Nucleus caudatus/ Putamen A
4.4 NACHWEIS BDV-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE IN GEHIRNAREALEN
Das quantitative Vorkommen von N-, GP-N-, GP-C-, Intron I- und BDV-AG-spezifischer +ssRNA wurde vergleichend in zwei verschiedenen Gehirnlokalisationen (Ammonshorn [AH] und Nucleus caudatus/ Putamen [CPu]) am 14., 24., 42. und 90. Tag p.i.
von BDV-infizierten Lewis Ratten untersucht. Die ermittelten Daten wurden mit einem Normalisierungsfaktor, der aus den housekeeping Genen bestimmt wurde, vorab normalisiert. Die normalisierten Werte werden nachfolgend als „Kopien“ angegeben. Die statistische Auswertung erfolgte mittels zweifaktorieller (zweifakt.) Varianzanalyse, t-Test für gepaarte Werte (Tab. 18) und Turkey’s post-hoc Test für multiple paarweise Vergleiche.
Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die genannten p-Werte im Text auf die Ergebnisse des paarweisen Vergleichs.
Tab. 18: Einfluss des Zeitpunktes p.i. und der Gehirnregion auf die Höhe der BDV-spezifischen +ssRNA
Variable BDV-N p-Wert
BDV-GP-N p-Wert
BDV-GP-C p-Wert
BDV-Intron I p-Wert
BDV-AG p-Wert
Region* 0,0402* 0,0496* 0,0328* 0,1137* 0,0084*
Region x ZP 0,3799 0,6737 0,9112 0,8204 0,0147
ZP AH 0,7931 0,6656 0,5415 0,4137 0,0153
ZP CPu 0,0068 0,0181 0,1001 0,0237 0,1266
Die p-Werte wurden mittels zweifaktorielle Varianzanalyse für gemischte Werte bzw. t-Test für gepaarte Werte ermittelt. * = statistische Datenauswertung: t-Test; Region = generelle Mengenunterschiede zwischen Ammonshorn und Nucleus caudatus/ Putamen; Region x ZP = Wechselwirkung von Region und Zeitpunkt p.i.; ZP AH = Effekt des Zeitpunkts p.i. auf die Transkriptmenge im Ammonshorn; ZP CPu = Effekt des Zeitpunkts p.i. auf die Transkriptmenge im Nucleus caudatus/ Putamen; dunkelgraue Felder = statistisch signifikanter Unterschied der BDV-Kopienzahlen
Die Untersuchung des quantitativen Vorkommens BDV-spezifischer +ssRNAs in den Gehirnregionen mittels t-Test ergab bei nahezu allen +ssRNAs eine signifikant höhere Menge spezifischer Kopienzahlen im AH als vergleichsweise im CPu (Tab. 18; Variable
„Region“). Lediglich für BDV-Intron I-spezifische +ssRNA konnte kein genereller, quantitativer Unterschied zwischen den beiden Gehirnregionen statistisch bestätigt werden (Tab. 18; Variable „Region“)
Einzig für BDV-AG +ssRNA war ein signifikanter, wechselseitiger Effekt der Region und des Zeitpunkts p.i. auf die Höhe der nachweisbaren Mengen vorhanden (Tab. 18; Variable
„Region x ZP"). Dadurch wurde im zeitlichen Verlauf eine signifikant stärkere Zunahme der Kopienzahlen im AH erreicht als im CPu.
Bei regionaler Betrachtung des jeweiligen Untersuchungszeitpunkts p.i. auf die Menge BDV-spezifischer +ssRNA, wurde im AH nur für BDV-AG eine signifikante Zunahme im Versuchsverlauf beobachtet (Tab. 18; Variable „ZP AH“). Für alle weiteren BDV-spezifischen Transkripte konnte im AH kein zeitlicher Effekt in Form einer signifikant variierenden Transkriptmenge während der Untersuchung bestätigt werden.
Ein Effekt des Zeitpunkts p.i. auf die +ssRNA-Mengen wurde dagegen im CPu gefunden.
Hier waren signifikant höhere Mengen BDV-N-, BDV-GP-N-, und BDV-Intron I-spezifischer Kopienzahlen zu späteren Zeitpunkten p.i. vorhanden (Tab. 18; Variable „ZP CPu“).
Lediglich für BDV-GP-C und für BDV-AG +ssRNA konnte in der zweifakt. Varianzanalyse kein zeitlicher Effekt im CPu bestätigt werden. Interessanterweise wurden jedoch mittels gepaartem Vergleich signifikant größere Mengen BDV-AG +ssRNA am 90. als am 24. Tag p.i. im CPu nachgewiesen.
4.4.1 BDV-N-spezifische Transkripte
Ammonshorn
Die BDV-N-spezifischen Kopienzahlen betrugen am 14. Tag p.i. 1,99 x 105 Kopien. Dieser Wert stieg um das ca.1,6fache auf 3,15 x 105 Kopien am 24. Tag p.i. (Abb. 19). Im weiteren Verlauf nahm die Anzahl BDV-N-spezifischer Kopienzahlen am 42. Tag p.i. wieder geringfügig ab (2,96 x 105 Kopien), um am 90. Tag p.i. auf das ca. 1,1fache des initial gemessenen Wertes zu fallen (2,15 x 105 Kopien).
Nucleus caudatus/ Putamen
Die BDV-N-spezifischen Kopienzahlen zeigten einen Zunahme vom 14. Tag p.i. zum 90. Tag p.i., mit einem plateauartigen Verlauf zwischen dem 24. und 42. Tag p.i. (Abb. 19). Initial wurden 5,19 x 104 Kopien gemessen. Dieser Wert stieg um das ca. 3,2fache auf 1,64 x 105 Kopien am 24. Tag p.i. an. Bis zum Ende der Untersuchung nahm die Anzahl BDV-N-spezifischer Kopienzahlen noch einmal zu und erreichte mit der ca. 4,8fachen Menge des initialen Wertes ihr Maximum am 90. Tag p.i. (2,51 x 105 Kopien). Mittels 2-fakt- Varianzanalyse konnte eine signifikant höhere Expression am 90. Tag p.i. im Vergleich zum 14. Tag p.i. bestätigt werden (zweifakt. Varianzanalyse: p=0,0068).
Vergleich Ammonshorn versus Nucleus caudatus/ Putamen
Eine generelle, signifikant höhere Expression BDV-N-spezifischer Transkripte im AH im Vergleich zum CPu konnte nachgewiesen werden (Tab. 18). Insgesamt wurden im AH bis einschließlich zum 42. Tag p.i. ca. 3,8-mal höhere (14. Tag p.i.) bzw. ca. 1,9-mal mehr BDV-N-spezifische Kopienzahlen (24. und 42. Tag p.i.) gemessen als im CPu. Erst am 90. Tag p.i. waren in beiden Gehirnarealen annähernd vergleichbare BDV-N-spezifische Kopienzahlen quantifizierbar. Im Ammonshorn wurden maximale Werte bereits am 24. Tag p.i. gemessen, während im CPu diese erst am 90. Tag p.i. erreicht wurden (Abb. 19).
0 100.000 200.000 300.000 400.000 500.000 600.000
Ammonshorn Nucleus caudatus/ Putamen
BDV-N-spezifische Transkripte
normalisierte Kopienzahlen
**
**
Abb. 19: Expression der BDV-N-spezifischen Transkripte in den Gehirnregionen
y-Achse: normalisierte BDV-N-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; = signifikant größere Mengen im AH als im CPu (t-Test: p<0,05); CPu: = signifikant größere Mengen BDV-N-spezifischer Kopienzahlen am 90. als am 14. Tag p.i. (zweifakt. Varianzanalyse: p<0,01) 14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
4.4.2 BDV-GP-N-spezifische Transkripte
Ammonshorn
Die im AH quantifizierten Kopienzahlen betrugen am 14. Tag p.i. 1,92 x 104 Kopien und stiegen am 24. Tag p.i. um das ca. 3,2fache auf 4,25 x 104 Kopien an (Abb. 20). An den nachfolgenden Untersuchungstagen verminderte sich die Menge nachweisbarer BDV-GP-N-spezifischer Kopienzahlen zum 42. Tag p.i. zunächst auf 3,24 x 104 Kopien und nahm dann bis zum 90. Tag p.i. einen annähernd plateauartigen Verlauf an (3,13 x 104 Kopien).
Nucleus caudatus/ Putamen
Zu Beginn der Untersuchung am 14. Tag p.i. konnten im CPu 5,14 x 103 Kopien nachgewiesen werden (Abb. 20). Ein sprunghafter Anstieg um das ca. 3,9fache der initial gemessenen Werte erfolgte am 24. Tag p.i. auf einen Wert von 1,99 x 104 Kopien. Die zweite sprunghafte Zunahme BDV-GP-N-spezifischer Kopienzahlen erfolgte zum 90. Tag p.i.
(3,06 x 104 Kopien), an dem auch die maximale Expression nachgewiesen wurde. Die BDV-GP-N-spezifischen Transkripte waren am 90. Tag p.i. ca. 6-mal höher exprimiert als am 14.
Tag p.i. und lagen damit signifikant über den eingangs gemessenen Werten (zweifakt.
Varianzanalyse: p=0,0181).
Vergleich Ammonshorn versus Nucleus caudatus/ Putamen
Insgesamt konnte im globalen Vergleich eine signifikant höhere Expression BDV-GP-N-spezifischer Transkripte im AH bestätigt werden (Tab. 18). Dies äußerte sich in einer generell höheren Expression im AH bis einschließlich zum 42. Tag p.i. (Abb. 20). Am 90. Tag p.i. erreichten die nachweisbaren BDV-GP-N-spezifischen Transkripte im AH und CPu vergleichbare Werte. Der maximal messbare Wert BDV-GP-N-spezifischer Transkripte wurde im AH am 24. Tag p.i. erreicht, während im CPu dieser am 90. Tag p.i. zu messen war.
0
Abb. 20: Expression der BDV-GP-N-spezifischen Transkripte in den Gehirnregionen
y-Achse: normalisierte BDV-GP-N-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; = signifikant größere Mengen im AH als im CPu (t-Test: p<0,05); CPu: = signifikant größere Mengen am 90. als am 14. Tag p.i. (zweifakt. Varianzanalyse: p<0,05)
4.4.3 BDV-GP-C-spezifische Transkripte
Ammonshorn
Ausgehend vom 14. Tag p.i. stieg die exprimierte Menge BDV-GP-C-spezifischer Transkripte im AH von 1,90 x 104 um das ca. 2fache auf 3,86 x 104 Kopien am 24. Tag p.i. an (Abb. 21).
Am 42. Tag p.i. war ein geringer Abfall der BDV-GP-C-spezifischer Kopienzahlen zu messen (3,12 x 104 Kopien). Die Mengen stiegen jedoch am 90. Tag p.i. wieder auf einen vergleichbaren Wert wie am 24. Tag p.i. an (3,86 x 104 Kopien).
Nucleus caudatus/ Putamen
Die quantifizierten Mengen BDV-GP-C-spezifischer Kopienzahlen betrugen initial 4,71 x 103 Kopien am 14. Tag p.i. (Abb. 21). Die Menge erhöhte sich zunächst am 24. Tag p.i. um das 4fache des ursprünglichen Werts (1,89 x 104 Kopien) und nahm bis zum 42. Tag p.i. einen plateauartigen Verlauf an (1,84 x 104 Kopien). Ein zweites Mal erhöhte sich die Menge BDV-GP-C-spezifischer Transkripte am 90. Tag p.i. auf den ca. 6,7fachen Wert der Kopienzahlen vom 14. Tag p.i. (3,16 x 104 Kopien). Gleichzeitig wurde zu diesem Zeitpunkt auch das Maximum der BDV-GP-C-Expression im CPu erreicht. Mittels zweifakt. Varianzanalyse war kein Einfluss des Zeitpunktes p.i. auf die Höhe der Transkriptmenge festzustellen.
14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
Vergleich Ammonshorn versus Nucleus caudatus/ Putamen
Eine generell signifikant höhere Expression BDV-GP-C-spezifischer Transkripte im AH konnte mittels t-Test bestätigt werden (Tab. 18). Die messbaren Werte BDV-GP-C-spezifischer Kopienzahlen waren im AH am 14. Tag p.i. ca. 4-mal höher als im CPu. Im Verlauf der Untersuchung sank die Differenz BDV-GP-C-spezifischer Transkripte bis zum 42.
Tag p.i. (Abb. 21). Am 90. Tag p.i. lagen vergleichbare Transkriptmengen im AH und CPu vor. Im CPu wurden am 90. Tag p.i. Maximalwerte erreicht.
0 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000 80.000 90.000 100.000
Ammonshorn Nucleus caudatus/ Putamen
BDV-GP-C-spezifische Transkripte
normalisierte Kopienzahlen
Abb. 21: Expression der BDV-GP-C-spezifischen Transkripte in den Gehirnregionen
y-Achse: normalisierte BDV-GP-C-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; = signifikant größere Mengen im AH als im CPu (t-Test: p<0,05)
14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
4.4.4 BDV-Intron I-spezifische Transkripte
Ammonshorn
Insgesamt zeigten BDV-Intron I-spezifische Kopienzahlen im AH einen bimodalen Verlauf (Abb. 22). Am 14. Tag p.i. betrug die Menge nachweisbarer Transkripte 1,62 x 104 Kopien und erhöhte sich am 24. Tag p.i. um das 2fache auf einen Wert von 3,24 x 104 Kopien.
Zunächst sank die Anzahl BDV-Intron I-spezifischer Kopienzahlen am 42. Tag p.i. auf 2,58 x 104 Kopien, um nachfolgend bis zum 90. Tag p.i. auf den 2,4fachen Wert der ursprünglich quantifizierten Menge anzusteigen (3,86 x 104 Kopien). Die maximalen BDV-Intron I-spezifischen Kopienzahlen wurden am 90. Tag p.i. gemessen.
Nucleus caudatus/ Putamen
Im CPu konnten initial 5,42 x 103 Kopien am 14. Tag p.i. ermittelt werden (Abb. 22). Die Anzahl nachweisbarer Transkripte nahm zunächst am 24. Tag p.i. um das ca. 4fachen zu (2,18 x 104 Kopien), verminderte sich jedoch geringfügig am 42. Tag p.i. auf den 3,3fachen Wert der initial gemessenen Kopienzahlen auf 1,80 x 104 Kopien. Eine erneute Zunahme BDV-Intron I-spezifischer Kopienzahlen erfolgte am 90. Tag p.i. auf den 7,2fachen Wert der eingangs erfassten Kopienzahlen. Dieser lag signifikant über dem initialen Wert am 14. Tag p.i. (p=0,0158). Gleichzeitig wurde hier mit einem Wert von 3,88 x 104 Kopien die maximale Expression erreicht.
Vergleich Ammonshorn versus Nucleus caudatus/ Putamen
Zwischen den Gehirnregionen AH und CPu konnten keine signifikanten Unterschiede in der Menge BDV-Intron I-spezifischer Transkripte festgestellt werden (Tab. 18). Die nachweisbaren Kopienzahlen waren im AH am 14. Tag p.i. ca. 3-mal höher als vergleichsweise im CPu. Im Verlauf der Untersuchung sank die Differenz BDV-Intron I-spezifischer Transkripte bis zum 42. Tag p.i. (Abb. 22). Am 90. Tag p.i. hatten sich die Transkriptmengen im AH und CPu nahezu angepasst.
0 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000 80.000 90.000 100.000
Nucleus caudatus/ Putamen Ammonshorn
BDV-Intron I-spezifischeTranskripte
normalisierte Kopienzahlen
*
*
Abb. 22: Expression der BDV-Intron I-spezifischen Transkripte in den Gehirnregionen
y-Achse: arithmetische Mittelwerte der normalisierten, BDV-Intron I-spezifischen Kopienzahlen; Fehlerbalken = Standardabweichung; CPu: = signifikant größere Mengen am 90. als am 14. Tag p.i. (p<0,05)
4.4.5 BDV-AG-spezifische +ssRNA
Ammonshorn
Insgesamt stieg im AH die Expression BDV-AG-spezifischer Kopienzahlen kontinuierlich über den gesamten Untersuchungszeitraum an. BDV-AG-spezifische Transkripte konnten ab dem 14. Tag p.i. mit einer initialen Menge von 3,02 x 101 Kopien nachgewiesen werden (Abb. 23). Im weiteren Verlauf stieg die Menge quantifizierbarer +ssRNA sprunghaft um das 4,8fache der eingangs gemessenen Werte auf 1,44 x 102 Kopien am 24. Tag p.i. an. Zum 42. Tag p.i. erhöhte sich die BDV-AG +ssRNA auf 2,75 x 102 Kopien und lag damit signifikant über dem Wert vom 14. Tag p.i. (p=0,0423). Die nachweisbaren Kopienzahlen stiegen noch einmal signifikant am 90. Tag p.i. auf einen Wert von 5,72 x 102 Kopien (p=0,0189), wodurch die maximale Expression im AH erreicht wurde. Der Wert am 90. Tag p.i. war ca. 18,9-mal höher als die initial quantifizierten Mengen. Die nachweisbaren Werte am 90. Tag p.i. lagen zusätzlich signifikant über den bestimmten Kopienzahlen am 14.
(p=0,0007) und 24. Tag p.i. (p = 0,0029).
14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
Nucleus caudatus/ Putamen
Im CPu konnten BDV-AG-spezifische Kopienzahlen erstmals am 24. Tag p.i. nachgewiesen werden (1,04 x 101 Kopien). Zunächst stieg die BDV-AG-Expression im CPu am 42. Tag p.i.
sprunghaft auf den 13,9fachen Wert der am 24. Tag p.i. gemessenen Kopienzahlen an (Abb. 23; 1,45 x 102 Kopien). Im weiteren Verlauf erfolgte eine Reduktion der Menge quantifizierbarer +ssRNA auf 9,87 x 101 Kopien am 90. Tag p.i. Obwohl im globalen Vergleich keine signifikanten Mengenunterschiede ermittelt werden konnten (Tab. 18), war im gepaarten Vergleich eine signifikant höhere Menge BDV-AG +ssRNA am 90. als am 24.
Tag p.i. bestimmt werden (p=0,0005)
Vergleich Ammonshorn versus Nucleus caudatus/ Putamen
Eine generelle, signifikant höhere Expression BDV-AG +ssRNA war im AH im Vergleich zum CPu vorhanden (Tab. 18). Am 24. Tag p.i. waren im AH 13,88-mal mehr BDV-AG-spezifische Kopienzahlen messbar als im CPu. Im weiteren Verlauf der Untersuchung verminderte sich diese Differenz, jedoch konnten zusätzlich zum globalen Test auch im paarweisen Vergleich am 90. Tag p.i. signifikante Unterschiede in Form höherer Kopienzahlen im AH nachgewiesen werden (p=0,0002). Die maximalen Werte BDV-AG-spezifischer Kopienzahlen konnten im AH am 90. Tag p.i. gemessen werden. Im CPu wurde schon am 42. Tag p.i. die maximal nachzuweisenden Mengen erreicht, wobei im weiteren Verlauf die Menge der BDV-AG- Kopienzahlen abnahm.
0
Abb. 23: Expression der BDV-AG-spezifischen +ssRNA in den Gehirnregionen
y-Achse: normalisierte BDV-AG-spezifische Kopienzahlen; arithmetischer Mittelwert; Fehlerbalken = Standardabweichung; = signifikant größere Mengen im AH als im CPu (t-Test: p<0,01); AH: = signifikant größere Mengen am 90. als am 14., 24. und 42. Tag p.i. (p<0,05); = signifikant größere Mengen am 42. als am 14. Tag p.i. (p<0,05); CPu: = signifikant größere Mengen am 90. als am 24. Tag p.i. (p<0,001)
4.4.6 Zusammenfassender Vergleich
Unabhängig von der untersuchten Gehirnlokalisation wurden alle BDV-spezifischen Transkripte am 14. Tag p.i. am geringsten exprimiert. Generell waren BDV-N-spezifische Transkripte zu allen Zeitpunkten p.i. in beiden Gehirnarealen signifikant höher exprimiert als alle weiteren untersuchten +ssRNAs (p<0,05; Abb. 24 und Abb. 25). BDV-AG-spezifische +ssRNA war generell zu allen Zeitpunkten p.i. in den niedrigsten Mengen nachweisbar, eine Signifikanz konnte aber lediglich gegenüber BDV-N-spezifischen Transkripten festgestellt werden (beide Regionen, alle Zeitpunkte p.i.: p<0,05) und gegenüber BDV-Intron I im CPu am 90. Tag p.i. (p=0,0083). BDV-GP-N-, BDV-GP-C- und BDV-Intron I-spezifische Transkripte wurden im jeweiligen Gehirnareal zu allen Zeitpunkten p.i. in vergleichbaren Mengen exprimiert.
Prinzipiell wurde ein regionaler Einfluss in Form einer signifikant höheren Expression BDV-spezifischer +ssRNA im AH für BDV-N, BDV-GP-N, BDV-GP-C und BDV-AG bestätigt.
Lediglich für BDV-Intron I-spezifische Transkripte konnte kein regionenspezifischer Effekt auf das quantitative Vorkommen beobachtet werden. Im CPu war ein Einfluss der Zeit auf die Mengen BDV-spezifischer +ssRNA nachweisbar. Eine Ausnahme stellte BDV-AG +ssRNA dar, da die +ssRNA-Mengen eine signifikant stärkere Zunahme im AH als im CPu aufwiesen.
14. Tag p.i.
24. Tag p.i.
42. Tag p.i.
90. Tag p.i.
1
Abb. 24: Verhältnis der BDV-spezifischen +ssRNAs im Ammonshorn
y-Achse: normalisierte BDV-spezifische Kopienzahlen (logarithmische Skalierung); arithmetischer Mittelwert;
= 14. und 90. Tag p.i.: signifikant größere Menge BDV-N-spezifischer Kopienzahlen im Vergleich zu allen weiteren (p<0,01); = 24. und 42. Tag p.i.: signifikant größere Menge BDV-N-spezifischer Kopienzahlen im Vergleich zu allen weiteren (p<0,001)
Abb. 25: Verhältnis der BDV-spezifischen +ssRNAs im Nucleus caudatus/ Putamen
y-Achse: normalisierte BDV-spezifische Kopienzahlen (logarithmische Skalierung); arithmetischer Mittelwert; = 14. Tag p.i.: signifikant größere Menge BDV-N-spezifischer Kopienzahlen im Vergleich zu allen weiteren (p<0,01); = 24. - 90. Tag p.i.: signifikant größere Menge BDV-N-spezifischer Kopienzahlen im Vergleich zu allen weiteren (p<0,001); = signifikant mehr BDV-Intron I- als BDV-AG-spezifische Kopienzahlen (p<0,01)
42. Tag p.i. 90. Tag p.i.