Nucleus caudatus/ Putamen A
3.9 REAL-TIME RT-PCR
3.9.1 Spezifische Reverse Transkription
Die isolierte RNA aus dem Gehirnschnitt, den Gehirnarealen und definierten Zellpopulationen wurde unter Verwendung des Omniskript® RT Kit (Qiagen) in einem Multicycler® PTC 200 (Biozym Diagnostik GmbH) in cDNA umgeschrieben. Die RT erfolgte mit dem spezifischen antisense Primer, sodass ausschließlich RNA mit positiver Polarität der Nukleinsäuresequenz (+ssRNA/ mRNA) in cDNA umgeschrieben wurde. Die Primer p333 (BDV-N), p351 (BDV-Intron I), p340 (BDV-GP-N), p342 (BDV-GP-C), p386 (BDV-AG) p322 (SDHA), p324 (HPRT) und p339 (GAPDH) dienten zur Herstellung der spezifischen cDNAs (Tab. 5). Die verwendeten antisense Primer wurden in einer Konzentration von 7,5 pmol/µl zugegeben. Für jede in der real-time PCR zu untersuchende RNA wurde separat ein entsprechender RT-Reaktionsansatz hergestellt. Jeweils 6 µl RNA aus 3.8 wurden benötigt, um für jede zu quantifizierende RNA je 10 µl spezifische cDNA zu synthetisieren (Tab. 11).
RNA aus dem Gehirnschnitt und Gewebearealen: Von jeder RNA-Probe wurden acht Aliquots zu je 6 µl RNA in 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäßen hergestellt und die oben genannten Primer verwendete.
Die RNA-Stammlösungen aus dem Gehirnschnitt (3.8.1) wurden vorab mit DEPC-Aqua bidest. auf 25 ng/µl RNA-Gebrauchslösung eingestellt, sodass pro Reaktion insgesamt 150 ng RNA umgeschrieben wurden.
RNA aus Einzelzellen: Von jeder RNA-Probe wurden fünf Aliquots zu je 6 µl RNA in 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäßen hergestellt. Aufgrund der minimalen RNA-Ausbeute bei der Isolierung geringer Zellzahlen wurde die RT auf die Herstellung von BDV-N-, BDV-Intron I-, BDV-GP-N-, BDV-GP-C- und GAPDH-spezifischer cDNA beschränkt. Die 12 µl RNA-Eluat wurden vorab mit DEPC-Aqua bidest. ad 31 µl aufgestockt.
Proben für den Kontaminationsausschluss: Zum Ausschluss einer Verschleppung von (Fremd-) Gewebe bzw. Nukleinsäuren durch die PEN-MembraneSlides oder das OCT-Einbettmedium wurden die Eluate aus 3.8.4 mit den Primern p333 (BDV-N) und p339 (GAPDH) in die RT eingesetzt. Von jeder Probe wurden zwei Aliqouts zu je 6 µl RNA in 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäßen hergestellt.
Tab. 11: Ansatz zur Herstellung eines 10 µl cDNA-Reaktionsansatzes (RT-Mastermix)
Reagenz Konz.
Stamm-Lsg.
Volumen Konz.
10 µl RT-MM
Hersteller
A) RNA-Primer-Mix
RNA aus 3.8 6,0 µl
spezifischer as-Primer 7,5 µM 1,0 µl 0,75 µM MWG B) RNaseOUT-Mix, 10 µl-Ansatz (für 20 RT-Reaktionen)
DEPC-Aqua bidest. 6,5 µl
buffer RT 10 x 1,0 µl 1 x Qiagen
RNaseOUTTM Recombinant
Ribonuclease Inhibitor 40 U/µl 2,5 µl 10 U/µl Invitrogen C) RT-Mastermix
buffer RT 10 x 1,0 µl 1 x Qiagen
dNTP-Mix 5 mM 1,0 µl 500 nM Qiagen
RNaseOUTTM-Mix aus B 10 U/µl 0,5 µl 5 U/10 µl Omniskript®
Reverse Transkriptase 4 U/µl 0,5 µl 2 U/10 µl Qiagen D) 10 µl RT-Reaktionsansatz
RT-Mastermix aus C 3,0 µl
RNA-Primer-Mix aus A 7,0 µl
Gesamt 10,0 µl
Konz. Stamm-Lsg. = Konzentration der Stammlösung; Konz. 10 µl MM = finale Konzentration im RT-Mastermix; as = antisense; RT = reverse Transkription; dNTP-Mix = Desoxynukleotid-Mix
Die einzelnen Arbeitsschritte der spezifischen reversen Transkription wurden auf Eis pipettiert und wie folgt durchgeführt:
1) Zugabe von je 1 µl spezifischem Primer in jedes RNA-Aliquot, Ansatz vortexen und kurz zentrifugieren
2) Zur Primeranlagerung und Aufschmelzen von Sekundärstrukturen der RNA den RNA-Primer-Mix in einem Eppendorf Thermomixer comfort (OMNILAB Laborzentrum GmbH
& Co. KG) 5 Minuten bei 70°C und 350 rpm inkubieren
3) Anschließend den Ansatz sofort wieder auf Eis transferieren und ca. eine Minute abkühlen lassen
4) Dem abgekühlten RNA-Primer-Mix je 3 µl RT-Mastermix hinzufügen, vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren
Der RT-Reaktionsansatz wurde unter folgenden Temperaturbedingungen inkubiert: 25°C für 10 Minuten, 37°C für 1 Stunde, 93°C für 5 Minuten und schließlich 4°C bis zur Entnahme der Proben. Die cDNA-Proben wurden bei -80°C bis zur weiteren Verwendung asserviert.
3.9.2 real-time PCR 3.9.2.1 Reaktionsbedingungen
Für jedes Primer- und Sondenpaar wurden die Primeranlagerungstemperatur und die jeweiligen Primer- und TaqMan®-Sondenkonzentration gemäß den Empfehlungen des Introduction to Quantitative PCR, Methods and Application Guide (Stratagene®, 2005) bestimmt, um optimale Reaktionsbedingungen zu erhalten. Die Durchführung erfolgte im Thermocycler Mx3005PTM Real-time PCR System (Stratagene® Europe, Amsterdam). Als Matrize diente der entsprechende Mengenstandard in einer Konzentration von 107 Kopien/µl (3.6). Die so ermittelten Reaktionsbedingungen sind in Tab. 12 aufgelistet.
Tab. 12: Zusammenfassung der jeweils verwendeten Konzentrationen der Primer und TaqMan®-Sonde und deren spezifische Primeranlagerungstemperatur
Bezeichnung
Primer-ID = interne Bezeichnung des Primers; Konz. = Konzentration; s = sense Primer; as = antisense Primer;
* = Sequenz s. Tab. 5
3.9.2.2 Reaktionsansatz
Für die Quantifizierung BDV-spezifischer und zellulärer cDNAs wurde das Brilliant® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene®) und 5’-FAM-3’-TAMRA-markierte TaqMan®-Sonden (Eurogentec SA), sowie der Thermocycler Mx3005PTM Real-time PCR System (Stratagene®) verwendet. Als passiver Referenz-Farbstoff diente ROX. Zur Korrektur möglicher intraexperimenteller Variationen wurde jede Probe grundsätzlich als Duplikat in die real-time PCR eingesetzt. Eine Übersicht der Reaktionsbedingungen gibt Tab. 13.
Tab. 13: Ansatz zur Herstellung eines 25 µl real-time PCR-Reaktionsansatzes
Reagenz Konz.
Stamm-Lsg.
Volumen Konz. 25 µl MM
real-time PCR-Mastermix
Core PCR buffer 10 x 2,50 µl 1 x
MgCl2 50 mM 2,50 µl 5 mM
dNTP-Mix 20 mM 1,00 µl 800 µM
sense Primer 15 µM
antisense Primer 15 µM
TaqMan®-Sonde 50 µM
s.
Tab. 12
Rox reference dye 5 µM 0,38 µl 76 nM
SureStart® Taq DNA
Polymerase 5 U/µl 0,13 µl 0,65 U/25 µl
DEPC-Aqua bidest. ad 24,00 µl
25 µl real-time PCR-Reaktionsansatz
Mastermix 24,00 µl
Matrize 1,00 µl
Gesamt 25,00 µl
Konz. Stamm-Lsg. = Konzentration der Stammlösung; Konz. 25 µl MM = finale Konzentration im real-time PCR Mastermix; dNTP-Mix = Desoxynukleotid-Mix
Die real-time PCR wurde als two-step-PCR durchgeführt, wobei die Primeranlagerung und die Elongation der DNA-Matrize in einem PCR-Schritt zusammengefasst wurden. Während dieser Phase erfolgte die Aufzeichnung der Fluoreszenz.
Die Amplifikation wurde für jedes Primer- und Sonden-Paar unter Verwendung der jeweils spezifischen Primeranlagerungstemperatur (Tab. 12) durchgeführt:
Denaturierung und
Aktivierung der SureStart® Taq: 95°C für 10 Minuten 40 Zyklen
• Denaturierung: 95°C für 15 Sekunden
• Anlagerung/ Elongation: Temperatur (Tab. 12) für 1 Minute Ende
3.9.2.3 Kontrollen
Als Positivkontrolle und zur Korrektur möglicher interexperimenteller Schwankungen diente gleichermaßen isolierte und umgeschriebene cDNA aus gepoolten Gehirnschnitten BDV-infizierter Lewis Ratten vom 42. Tag p.i. Zum Ausschluss einer Kontamination wurde für jedes Primerpaar ein Doppelansatz mitgeführt, der anstelle der DNA-Matrize DEPC-Aqua bidest. enthielt.
In jeder Versuchsdurchführung zum Nachweis antigenomischer RNA wurden Amplifikate des Plasmids V BDV-S1 (BDV-S1) als Negativkontrolle hinzu gegeben (Abb. 8). Auf diese Weise sollte eine mögliche Signalemission durch die BDV-AG-TaqMan®-Sonde nach Hybridisieren an BDV-N-spezifische cDNA ausgeschlossen werden. Die Plasmid-DNA wurde in einer PCR gemäß 3.6.1 unter Verwendung der Primer M13 forward und reverse vervielfältigt und in einer Konzentration von 109 Kopien/µl in einem Vierfachansatz eingesetzt. Um die Abhängigkeit des Fluoreszenz-Signals vom Binden des sense Primers zu verdeutlichen, wurde der Primer p385 durch den Primer T7 (Abb. 9) ersetzt und das Reaktionsgemisch als Doppelansatz mitgeführt. Zusätzlich wurde eine PCR gemäß 3.5.3 unter Verwendung der BDV-S1-Amplifikate als Matrize und der Primer M13 forward und reverse und p389/ p391 und p385/ p386 durchgeführt, um ein falsch negatives Ergebnis durch Fehlen BDV-S1-spezifischer Amplifikate auszuschließen.
3.9.3 Quantifizierung und Normalisierung der Genexpression
Die Aufzeichnung und Auswertung der Daten erfolgte während der Amplifikation mit dem Thermocycler Mx3005PTM Real-time PCR System und der dazugehörenden Software Mx3005P Version 2.02 von 2004 (beides Stratagene®). Während der Primeranlagerung/
Elongation wurde die vom Reporter-Farbstoff (FAM) und Referenz-Farbstoff (ROX) emittierte Fluoreszenz von dem Gerät aufgezeichnet und mit Hilfe der Software der Quotient beider Farbstoffe (Emission Reporter/Emission Referenzfarbstoff) berechnet und so das normalisierte Reportersignal (Rn-Wert) bestimmt. Durch die Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz (Rn(-)-Wert) der ersten PCR-Zyklen vom relativen Reportersignal (Rn(+)-Wert) wurde der ∆-Rn-Wert ermittelt. Der PCR-Zyklus, bei dem die Fluoreszenz signifikant über der Hintergrundfluoreszenz lag, wurde als threshold cycle (Ct) definiert.
Durch die graphische Darstellung der initialen DNA-Kopienzahlen der jeweiligen log10
Standardverdünnungsreihen auf der x-Achse gegen die dazugehörenden Ct-Werte auf der y-Achse wurde von der Software die jeweilige Standardkurve erstellt. Durch Interpolation der Ct-Werte der Proben wurde von diesen die Startkopienzahl errechnet.
Für die Normalisierung der ermittelten BDV-spezifischen Kopienzahlen aus den Proben der Gehirnschnitte und Gehirnareale wurde aus den housekeeping Genen GAPDH, HPRT und
SDHA ein spezifischer Normalisierungsfaktor berechnet. Dies erfolgte mit der von VANDESOMPELE et al. (2002) beschriebenen geNorm-Methode und der online erhältlichen
Software geNorme VBA applet for Microsoft Excel
(hppt://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/), wie bei GERHAUSER et al. (2005) erläutert.
Aufgrund der geringen RNA-Ausbeute bei der Isolierung von Einzelzellen wurde zur Normalisierung der Quotient der BDV-Kopienzahlen mit dem housekeeping Gen GAPDH ermittelt. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass die Relation BDV-spezifischer Gene zu GAPDH unbeeinflusst von verschiedenen histologischen und immunhistologischen Färbungen blieb, was nicht für SDHA und HPRT gilt.
Die so normalisierten BDV-spezifischen Kopienzahlen gingen dann in die statistische Datenanalyse ein.
3.9.4 Statistische Datenanalyse der real-time RT-PCR
Die Auswertung der Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Zur Aufarbeitung und graphischen Darstellung der erhobenen Messwerte (Gehirnschnitt, Gehirnareale und Einzelzellen) wurde das Computerprogramm Microsoft Excel 2003 für Windows (Microsoft®) sowie das Statistikprogramm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., USA) verwendet. Nach einem Kolmogorov-Smirnov-Test zur Prüfung der Daten auf Normalverteilung wurde der Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Gehirnschnitt, Gehirnareale und Einzelzellen) bzw. der Effekt der jeweiligen Gehirnregion/ Zellpopulation (Gehirnareale und Einzelzellen) auf das quantitative Vorkommen BDV-spezifischer +ssRNAs getestet.
Der Einfluss des Zeitpunkts p.i. auf die Menge der im Gehirnschnitt nachgewiesenen BDV-spezifischen +ssRNAs wurde mittels einfaktorieller (einfakt.) Varianzanalyse mit Ryan-Einot-Gabriel-Welsch-Multiple-Range (REGWQ)-Test für unabhängige Werte bestimmt. Um den Einfluss des Zeitpunkts p.i. und der jeweiligen Gehirnregion bzw. des Zelltyps auf die Menge BDV-spezifischer Transkripte zu bestimmen, wurde eine zweifaktorielle (zweifakt.) Varianzanalyse für gemischte Modelle mit REGWQ-Test verwendet. Prinzipielle quantitative Unterschiede der einzelnen +ssRNAs zwischen beiden Gehirnregionen wurden mit einem t-Test für abhängige Werte überprüft.
Der Tukey’s post-hoc Test für multiple paarweise Vergleiche wurde für alle Daten verwendet, um die Kopienzahlen
a) aller +ssRNAs innerhalb eines Zeitpunkts,
b) der gleichen +ssRNAs zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. und
c) der gleichen +ssRNA eines Zeitpunkts p.i. in verschiedenen Regionen/ Zellpopulationen auf signifikante Unterschiede zu untersuchen.
Der Bewertung wurde ein Signifikanzniveau von α=0,05 mit vergleichsbezogener Irrtumswahrscheinlichkeit zugrunde gelegt und Ergebnisse mit einem Wert von p<0,05 als statistisch signifikant gewertet. Ergebnisse mit einem Wert von p<0,10 wurden als statistisch auffällig bewertet.