-stranded RNA [NNS RNA]; DE LA TORRE et al., 1990; VAN DE WOUDE et al., 1990; BRIESE et al., 1992; RICHT et al., 1993; CUBITT und DE LA TORRE, 1994). Auf der Basis verschiedener genetischer und biologischer Besonderheiten ist das BDV als Prototyp und bislang einziger Vertreter der neu etablierten Familie Bornaviridae zusammen mit den Virusfamilien Rhabdo-, Paramyxo- und Filoviridae innerhalb der Ordnung der Mononegavirales klassifiziert worden (BRIESE et al., 1994;
CUBITT und DE LA TORRE, 1994; PRINGLE, 1996).
In der ultrastrukturellen Analyse von zellfreien infektiösen BDV-Partikeln ließen sich kugelförmige Virionen (Abb. 1) mit einem Durchmesser von ca. 70-130 nm darstellen (ZIMMERMANN et al., 1994; GONZALEZ-DUNIA et al., 1997; KOHNO et al., 1999). Diese Partikel besitzen einen internen, elektronendichten Kern, dessen Größe ca. 50-60 nm beträgt. Das ca. 4 nm breite Nukleokapsid weist eine helikale Form auf (KOHNO et al., 1999). Die Partikel werden von einer äußeren Hüllmembran ummantelt, die ca. 7 nm lange spike-ähnlichen Projektionen enthält (KOHNO et al., 1999).
Abb. 1: Schematische Darstellung des Virus der Bornaschen Krankheit 2.2.2 Genomorganisation
Die Viren der Ordnung Mononegavirales verfügen alle über eine gleichartige Genomorganisation mit einer einheitlichen Anordnung ihrer Gene. In der 3’- zu 5’-Orientierung des BDV-Genoms befinden sich die offenen Leseraster (open reading frame, ORF) für die core Proteine, Hüllproteine und für die viruseigene, RNA-abhängige RNA Polymerase (BRIESE et al., 1994; CUBITT und DE LA TORRE, 1994). Das BDV-Genom stellt mit einer Größe von nur 8,9 kb und einer relativen Masse von ca. 3 x 106 das kleinste Virus innerhalb der NNS RNA-Viren dar (BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 1994a; DE LA TORRE, 1994; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995). Eine komplette antigenomische +ssRNA (complementary RNA, cRNA) dient als Matrize zur de novo-Synthese von genomischer RNA (virale RNA, vRNA). Sowohl die vRNA als auch die cRNA sind nicht polyadenyliert, besitzen keine 5’-Kappe zum Schutz vor Exonukleasen (BRIESE et al., 1994;
CUBITT et al., 1994a) und kommen koexistent in infizierten Zellen bzw. im viralen Ribonukleoprotein vor (Übersicht bei DE LA TORRE, 2002a; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Genaue Mengenverhältnisse sind jedoch nicht bekannt.
An den Genomenden befinden sich extracistronische nicht-kodierende 3’-leader- und 5’- trailer-Sequenzen, die so genannte inverted terminal repeats (ITR) besitzen. Die ITR enthalten die Promotoren für die virale Replikation und Transkription (CUBITT et al., 1994a;
SCHNEIDER et al., 2005). Verschiedene Untersuchungen weisen darauf hin, dass das BDV ungewöhnliche ITRs besitz, die aufgrund von 5’-verkürzten Genomenden nur teilweise komplementär und somit unvollständig sind (BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 1994a;
PLESCHKA et al., 2001; ROSARIO et al., 2005; Übersicht bei SCHNEIDER, 2005).
SCHNEIDER et al. (2005) konnten anhand von Studien mit dem Minireplikon-Modell ein
aktives Kürzen des 5’-Terminus der vollständigen vRNA in der Replikationsphase nachweisen. Die „programmierte“ Kürzung der Genomenden und die damit verbundene limitierte Amplifikation des BDV-Genoms könnte eine der viralen Strategien zur Generierung eines nicht-zytolytischen und persistierenden viralen Vermehrungszyklus darstellen. Das BDV verfügt über drei Transkriptionseinheiten, in denen mindestens sechs ORFs (Abb. 2) lokalisiert sind. In 3’-5’-Orientierung kodiert die vRNA für das Nukleoprotein BDV-N (ORF I), das X-Protein BDV-X (ORF X), das Phosphoprotein BDV-P (ORF II), das Matrixprotein BDV- M (ORF III), das Glykoprotein BDV-GP (ORF IV) und am 5‘-Ende für die RNA Polymerase BDV-L (ORF V; BRIESE et al., 1994; DE LA TORRE, 1994; Übersicht bei DE LA TORRE, 2002a; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995; WALKER et al., 2000; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). ORF IV und ORF X befinden sich dabei nicht im selben Leseraster wie ORF I - III und V (Abb. 2; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995;
WEHNER et al., 1997).
Das BDV weist eine ungewöhnlich hohe Konservierung des Virusgenoms auf, mit einer über 95%igen Sequenzübereinstimmung zwischen einzelnen Feldisolaten und Laborstämmen (BINZ et al., 1994; HERZOG et al., 1997; Übersicht bei DÜRRWALD et al., 2006). Die hohe Konservierung von kodierenden und regulatorischen Elementen weist auf eine starke Adaptation des BDV an einen nicht-zytolytischen Vermehrungszyklus hin (KILBOURNE, 1991; PLESCHKA et al., 2001; SCHNEIDER et al., 2004a). Phylogenetische Untersuchungen verschiedener Feld- und Laborisolate zeigen, dass BDV-Isolate aus der gleichen geographischen Region einen hohen Homologiegrad untereinander besitzen (KOLODZIEJEK et al., 2005). Eine Ausnahme hiervon stellt das BDV-Isolat No/98 dar, welches bislang als einzige beschriebene BDV-Variante ca. 15% in seiner Nukleotidsequenz von den anderen Isolaten abweicht (NOWOTNY et al., 2000; Übersicht bei DÜRRWALD et al., 2006). Diese Austausche führen überraschenderweise bei einem Großteil der BDV- Proteine zu keinem Aminosäure (AS)-Austausch. Bei anderen Isolaten konnten bereits einzelne AS-Austausche zu einer Alteration der BDV-Proteine führen. RICHT et al. (1997b) berichteten von BDV-Isolaten aus natürlich infizierten Pferden, die in 4% der Fälle eine veränderte Antigenität aufgrund eines AS-Ausstauschs im ORF I aufwiesen, und nicht mit dem üblicherweise verwendeten Anti-BDV-N-Antikörper Bo18 zu detektieren waren.
NISHINO et al. (2002) konnten demonstrieren, dass der Austausch von je zwei AS im ORF IV und ORF V zu einer Verstärkung der BDV-Virulenz und zur Veränderungen in der Neuropathogenese mit verstärkter klinischer Symptomatik im Rattenmodell führen.
2.2.3 Transkription
Bemerkenswerterweise transkribiert und repliziert das BDV als einziger tierpathogener Vertreter unter den NNS RNA-Viren im Nukleus der infizierten Wirtszelle (BRIESE et al., 1992; DE LA TORRE, 1994; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995). PYPER et al. (1998) vermuteten, dass der Nukleolus den Ort der viralen Replikation bzw. Transkription darstellt.
Die Transkription kodierender +ssRNAs folgt bei den NNS RNA-Viren einem strengen 3’-5’- Gradienten (IVERSON und ROSE, 1981), was zu einer Abnahme in der Menge neu gebildeter Transkripte von 3’- zu 5’-terminal lokalisierten Genen führt. Dieser Gradient soll beim BDV aber weniger stark ausgeprägt sein (TOMONAGA et al., 2002). Die Replikation und Transkription werden von der viruskodierten RNA-abhängigen RNA Polymerase (RNA- dependent RNA Polymerase, RdRP) durchgeführt, die neben kompletter cRNA auch polyadenylierte und mit 5’-Kappe versehene Transkripte (subgenomische RNAs) verschiedener Größe produziert.
Die Transkriptions- und Replikationsstrategien des BDV sind im Gegensatz zu anderen NNS RNA-Viren einzigartig und sehr komplex. Insgesamt exprimiert das BDV sechs Proteine von nur drei Transkriptionseinheiten (I-III) und ist somit gezwungen, verschiedene Expressionsstrategien zu nutzen. Dazu gehören neben der Synthese verschiedener kodierender +ssRNAs das Vorkommen überlappender ORFs und Durchlesen von Transkriptionsterminations-Signalen (SCHNEEMANN et al., 1994; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995; Übersicht bei DE LA TORRE, 2002a; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Die intranukleäre Transkription und Replikation ermöglicht die Nutzung der zellulären Spleiß-Apparatur für die zusätzliche Regulation der Protein- Expression (BRIESE et al., 1992; DE LA TORRE, 1994; SCHNEEMANN et al., 1994;
SCHNEIDER et al., 1994; SCHNEIDER et al., 1997b/ c; TOMONAGA et al., 2000; DE LA TORRE, 2002a).
Innerhalb der Mononegavirales besitzen die Virusgenome Transkriptionsinitiations-Signale (S) und Polyadenylierungs-/ Terminations-Signale (Pt) in den intergenetischen Regionen des Genoms. Das BDV besitz mindestens drei S-Signale (S1-S3) und mindestens vier Pt-Signale (T1-T4; BRIESE et al., 1994; SCHNEEMANN et al., 1994; Übersichten bei TOMONAGA et al., 2002 und bei DE LA TORRE et al., 2002a). Ein fünftes hypothetisches Pt-Signal (t6) wurde von BRIESE et al. (1994) beschrieben. Eine Nutzung von t6 konnte bislang aber nicht nachvollzogen werden (CUBITT et al., 2001). Bei den Pt-Motiven handelt es sich um Uracil- reiche Konsensus-Sequenzen, die zu einem „Stottern“ der RdRP und zur Synthese eines Poly(A)-Schwanzes führen. Im Gegensatz zu anderen Viren der Mononegavirales weist das BDV eine untypische Genomorganisation auf, da eine strikte Trennung der üblichen
Gliederung des Genoms in Transkriptiontermination - intergenetische Region - Transkriptioninitiation aufgrund der teilweise überlappenden Anordnung der Signalsequenzen nicht vorhanden ist (Abb. 2; BRIESE et al., 1994; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995; Übersicht bei DE LA TORRE, 2002a; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Eine vergleichbare Anordnung von Transkriptions- und Terminations-Signalen findet sich bei den NNS RNA-Viren bislang nur beim respiratorischen Synzytialvirus (COLLINS et al., 1987).
2.2.4 Regulation der Genexpression
Die Transkriptionseinheit I (S1-T1) ist die einzige monocistronische Transkriptionseinheit und enthält das ORF I zur Expression von BDV-N (Abb. 2). Die bicistronische Transkriptionseinheit II (S2-T2) enthält die überlappenden ORF X und ORF II (Abb. 2). Die Expression beider Proteine wird am Ribosom vermutlich durch Überlesen (leaky scanning) von stromaufwärts gelegenen Startkodons reguliert (PYPER und GARTNER, 1997;
SCHNEIDER et al., 1997b; WEHNER et al., 1997). ORF III, IV und V sind jeweils in der Transkriptionseinheit III (S3 - T3/ T4) lokalisiert und werden von polycistronischen subgenomischen RNAs kodiert (Abb. 2).
Die primären Transkripte der dritten Transkriptionseinheit (S3 - T3/ T4) werden durch posttrankriptionelle Prozessierung modifiziert und somit die Expression der BDV- spezifischen Proteine BDV-M, BDV-GP und BDV-L kotranskriptionell reguliert (CUBITT et al., 1994b; SCHNEIDER et al., 1994; JEHLE et al., 2000; TOMONAGA et al., 2000; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Primär verfügen diese Transkripte über eine Größe von 2,8 kb (S3 – T3) bzw. 7,2 kb (S3 – T4). Insgesamt sind in den Transkripten der Startstelle S3 drei verschiedene Introns (I-III) lokalisiert (Abb. 2; BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 2001;
Übersichten bei DE LA TORRE et al., 2002a und TOMONAGA et al., 2002). Das 94 Nukleotide (nt) kleine Intron I ist im ORF III des BDV-M enthalten, während das insgesamt 1294 nt große Intron II im ORF IV des BDV-GP gelegen ist (CUBITT et al., 1994b;
SCHNEIDER et al., 1994; TOMONAGA et al., 2000). Intron III ist ca. 2150 nt groß und teilt sich die 5’- splice donor site mit Intron II, die 3’-splice acceptor site ist jedoch weiter stromabwärts gelegen. Die Sequenzmotive der Spleißstellen stimmen zu 78% mit Spleiß- Konsensussequenzen von Säugetieren überein (SCHNEIDER et al., 1994) und können durch alternatives Spleißen zur Deletion der verschiedenen Introns führen.
Prinzipiell gilt, dass die Expression des BDV-M von allen subgenomischen RNAs ab S3 erfolgt, die Intron I enthalten (Abb. 2; subgenomische RNA mit 2,8/ 7,2 kb bzw. 1,6/ 6,1 kb).
BDV-GP wird von subgenomischen RNAs translatiert, die Intron II beinhalten. Das Spleißen von Intron I ist wesentlich für die Expression des BDV-GP (Abb. 2; subgenomische RNA mit
2,7/ 7,1 kb; SCHNEIDER et al., 1997b; JEHLE et al., 2000). Nur ein geringer Anteil BDV-GP soll bei der Proteinbiosynthese auch von Intron-I-haltiger subgenomischer RNA durch Überlesen des AUG-Startkodons für die BDV-M-Expression synthetisiert werden (SCHNEIDER et al., 1997b). BDV-L kann nur von Transkripten exprimiert werden, die an T4 enden und Intron II-gespleißt sind, da durch diese Prozessierung das BDV-L-kodierende ORF geschaffen wird (Übersicht bei SCHNEIDER, 2005). Auch für die Expression des BDV- L gilt, dass eine effiziente Synthese nur bei zusätzlichem Spleißen von Intron I erfolgen soll (Abb. 2; subgenomische RNA mit 6,0 kb).
Die Relevanz von Intron III konnte bislang nicht geklärt werden. Der Gebrauch des Intron III soll durch eine exon splicing suppressor sequence unterdrückt werden (TOMONAGA et al., 2000) und dem BDV-Stamm No/98 fehlt diese Spleißstelle in toto (NOWOTNY et al., 2000).
Die Expression von BDV-M, BDV-GP und BDV-L scheint durch das Virus selbst reguliert zu sein, wobei dem posttranskriptionellen Spleißen der subgenomischen RNAs eine entscheidende Schlüsselrolle zukommt (DE LA TORRE, 1994; Übersicht bei DE LA TORRE et al., 2002a; SCHNEEMANN et al., 1994; WALKER et al., 2000; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002; Übersicht bei SCHNEIDER, 2005).
Abb. 2: Schematische Darstellung der Genomorganisation des BDV und deren Transkripte (in Anlehnung an DE LA TORRE, 2002a)
Die ORFs des BDV sind als Rechtecke im Virusgenom dargestellt. Die Positionen der Start- und Stopsignale sind als blaue Pfeile (S1-S3) bzw. rote Marken (T1-T4, t6) eingezeichnet. Das Genom des BDV besitzt teilweise überlappende ORFs, eine eindeutige Gliederung der Signale für Transkriptioninitiation – intergenetische Region – Termination ist nicht gegeben. Das Signal S2 der zweiten Transkriptionseinheit ist 18 Nukleotide stromabwärts des Pt-Signals T1 der ersten Transkriptionseinheit lokalisiert, während das Terminations-Signal T2 der zweiten Transkriptionseinheit dagegen in dem S3-Signal der dritten Transkriptionseinheit in toto inkorporiert ist.
Die primären Transkripte der dritten Transkriptionseinheit (S3 - T3/ T4) werden durch posttrankriptionelle Prozessierung modifiziert und somit die Expression der BDV-spezifischen Proteine BDV-M, BDV-GP und BDV-L reguliert. Primär verfügen diese Transkripte über eine Größe von 2,8 kb bzw. 7,2 kb. Das 2,8 kb große Transkript enthält die sich überlappenden ORF III (BDV-M) und ORF IV (BDV-GP). Transkripte mit einer Größe von 7,2 kb enthalten zusätzlich das ORF V, welches BDV-L kodiert. Das Überlesen des Terminations-Signals T3 ist für die Synthese der 7,2 kb großen subgenomischen RNA und somit für die Expression des BDV-L essentiell.
Posttranskriptionelles Spleißen () und Fehlen der Introns in den subgenomischen RNAs sind durch nach oben offene Kerben gekennzeichnet. Die Größe der jeweiligen subgenomischen RNA ist links im Bild angegeben (blaue Schrift = Spleißvarianten).
rot-orange Boxen = core Proteine; dunkelblaue Boxen = Hüllproteine; hellblaue Box = Polymerase; Gelbe Box = nicht Strukturprotein; schraffiertes ORF = entsprechendes ORF wird nicht translatiert; N = Nukleoprotein;
P = Phosphoprotein; X = X-Protein; M = Matrixprotein; GP = Glykoprotein; L = large protein (Polymerase) N
P X
M
GP M
GP
L
GP
L M
N P M
GP
L
3‘
X5‘
T1
S1 S2 S3
T2 T3
t6
T4
Intron I
Intron II
Intron III 1,2 kB
1,9 kB 0,8 / 3,5 kB 2,8 kB
7,2 kB
1,6 / 6,1 kB
2,7 / 7,1 kB
1,5 / 6,0 kB
N N
P X PP X X
M
GP M
GP M
GP
L M
M
GP GP
L L
GP
GP GP
L
L L M
M M
N P M
GP
L
3‘
X5‘
T1
S1 S2 S3
T2 T3
t6
T4
Intron I
Intron II
Intron III
N
N PP MM
GP
L L X
3‘
X5‘
T1 T1 S1
S1 S2S2 S3S3
T2
T2 T3T3
t6 t6
T4 T4
Intron I
Intron II
Intron III 1,2 kB
1,9 kB 0,8 / 3,5 kB 2,8 kB
7,2 kB
1,6 / 6,1 kB
2,7 / 7,1 kB
1,5 / 6,0 kB
2.2.5 Proteine des BDV
BDV-N und BDV-P werden im Vergleich zu den anderen BDV-spezifischen Proteinen in großen Mengen exprimiert. BDV-N stellt mindestens 50% der in Virionen nachweisbaren BDV-Proteine dar (PYPER und CLEMENT, 1994), während BDV-GP in vivo und in vitro nur in 1-10 % der infizierten Zelle nachweisbar ist (RICHT et al., 1998; DE LA TORRE et al., 2002a).
2.2.5.1 Nukleoprotein
Die erste Transkriptionseinheit enthält das ORF I, welches für das virale Nukleoprotein (BDV-N) kodiert. Innerhalb der NNS RNA-Viren bildet das BDV als einziger Vertreter Isoformen des Nukleoproteins aus. Insgesamt werden zwei Isoformen des BDV-N exprimiert, die durch alternative Nutzung von zwei im Leserraster befindlichen Translations- Initiationskodons synthetisiert werden und ein Molekulargewicht von 40 kDa (p40) bzw.
38 kDa (p38) besitzen (PYPER und GARTNER, 1997). Nur die 40 kDa große Isoform verfügt über ein Kern-Lokalisierungs-Signal (nuclear localization signal, NLS) am N-terminalen Ende, das als karyophile Sequenz für die Translokation des Proteins in den Nukleus verantwortlich ist (PYPER und GARTNER, 1997; KOBAYASHI et al., 1998). Am C-Terminus beider Isoformen ist ein Kern-Export-Signal (nuclear export signal, NES) lokalisiert (KOBAYASHI et al., 2001; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002), mit dessen Hilfe das Nukleoprotein in das Zytoplasma gelangen kann. Des Weiteren besitzen beide Isoformen zwei unabhängige hydrophobe Interaktionsdomänen zur Bindung des Phosphoproteins am N-Terminus (BERG et al., 1998).
Generell sind Nukleoproteine der NNS RNA-Viren essentieller Bestandteil des Nukleokapsid (THOMAS et al., 1985; CALAIN und ROUX, 1993; BHELLA et al., 2002) und funktioneller Bestandteil des viralen Polymerase-Komplexes (Ribonukleoproteinkomplex, RNP).
KOBAYASHI et al. (2001) konnten zeigen, dass BDV-N als topogenes Protein eine Schlüsselrolle bei dem nukleozytoplasmatischen Transport des Ribonukleoproteins zukommt. Im Minireplikon-Modell konnte die unterstützende Wirkung der BDV-N Isoform p40 auf die Replikation und Transkription dargestellt werden, während für p38 kein intrinsischer Effekt auf die RNP-Syntheseleistung gezeigt werden konnte (PEREZ et al., 2003;
SCHNEIDER et al., 2003).
In vitro wurde das BDV-N vor allem im Zellkern der infizierten Zelle gefunden (PYPER und GARTNER, 1997), während bei experimentell infizierten Lewis Ratten BDV-N sowohl im Nukleus als auch im Perikaryon und den Fortsätzen nachzuweisen war (HERDEN, 1997;
HERDEN et al., 2000; WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003). Dabei war BDV-N disseminiert in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen vorhanden (DESCHL et. al.,
1990; HERDEN et al., 2000; WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003). Immunhistologisch konnte das Maximum der BDV-N-Expression zwischen dem 31. und 42. Tag p.i. darstellen werden, wobei auch in der chronischen Phase der Infektion bis zum 90. Tag p.i. die Expression auf diesem Niveau erhalten blieb (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003).
2.2.5.2 Phosphoprotein
Die zweite Transkriptionseinheit des BDV kodiert im ORF II für das Phosphoprotein (BDV-P;
THIERER et al., 1992; THIEDEMANN et al., 1992), welches ca. 2-3-mal kleiner ist als Phosphoproteine anderer Vertreter der Mononegavirales. Wie auch bei BDV-N beschrieben, werden zwei BDV-P-Isoformen mit einem Molekulargewicht von 24 kDa (p24) bzw. 16 kDa (p16) exprimiert. Beide Isoformen entstehen durch die alternative Nutzung zweier im Leseraster gelegener AUG-Startkodons bei der Proteinbiosynthese (SCHNEEMANN et al., 1995; SHOYA et al., 1998; KOBAYASHI et al., 2000; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Das komplette BDV-P besitzt zwei unabhängige NLS jeweils am N- und C-Terminus des Proteins (SHOYA et al., 1998; SCHWEMMLE et al., 1999b), die für den Transport des Proteins in den Zellkern benötigt werden. Das BDV-P verfügt über vier weitere Interaktionsdomänen. Dazu zählen eine BDV-X-bindende Domäne am N-Terminus, sowie eine Homo-Oligomerisationsdomäne und eine BDV-N- und BDV-L-Interaktionsdomäne am C-terminalen Ende (SCHWEMMLE et al., 1998; WOLFF et al., 2000; SCHNEIDER et al., 2004a).
Phosphoproteine von NNS RNA-Viren sind als essentielle Kofaktoren an der Transkription und Replikation beteiligt (BANERJEE et al., 1991; HORIKAMI et al., 1992). CURRAN (1998) demonstrierte anhand von Untersuchungen am Sendai Virus die Gerüstfunktion des Phosphoproteins, welches die RdRP in unmittelbare Nähe der Virus-RNA führt und somit die RNA-Synthese einleitet. Eine Funktion als Kotranskriptionsfaktor der viralen Polymerase und Stütze des Ribonukleoprotein-Komplexes wird auch für BDV-P angenommen (SCHWEMMLE et al., 1998; WOLFF et al., 2000; SCHNEIDER et al., 2004a), wobei die Funktion der Isoform p16 nicht genau bekannt ist.
In vitro konnte BDV-P vor allem im Nukleus, aber auch im Zytoplasma der infizierten Zelle nachgewiesen werden (KOBAYASHI et al., 1998, 2003; SCHWEMMLE et al., 1998, 1999b;
SHOYA et al., 1998). Bei experimentell infizierten Lewis Ratten ist BDV-P disseminiert in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen zu finden (HERDEN, 1997).
BDV-P konnte dabei sowohl im Nukleus, Zytoplasma und den Fortsätzen der infizierten Zelle nachgewiesen werden.
2.2.5.3 X-Protein
Das ORF-X ist in der Transkriptionseinheit II lokalisiert und kodiert für das BDV-X (WEHNER et al., 1997). Mit einer Molekularmasse von ca. 10 kDa (p10) ist BDV-X das kleinste beschriebene BDV-spezifische Protein (VAN DE WOUDE et al., 1990; PYPER et al., 1993;
CUBITT et al., 1994a; WEHNER et al., 1997; Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Die BDV-X-Proteinsynthese startet stromaufwärts des AUG-Startkodons von BDV-P und überlappt mit BDV-P in einem anderen Leseraster (Übersicht bei DE LA TORRE, 2002a;
Übersicht bei TOMONAGA et al., 2002). Das BDV-X interagiert über ein kurzes AS-Motiv mit BDV-P (MALIK et al., 2000; NOWOTNY et al., 2000; WOLFF et al., 2000) und bindet in vitro über eine Polypeptidfolge am N-terminalen Ende an den zellulären NLS-Rezeptor Importin α und wird vermutlich auf diesem Wege in den Nukleus transportiert (WOLFF et al., 2002).
Verschiedene NNS RNA-Viren kodieren Hilfsproteine, die nicht mittelbar für die virale RNA- Synthese gebraucht werden, aber an der Regulation verschiedener Phasen im viralen Vermehrungszyklus beteiligt sind (NAGAI und KATO, 1999; NEUMANN et al., 2002). BDV-X konnte anhand von in vitro-Versuchen als potentieller, negativer Regulationsfaktor des viralen Polymerase-Komplex identifiziert werden (PEREZ et al., 2003; SCHNEIDER et al., 2003; SCHWARDT et al., 2005).
WEHNER et al. (1997) wiesen BDV-X immunhistologisch im Nukleus von persistierend infizierten MDCK-Zellen nach. Ein davon abweichendes Reaktionsmuster konnte in vivo in Gehirnen experimentell infizierter Ratten und natürlich infizierter Pferde gezeigt werden, bei denen BDV-X überwiegend im Zytoplasma zu finden war (WEHNER et al., 1997). Im Minireplikon-Modell fanden KOBAYASHI et al. (2003) eine Akkumulation des BDV-X zusammen mit BDV-P im Zytoplasma der infizierten Zellen.
2.2.5.4 Matrixprotein
Die dritte Transkriptionseinheit enthält unter anderem das ORF III, welches für das Matrixprotein (BDV-M) kodiert (CUBITT et al., 1994a; BRIESE et al., 1994; KLICHE et al., 1994; STOYLOFF et al., 1997). Das BDV besitzt unter den Mononegavirales das kleinste M-Protein, welches an der inneren Schicht der Hüllmembran des Virions lokalisiert ist (KRAUS et al., 2001, 2005). Entgegen früheren Berichten, denen zufolge das BDV-M als Glykoprotein klassifiziert wurde, gilt mittlerweile als gesichert, dass das BDV-M ein typisches, nicht glykosiliertes Matrixprotein ist (KRAUS et al., 2001).
Matrixproteine behüllter RNA-Viren sind durch die Interaktion mit dem Ribonukleoprotein einerseits und viruskodierten Proteinen der Hüllmembran andererseits an der Freisetzung von reifen Viruspartikeln beteiligt (MARTIN und HELENIUS, 1991; GAROFF et al., 1998).
Eine aktive Beteiligung der Matrixproteine an der Freisetzung von Viruspartikeln konnte für das humane Immundefizienz (HI), Ebola und Lassa Virus gezeigt werden (MARTIN- SERRANO et al., 2001; STRECKER et al., 2003). Auch für das BDV-M wird eine Beteiligung beim Virus-assembly und -budding angenommen (KRAUS et al., 2001, 2005).
Untersuchungen mit rekombinantem BDV-M (rBDV-M) stützen diese Hypothese, da unter physiologischen Bedingungen das rBDV-M eine Tendenz zur Homo-Oligomerisation zeigt, mit Ausbildung stabiler Tetramere und Formation zu einer hochmolekularen, zweidimensionalen Gitterstruktur (KRAUS et al., 2005).
Mittels immunhistologischer Untersuchung zur spatio-temporale Ausbreitung in vivo wurde BDV-M im Zytoplasma von Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen nachgewiesen (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003). Interessanterweise war BDV-M in der chronischen Phase der Infektion vorwiegend in Astrozyten darstellbar. Mögliche Faktoren, die zu einer verstärkte Expression in Astrozyten führen, sind derzeit nicht bekannt.
Möglicherweise sind zellspezifische Transkriptions- oder Spleißstrategien an der vermehrten Synthese von BDV-M beteiligt.
2.2.5.5 Glykoprotein
In der Transkriptionseinheit III ist des Weiteren das ORF IV gelegen, welches für das einzige BDV-spezifische Glykoprotein BDV-GP kodiert. Das BDV-GP besteht aus einer Polypetidkette mit insgesamt 503 AS und besitzt im nicht glykosilierten Zustand ein Molekulargewicht von 56 kDa (p56; GONZALEZ-DUNIA et al., 1997; SCHNEIDER et al., 1997a). Das p56 stellt ein Vorläuferprotein dar, welches als Typ-I-Membranprotein im endoplasmatischen Retikulum (ER) inseriert (GONZALEZ-DUNIA et al., 1997). Durch kotranslationelle N-Glykosilierung im ER erhöht sich das Molekulargewicht auf 94 kDa (gp94;
RICHT et al., 1998).
Die meisten viralen Glykoproteine entstehen aus einem Vorläuferprotein nach proteolytischer Spaltung durch zelluläre Enzyme (VOLKOV et al., 1998; MAISNER et al., 2000; LENZ et al., 2001). Somit entscheidet die Zellausstattung, ob das infektiöse Virus entstehen kann oder nicht (Übersicht bei KLENK und ROTT, 1988; RICHT et al., 1998). Das BDV-GP enthält an mehreren Aminosäurepositionen multibasische Konsensussequenzen, die Motive zur endoproteolytischen Spaltung des BDV-GP darstellen. Anhand von in vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Konsensussequenzen der Endoprotease Furin, ein in eukaryontischen Zellen vorkommendes, calciumabhängiges subtilisinähnliches Enzym, als potentielles Erkennungsmotiv dienen (RICHT et al., 1998). Es ist jedoch bekannt, dass in vivo die proteolytische Spaltung viraler Glykoproteine auch durch andere subtilisinähnliche Endoproteasen erfolgen kann (Übersicht bei RIMA und DUPREX, 2005). Die
posttranskriptionelle Spaltung des gp94 ist essentiell für seine biologische Aktivität. Aus dem Vorläuferprotein gp94 entsteht Endoprotease-katalysiert am Arginin 249 eine 43 kDa (gp43) große Untereinheit, die dem C-terminalen Ende (BDV-GP-C) des gp94 entspricht, sowie ein stark glykosiliertes, 51 kDa großes Produkt (gp51), welches dem N-Terminus (BDV-GP-N) des gp94 entspricht (Abb. 3; RICHT et al., 1998; KIERMAYER et al., 2002). Das Vorläuferprotein gp94 akkumuliert vor allem im ER und in den perinukleären Regionen (EICKMANN et al., 2005). Lediglich BDV-GP-C konnte bislang auf der Oberfläche infizierter Zellen nachgewiesen werden, wo es in der Hüllmembran verankert vorliegt (GONZALEZ- DUNIA, 1997; EICKMANN et al., 2005).
Die Spaltprodukte des gp94 bestreiten unterschiedliche Funktionen im viralen Vermehrungszyklus. BDV-GP-N ist für die virale Bindung an den Wirtsrezeptor verantwortlich, während das BDV-GP-C in der Virushülle verankert ist und die pH-abhängige Fusion mit der Wirtsmembran bei saurem intrazellulären Milieu einleitet (SCHNEIDER et al., 1997a; GONZALEZ-DUNIA et al., 1998; PEREZ et al., 2001). EICKMANN et al. (2005) wiesen eine ungewöhnlich frühe Spaltung des BDV-GP im secretory pathway nach, die in vitro schon innerhalb des ER oder cis-Golgi-Apparates erfolgte. Eine derart frühe proteolytische Prozessierung ist ungewöhnlich und wurde für fehlerhaft gefaltete Pro- Insulinrezeptor-Proteine beschrieben, deren Spaltprodukte anschließend das ER nicht verlassen (BASS et al., 2000). In vitro konnte eine Akkumulation von BDV-GP vor allem im ER der infizierten Zelle nachgewiesen werden (GONZALEZ-DUNIA et al., 1997; KOHNO et al., 1999; BAJRAMOVIC et al., 2003; EICKMANN et al., 2005), sowie an den Kontaktstellen von Neuriten (BAJRAMOVIC et al., 2003).
Immunhistologische Untersuchungen an adulten, experimentell infizierten Lewis Ratten weisen auf eine ausschließliche Expression des BDV-GP in definierten Gehirnarealen und Zelltypen hin (RICHT et al., 1998; HERDEN, 1997; WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003).
Eine Restriktion der BDV-GP-Expression auf einzelne Neurone im Ammonshorn, Thalamus, Neocortex und Amygdala war zu beobachtet. Lediglich in Neuronen des Ammonshorns wiesen RICHT et al. (1998) eine vermehrte Expression des BDV-GP nach, während in anderen Bereichen signifikant weniger BDV-GP-positive Neurone detektiert werden konnten.
BDV-GP konnte vorwiegend innerhalb des Zytoplasmas von Neuronen und Ependymzellen nachgewiesen werden (HERDEN, 1997; RICHT et al., 1998). Untersuchungen zum Vorkommen des BDV-GP konnten belegen, dass im Rattenmodell immunhistologisch BDV- GP maximal zwischen dem 18. und 24. Tag p.i. nachweisbar war. Im weiteren Infektionsverlauf verminderte sich die detektierbare Menge des BDV-GP sukzessive (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003).
