Nucleus caudatus/ Putamen A
4.5 NACHWEIS BDV-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE IN EINZELZELLEN
Die absoluten Mengen BDV-N-, BDV-GP-N-, BDV-GP-C- und BDV-Intron I-spezifischer Transkripte wurden jeweils in zwei verschiedenen Zellpopulationen BDV-infizierter Lewis Ratten am 14., 24., 42. und 90. Tag p.i. bestimmt. In keiner der Kontrollen zum Nachweis der Spezifität des Sekundär-Antikörpers war ein zelltypisches Fluoreszenzsignal detektierbar.
Die quantitativen Daten wurden mit dem housekeeping Gen GAPDH normalisiert. Die so normalisierten Werte werden nachfolgend als „Kopien“ angegeben. Die statistische Auswertung erfolgte mittels zweifaktorieller (zweifakt.) Varianzanalyse (Tab. 19) und Turkey’s post-hoc Test für multiple paarweise Vergleiche. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die genannten p-Werte auf die Ergebnisse des paarweisen Vergleichs.
Tab. 19: Einfluss des Zeitpunkts p.i. und des Zelltyps auf die Höhe der BDV-spezifischen Transkripte
Variable BDV-N p-Wert BDV-GP-N p-Wert BDV-GP-C p-Wert BDV-Intron I p-Wert
Zelle 0,0442 0,4461 0,8786 0,0638
Zelle x ZP 0,0449 0,1160 0,2919 0,0228
ZP Neuron 0,0047 0,0074 0,0137 0,0017
ZP Astrozyt
0,2903 0,2269 0,8379 0,0458
Die p-Werte wurden mittels zweifaktorielle Varianzanalyse für gemischte Werte ermittelt. Zelle = generelle Unterschiede in der Transkriptmenge zwischen Neuronen und Astrozyten; Zelle x ZP = Wechselwirkung von Zelle und Zeit; ZP Neuron = Effekt des Zeitpunkts p.i. auf die Transkriptmenge in Neuronen; ZP Astrozyten = Effekt des Zeitpunkts p.i. auf die Transkriptmenge in Astrozyten; dunkelgraue Felder = statistisch signifikanter Anstieg der BDV-Kopienzahlen
Ein signifikanter Effekt des jeweiligen Zelltyps auf das quantitative Vorkommen viraler +ssRNA wurde für BDV-N bestätigt (Tab. 19; Variable „Zelle“). Dies äußerte sich in einer zeitunabhängigen und insgesamt höheren Transkriptmenge in Neuronen. Generelle Unterschiede in der Transkriptmenge zwischen Neuronen und Astrozyten konnte für BDV-GP-N und -GP-C statistisch nicht belegt werden (Tab. 19; Variable „Zelle“), jedoch konnte mittels paarweisem Vergleich für einzelne Zeitpunkte p.i. signifikant höhere Transkriptmengen bestätigt werden (4.5.2 und 4.5.3).
Für BDV-N- und BDV-Intron I-spezifische Transkripte war ein signifikanter, wechselseitiger Effekt des Zelltyps und des Zeitpunkts p.i. auf die Höhe der nachweisbaren Mengen vorhanden, der sich in einer signifikant stärkeren Zunahme der Kopienzahlen in Neuronen im Vergleich zu Astrozyten äußerte (Tab. 19; Variable „Zelle x Zeitpunkt).
Bei der Betrachtung des zeitlichen Einflusses auf die Transkriptmengen in den jeweiligen Zelltypen, konnten in Neuronen signifikante Unterschiede aller untersuchten
BDV-Transkripte gefunden werden (Tab. 19; Variable „ZP Neuron“), während in Astrozyten keine signifikanten Varianzen in der Menge BDV-N-, BDV-GP-N- und -BDV-GP-C-spezifischer +ssRNA gefunden wurden (Tab. 19; Variable „ZP Astrozyt“). Abweichend von dieser generellen Beobachtung erfolgte in Astrozyten eine signifikante Zu- und Abnahme der BDV-Intron I +ssRNA im Verlauf der Untersuchungsperiode (Tab. 19; Variable „ZP Astrozyt“).
4.5.1 BDV-N-spezifische Transkripte
Neuronen
Die quantifizierte Menge BDV-N-spezifischer Transkripte betrug am 14. Tag p.i. 4,16 Kopienzahlen/GAPDH (Kopien; Abb. 26). Am 24. Tag p.i. stieg diese signifikant um das 12,4fache auf 51,72 Kopien (p=0,0003). Im weiteren Verlauf nahm die Anzahl BDV-N-spezifischer Kopienzahlen sukzessive ab. Die in Neuronen nachweisbaren Transkriptmengen erreichten mit 6,84 Kopien am 90. Tag p.i. einen vergleichbaren Wert wie am 14. p.i. Die maximal nachgewiesenen Werte am 24. Tag p.i. waren signifikant größer als Werte, die am 42. (p=0,0051) und 90. Tag p.i. (p=0,004) gemessen wurden.
Astrozyten
In Astrozyten zeigten BDV-N-spezifische Transkriptmengen einen andersartigen zeitlichen Verlauf. Initial konnten am 14. Tag p.i. 5,31 Kopien gemessen werden (Abb. 26). Diese Menge erhöhte sich um den ca. 3,2fachen Wert am 24. Tag p.i. auf 16,07 Kopien.
Nachfolgend verringerte sich die Anzahl der quantifizierten Transkripte in Astrozyten wieder auf 10,95 Kopien und blieb bis zum Ende der Untersuchung auf diesem Niveau nachweisbar (10,58 Kopien am 90. Tag p.i.). Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den gemessenen Transkriptmengen der einzelnen Untersuchungszeitpunkte konnte nicht bestätigt werden.
Vergleich Neuronen versus Astrozyten
Zu Beginn und am Ende der Untersuchungsperiode wurden ähnliche Transkriptmengen in Astrozyten und in Neuronen nachgewiesen, wobei die gemessenen Mengen in Astrozyten geringfügig, aber nicht signifikant, höher lagen. Bereits am 24. Tag p.i. übertraf die Anzahl der entsprechenden Transkripte in Neuronen signifikant die Mengen in Astrozyten um das ca. 3,2fache (Abb. 26; p=0,0035). An den weiteren Untersuchungstagen wurden zwischen beiden Zellpopulationen keine signifikanten Unterschiede in der Höhe nachweisbarer BDV-N +ssRNA festgestellt. Die BDV-N-spezifischen Transkripte erreichten in beiden Zellpopulationen am 24. Tag p.i. ihre Maximalwerte, wobei eine stärkere Abnahme der Transkriptmenge in Neuronen erfolgte als in Astrozyten (Abb. 26).
0
Abb. 26: Expression der BDV-N-spezifischen Transkripte in Einzelzellen
y-Achse: normalisierte BDV-N-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; = signifikant größere Mengen in Neuronen als in Astrozyten (zweifakt. Varianzanalyse:
p<0,05); Neuronen: = signifikant größere Mengen am 24. als am 14., 42. und 90. Tag p.i. (p<0,01); ◊◊ = signifikant größere Mengen in Neuronen als in Astrozyten am 24. Tag p.i. (p<0,01)
4.5.2 BDV-GP-N-spezifische Transkripte
Neuronen
Die in Neuronen ermittelten BDV-GP-N-spezifischen Kopienzahlen betrugen am 14. Tag p.i.
0,87 Kopien (Abb. 27) und stiegen signifikant um den ca. 10,9fachen Wert auf 9,45 Kopie/GAPDH am 24. Tag p.i. (p=0,0079). Am nächst folgenden Untersuchungstag erhöhte sich die Transkriptmenge noch einmal geringfügig auf 11,29 Kopien, um somit die maximal nachzuweisenden Kopienzahlen zu erreichen. Die Transkriptmengen lagen am 42. Tag p.i.
signifikant über den Werten vom 14. Tag p.i. (p=0,0027). Anschließend reduzierte sich die Anzahl der BDV-GP-N-spezifischen Transkripte signifikant vom 42. zum 90. Tag p.i.
(p=0,0046) und erreichte mit 1,78 Kopien einen analogen Wert wie am 14. Tag p.i.
Astrozyten
exprimiert (4,20 Kopien). Eine signifikante Zu- oder Abnahme der BDV-GP-N-spezifischen Transkripte zu den verschiedenen Zeitpunkten p.i. konnte nicht bestätigt werden.
Vergleich Neuronen versus Astrozyten
Am 14. und 90. Tag p.i. waren in Astrozyten 3,6- bzw. 2,4-mal mehr BDV-GP-N-spezifische Transkripte nachweisbar als in Neuronen. Dies änderte sich am 24. und 42. Tag p.i., an denen in Neuronen das jeweils 1,2- bzw. 3,1-fache der Menge gemessen werden konnte, die in Astrozyten vorlag. Obwohl im globalen Vergleich keine Mengenunterschiede der BDV- GP-N-spezifischen Transkripte zwischen beiden Zelltypen festgestellt wurden, konnten am 42. Tag p.i. mittels paarweisem Vergleich signifikant mehr Transkripte in Neuronen nachgewiesen werden als in Astrozyten (Abb. 27; p=0,0283).
BDV-GP-N-spezifische Transkripte zeigten in Neuronen einen signifikanten Anstieg bis zum 42. Tag p.i., um am 90. Tag p.i. wieder signifikant abzufallen, während in Astrozyten eine geringfügige Zunahme der Kopienzahlen nur am 24. Tag p.i. zu messen war.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Neurone Astrozyten
BDV-GP-N-spezifische Kopienzahlen
normalisierte Kopienzahlen
** ◊
◊
*
*
Abb. 27: Expression der BDV-GP-N-spezifischen Transkripte in Einzelzellen
y-Achse: normalisierte BDV-GP-N-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; Neuronen: = signifikant größere Mengen am 24. als am 14. Tag p.i. (p<0,01);
= signifikant größere Mengen am 42. als am 14. und 90. Tag p.i. (p<0,01); ◊ = signifikant größere Mengen in Neuronen als in Astrozyten am 42. Tag p.i. (p<0,05)
14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
4.5.3 BDV-GP-C-spezifische Transkripte
Neuronen
Das Expressionsmuster der BDV-GP-C-spezifischen Transkripte in Neuronen zeigte einen übereinstimmenden Verlauf mit dem für BDV-GP-N +ssRNA beschriebenen. Eine minimale Expression war am 14. und 90. Tag p.i. feststellbar, dagegen wurden maximale Mengen am 42. Tag p.i. nachgewiesen. Zu Beginn der Untersuchung am 14. Tag p.i. konnte eine Anzahl von 1,79 Kopien gemessen werden, die sich auf das ca. 4,4fache am 24. Tag p.i. erhöhte (7,80 Kopien). Eine zweite Zunahme BDV-GP-C-spezifischer Kopienzahlen auf 16,00 Kopien erfolgte am 42. Tag p.i. Dieser Wert lag signifikant über dem initial am 14. Tag p.i.
gemessenen (p=0,0109). Vom 42. zum 90. Tag p.i. erfolgte eine signifikante Verringerung der Transkriptmenge auf 3,25 Kopien (p=0,0182).
Astrozyten
Die initial quantifizierten Mengen BDV-GP-C-spezifischer +ssRNA betrugen am 14. Tag p.i.
5,44 Kopien. Die Werte stiegen zunächst am 24. Tag p.i. auf 9,56 Kopien, um dann zum 42.
Tag p.i. wieder auf 6,41 Kopien abzunehmen. Ab dem 42. Tag p.i. konnte ein plateauartiger Verlauf der Menge BDV-GP-C-spezifischer Transkripte bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes beobachtet werden (5,83 Kopien am 90. Tag p.i.). Zwischen den Transkriptmengen der einzelnen Untersuchungszeitpunkte konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden.
Vergleich Neuronen versus Astrozyten
Ähnlich wie bereits für BDV-GP-N beschrieben, lagen die in Astrozyten nachweisbaren Mengen BDV-GP-C-spezifischer Transkripte am 14., 24. und 90. Tag p.i. 3,0-, 1,2- bzw.
1,7fach über den gemessenen Werten in Neuronen. Am 42. Tag p.i. konnte eine statistisch auffällig höhere Anzahl BDV-GP-C-spezifischer Transkripte in Neuronen nachgewiesen werden (p=0,0956).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Neurone Astrozyten
BDV-GP-C-spezifische Transkripte
normalisierte Kopienzahlen
*
*
*
Abb. 28: Expression der BDV-GP-C-spezifischen Transkripte in Einzelzellen
y-Achse: normalisierte BDV-GP-C-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; Neuronen: = signifikant größere Mengen am 42. als am 14. und 90. Tag p.i. (p<0,05)
4.5.4 BDV-Intron I-spezifische Transkripte
Neuronen
Ähnlich wie bei BDV-N-spezifischen Transkripten in Neuronen beschrieben, stieg zunächst die nachweisbare Menge der BDV-Intron I-spezifischen Kopienzahlen zum 24. Tag p.i., um dann bis zum 90. Tag p.i. wieder abzunehmen (Abb. 29). Initial betrug die Menge quantifizierbarer Transkripte 1,90 Kopien und stieg signifikant am 24. Tag p.i. um das ca.
9,9fache auf einen Wert von 18,74 Kopien an (p=0,0005). Nachfolgend sank die Menge der +ssRNA am 42. Tag p.i. auf 14,86 Kopien und weiter auf 3,54 Kopien am 90. Tag p.i. Die Reduktion der Menge BDV-Intron I-spezifischer Transkripte zwischen dem 42. und 90. Tag p.i., sowie zwischen dem 24. und 90. Tag p.i. war statistisch signifikant (p=0,005; p=0,0033).
Astrozyten
In Astrozyten wurde initial ein Wert von 3,98 Kopien am 14. Tag p.i. gemessen (Abb. 29). Die Anzahl nachweisbarer Transkripte stieg zunächst signifikant am 24. Tag p.i.
auf 12,27 Kopien (p=0,0228), womit gleichzeitig auch die maximal nachzuweisende Expression im Untersuchungszeitraum erreicht wurde. Nachfolgend verminderte sich die Anzahl spezifischer Transkripte signifikant am 42. Tag p.i. auf einen Wert von 4,09 Kopien 14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
(p=0,0242). Zum Ende der Untersuchungsperiode nahm die Menge BDV-Intron I-spezifischer Transkripte in Astrozyten noch einmal geringfügig zu (6,56 Kopien).
Vergleich Neuronen versus Astrozyten
Wie bereits bei BDV-N +ssRNA beschrieben, konnte ebenfalls für BDV-Intron I +ssRNA ein signifikanter, wechselseitiger Effekt des Zelltyps und des Zeitpunkts p.i. auf die nachweisbaren Kopienzahlen belegt werden, der sich in einer signifikant stärkeren Zu- und Abnahme der Kopienzahlen in Neuronen im Vergleich zu Astrozyten äußerte (Abb. 29;
zweifakt. Varianzanalyse: p=0,0228). Die nachweisbaren Mengen lagen in Astrozyten auch für BDV-Intron I-spezifische Transkripte am 14. und 90. Tag p.i. 2,1- bzw. 1,9fach über den gemessenen Werten in Neuronen. Am 24. Tag p.i. konnte in Neuronen eine statistisch auffällig höhere Anzahl BDV-Intron I-spezifischer Transkripte im Vergleich zu Astrozyten nachgewiesen werden (p=0,0512), hingegen waren am 42. Tag p.i. signifikant mehr Kopienzahlen in Neuronen vorhanden (p=0,0051). Vergleichbar mit den Verläufen von BDV-N +ssRNA zeigten BDV-Intron I-spezifische Transkripte in beiden Zellpopulationen am 24. Tag p.i. ihr Maximum, wobei eine stärkere Abnahme der Transkriptmenge in Neuronen erfolgte als in Astrozyten (Abb. 29).
0
Abb. 29: Expression der BDV-Intron I-spezifischen Transkripte in Einzelzellen
y-Achse: normalisierte BDV-Intron I-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; Neuronen: = signifikant größere Mengen am 24. als am 14. und 90. Tag p.i. (p<0,01);
= signifikant größere Mengen am 42. als am 90. Tag p.i. (p<0,01); Astrozyten: = signifikant größere
4.5.5 Zusammenfassender Vergleich
BDV-N-spezifische Transkripte waren in allen Proben in den größten Mengen vorhanden, auch wenn dafür nicht immer eine Signifikanz ermittelt werden konnte. Am 14. Tag p.i.
konnten weder in Neuronen noch in Astrozyten signifikante Unterschiede der einzelnen Transkripte untereinander festgestellt werden. Erst ab dem 24. Tag p.i. waren in Neuronen BDV-N-spezifische Kopienzahlen in signifikant höherer Anzahl nachweisbar als BDV-GP-N, BDV-GP-C und BDV-Intron I (p<0,0001). Am 42. Tag p.i. konnte eine signifikant höhere Expression von BDV-N-spezifischer +ssRNA nur noch gegenüber BDV-GP-N +ssRNA nachgewiesen werden (p=0,0182). Grundsätzlich war zwischen BDV-GP-N-, BDV-GP-C- und BDV-Intron I–spezifischen Kopienzahlen in Neuronen kein signifikanter Unterschied über die gesamte Untersuchungsperiode feststellbar. Eine Ausnahme stellte der 24. Tag p.i. dar, an dem eine signifikant höhere Menge BDV-Intron I +ssRNA im Vergleich zu BDV-GP-C +ssRNA gemessen wurden (p=0,0140) bzw. eine statistisch auffällig höhere Expression gegenüber BDV-GP-N +ssRNA ermittelt wurde (p=0,0796). Ein signifikanter Unterschied in der Mengen BDV-GP-N- und BDV-GP-C-spezifischer Transkripte bestand zu keinem Zeitpunkt p.i.
Anders verhielten sich die Relationen der Transkripte in Astrozyten zueinander. Prinzipiell waren BDV-N-spezifische Kopienzahlen in der größten Menge nachweisbar, ein signifikant höheres Vorkommen gegenüber BDV-GP-N-spezifischer +ssRNA konnte am 24., 42. und 90. Tag p.i. festgestellt werden (p≤0,0078). Im Vergleich dazu bestand gegenüber BDV-GP-C eine signifikant höhere Expression lediglich am 24. Tag p.i. (p=0,0322), während im Vergleich zu BDV-Intron I +ssRNA eine signifikant höhere Expression am 42. Tag p.i.
ermittelt wurde (p=0,0454). Signifikante Differenzen zwischen den quantifizierten Mengen BDV-GP-N-, BDV-GP-C- und BDV-Intron I-spezifischer Transkripte waren zu keinem Zeitpunkt feststellbar.
Während in Neuronen die Mengen der untersuchten BDV +ssRNAs signifikant zwischen den einzelnen Untersuchungszeitpunkten variierten, lagen in Astrozyten relativ konstante Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. vor. Eine Regulation der Transkriptmengen in Astrozyten zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. bestand abweichend einzig für BDV-Intron I.
0
Abb. 30: Verhältnis der BDV-spezifischen Transkripte in Neuronen
y-Achse: normalisierte BDV-spezifische Kopienzahlen (logarithmische Skalierung); arithmetischer Mittelwert;
= 24. Tag p.i.: signifikant größere Mengen BDV-N-spezifischer Kopienzahlen (p<0,001); = 24. Tag p.i.:
signifikant größere Mengen BDV-Intron I- als BDV-GP-C- spezifische Kopienzahlen (p<0,05); = 42. Tag p.i.:
signifikant größere Mengen BDV-N- als BDV-GP-N-spezifische Kopienzahlen (p<0,05)
1 Abb. 31: Verhältnis der BDV-spezifischen Transkripte in Astrozyten
y-Achse: arithmetische Mittelwerte der normalisierten, BDV-spezifischen Kopienzahlen (logarithmische Skalierung); Fehlerbalken = Standardabweichung; = 24. - 90. Tag p.i.: signifikant größere Mengen BDV-N- als BDV-GP-N-spezifische Kopienzahlen (p<0,05); = 24. und 42. Tag p.i.: signifikant größere Mengen BDV-N- als BDV-GP-N bzw. BDV-Intron I-spezifische Kopienzahlen (p<0,05)
BDV-N Neuron