NACHWEIS INTRON I-SPEZIFISCHER RNA MITTELS ISH

Als Ergänzung zur Quantifizierung BDV-spezifischer Transkripte in den Gehirnarealen und Zelltypen wurde eine morphologische Darstellung der viralen RNA mittels in situ-Hybridisierung (ISH) durchgeführt. Die Untersuchung beschränkte sich dabei auf den detaillierten Nachweis der BDV-Intron I +ssRNA und der genomischen Virus-RNA. Eine Beschränkung der topographisch-morphologischen Darstellung auf BDV-Intron I +ssRNA in dieser Studie erfolgte, da die Reaktionsmuster von BDV-N und BDV-GP +ssRNA bereits in einer vorangegangenen Arbeit untersucht wurden (WERNER-KEIŠS et al., 2002, 2003).

Ergänzend wurde die intrazelluläre Lokalisation von BDV-N +ssRNA und BDV-GP-C +ssRNA und deren Vorkommen in definierten Zelltypen (Astrozyten und Oligodendrozyten) exemplarisch mittels Doppelmarkierung untersucht.

Der Nachweis von BDV-Intron I +ssRNA und der genomischen RNA wurde an Gehirnschnitten BDV-infizierter Lewis Ratten durchgeführt. Die morphologisch-topographische Untersuchung der BDV-Intron I +ssRNA und deren korrespondierenden genomischen RNA erfolgten zur Charakterisierung der Virusausbreitung, des zellspezifischen Vorkommens und der subzellulären Verteilung viraler Nukleinsäuren. Die für diesen Zweck ausgewählten Zeitpunkte (14., 24., 42. und 90. Tag p.i.) entsprachen denen zur Quantifizierung BDV-spezifischer Transkripte mittels real-time RT-PCR. Mittels Kruskal-Wallis-Test erfolgte der Datenvergleich der vier verschiedenen Zeitpunkten p.i. (3.10.5).

4.6.1 Nachweis von Intron I-spezifischer +ssRNA 4.6.1.1 Generelles Reaktionsschema

BDV-Intron I +ssRNA ließ sich in den Gehirnarealen der untersuchten BDV-infizierten Tiere zu allen Zeitpunkten p.i. als blauschwarzer Farbniederschlag nachweisen. Vorrangig war diese +ssRNA in Neuronen und ab dem 24. Tag p.i. regelmäßig auch in runden Zellen im Corpus callosum zu finden.

In Neuronen traten feingranuläre bis diffuse Reaktionsprodukte vorwiegend im Zytoplasma und/ oder im Karyoplasma auf (Abb. 32), wobei die intrazelluläre Verteilung abhängig von der jeweiligen Gehirnlokalisation und des Zeitpunkts p.i. war. Zu Beginn der Untersuchung wurden größtenteils zytoplasmatische (bis 24. Tag p.i.; Abb. 33 und Abb. 34) Reaktionsprodukte detektiert, während zu späteren Zeitpunkten p.i. (ab dem 42. Tag p.i.;

Abb. 33 und Abb. 34) vermehrt intranukleäre Aggregate vorlagen. Die zytoplasmatischen Reaktionsprodukte stellten sich als feingranuläre bis diffuse Signale dar, die das Zytoplasma ausfüllten und/ oder perinukleär auftraten. Dagegen waren intranukleäre Reaktionsprodukte in Form einzelner oder mehrerer umschriebener Aggregate im Zellkern vorhanden. Ob diese

Aggregate im Nukleolus der Zelle gelegen waren, konnte lichtmikroskopisch nicht mit Sicherheit bestimmt werden, zumal in einigen Zellen der Nukleolus deutlich von den Farbniederschlägen zu differenzieren war.

Eindeutig positive Zellen konnten auch im Corpus callosum nachgewiesen werden. Hier fanden sich ab dem 24. Tag p.i. vereinzelt bis herdförmig positive Reaktionen als kleine bis prominente Granula ausschließlich im Karyoplasma.

In Ependymzellen und in der Leptomeninx waren vereinzelt oder herdförmig punktähnliche Granula exklusiv im Zellkern lokalisierbar, wobei die betroffenen Zellen in der Leptomeninx eine runde Morphologie aufwiesen. Die Größe dieser Aggregate variierte je nach Untersuchungszeitpunkt p.i. Zu Beginn der Untersuchung waren sie klein, stellten sich aber im weiteren Verlauf (ab dem 42. Tag p.i.) groß und prominent dar, ohne dabei den Kern zu füllen.

Aufgrund der proteolytischen Vorbehandlung der Gehirngewebe für die ISH konnte keine eindeutige morphologische Zuordnung der Zellen getroffen werden. Um trotzdem eine eindeutige Aussage zum Nachweis von BDV-Intron I +ssRNA in Astrozyten bzw.

Oligodendrozyten treffen zu können, erfolgte die Zelltypisierung durch zusätzliche immunhistologische Markierung der entsprechenden Zelltypen (4.6.3).

Zu keinem Zeitpunkt der Untersuchung war BDV-Intron I +ssRNA in Entzündungszellen perivaskulärer bzw. parenchymaler Infiltrate, in neuronalen Satellitenzellen oder in weiteren Strukturelementen des Gehirns darstellbar. In den Gehirnarealen MOCK-infizierter Tiere und bei den Negativkontrollen konnte in keinem Fall BDV-Intron I +ssRNA nachgewiesen werden.

4.6.1.2 Ausbreitung und Lokalisation

Am 14. Tag p.i. konnte in den meisten untersuchten Gehirnarealen (3.2) BDV-Intron I +ssRNA nachgewiesen werden. In Neuronen des Bulbus olfactorius, Neocortex, Ammonshorn, CPu, Thalamus, Hypothalamus, Mesencephalons und in der Medulla oblongata waren positive Reaktionsprodukte detektierbar. Diese fanden sich, mit Ausnahme des Ammonshorns, in den jeweiligen Gehirnarealen herdförmig angeordnet. Im Ammonshorn konnten positive Reaktionen disseminiert vor allem in der Pyramidenzellschicht der CA3-Region lokalisiert werden und vereinzelt auch in der CA1-Region. Die Reaktionsprodukte befanden sich in den Zellen vorwiegend im Zytoplasma oder auch zusätzlich intranukleär in Form umschriebener oder feingranulärer Aggregate.

Abweichend von diesem Muster war +ssRNA in Neuronen des Stratum granulosum im Gyrus dentatus (dentate gyrus, DG) vorwiegend intranukleär vorhanden.

Bemerkenswerterweise zeigten die Neurone im DG generell eine auf den Zellkern

beschränkte, punktförmige Reaktion im gesamten Untersuchungszeitraum, mit lediglich dezenten zytoplasmatischen Aggregaten. In Bulbus olfactorius, Neocortex (Abb. 33), CPu, Thalamus und Mesencephalon waren vor allem zytoplasmatisch lokalisierte sowie feingranuläre Reaktionsprodukte zu finden. Vereinzelt konnten - zusätzlich oder ausschließlich - intranukleär lokalisierte positive Signale detektiert werden. In den Granulosazellen des Cerebellums waren nur sporadisch Reaktionsprodukte im Nukleus der Zelle nachweisbar. Die Zellen im Corpus callosum stellten sich am 14. Tag p.i. reaktionslos dar. Bei einem Tier war in den Nuklei von einzelnen Ependymzellen und Zellen der Leptomeninx +ssRNA als punktförmiges Reaktionsprodukt nachweisbar.

Am 24. Tag p.i. traten vermehrte BDV-Intron I +ssRNA-Signale bei allen untersuchten Tieren auf. Auffällig war das disseminierte Vorkommen von +ssRNA in Neuronen des Neocortex, Thalamus, CPu und weniger stark ausgeprägt in Neuronen des Mesencephalons und der Medulla oblongata. Eine Zunahme der Anzahl positiver Zellen konnte auch für das Ammonshorn festgestellt werden. Hier wurde vermehrt zytoplasmatische und/ oder intranukleär lokalisierte +ssRNA in den Pyramidenzellen der CA3- und auch in der CA1-Region beobachtet (Abb. 32). Hingegen konnten in den Zellen des Stratum granulosum des DG nur disseminiert vorkommende, intrazelluläre punktförmige Aggregate detektiert werden.

In den Neuronen des Bulbus olfactorius, Neocortex (Abb. 33), CPu, Thalamus (Abb. 34) und Mesencephalon waren vor allem zytoplasmatisch lokalisierte und feingranuläre Reaktionsprodukte zu finden. Bei allen Tieren waren sowohl intranukleäre punktförmige als auch panzelluläre Reaktionsprodukte in den Purkinjezellen und weniger in den Granulosazellen des Cerebellums zu erkennen. Erste intranukleäre Reaktionsprodukte waren in einzelnen Zellen im Corpus callosum vorhanden. In einzelnen Ependymzellen und in Zellen der Leptomeninx fanden sich intranukleäre punktförmige Aggregate.

Ab dem 42. Tag p.i. nahm generell die Anzahl positiver Zellen in einigen Gehirnarealen ab.

Diese Beobachtung galt vor allem für den Neocortex, DG, CPu und Cerebellum. Vermehrt positive Zellen fanden sich andererseits im Corpus callosum, im Bulbus olfactorius und im Mesencephalon. Deutlich positive Farbreaktionen waren nach wie vor in den Pyramidenzellen der CA3- und CA1-Region im Ammonshorn und in Zellen des Thalamus zu beobachten (Abb. 32). Das rückläufige Vorkommen von BDV-Intron I +ssRNA im Neocortex äußerte sich in einer Abnahme positiver Signale in occipitalem und parietalem Cortex und in einer Präferenz für den temporalen Cortex. Die positiven Reaktionsprodukte fanden sich dabei vorwiegend intra- und/ oder perinukleär (Abb. 33). Deutliche zytoplasmatisch und/ oder intranukleär lokalisierte Reaktionsprodukte fanden sich in den Pyramidenzellen der CA3- und etwas weniger deutlich in der CA1-Region. Das intranukleäre Reaktionsmuster für Zellen des Stratum granulosum des DG zeigte sich unverändert, wobei insgesamt aber weniger Zellen

positiv waren als am 24. Tag p.i. In den Zellen des Thalamus konnten die Reaktionsprodukte intra- und perinukleär, jedoch weniger im Zytoplasma beobachtet werden (Abb. 34). Im Corpus callosum waren multifokale runde bis längsovale Zellen mit intranukleären Reaktionsprodukten detektierbar. Diese stellten sich als kleine bis prominente Aggregate oder sogar diffus-feingranuläre Signale dar (Abb. 35). Das Reaktionsmuster in den Ependymzellen und in Zellen der Leptomeninx zeigte sich unverändert wie am 24. Tag p.i.

(Abb. 35).

Am 90. Tag p.i. war ein weiterer Rückgang BDV-Intron I +ssRNA zu beobachten, der diesmal neben dem Neocortex und Cerebellum auch den Thalamus betraf. Nahezu unverändert blieb der Nachweis im Ammonshorn. Abweichend von der generellen rückläufigen Tendenz wurde ein vermehrtes Vorkommen positiver Signale in den Neuronen der CA1-Region zu diesem Zeitpunkt beobachtet. Die subzelluläre Verteilung in den Neuronen des Ammonshorns entsprach dem bisher Beschriebenem, eine starke zytoplasmatische und intranukleäre Reaktion war sowohl für Pyramidenzellen der CA3- als auch der CA1-Region ersichtlich. Lediglich bei einem Versuchstier lag der DG zur morphologischen Begutachtung vor. Bei diesem Tier konnten, wie bereits beschrieben, in einzelnen Neuronen des Stratum granulosum umschriebene intranukleäre Reaktionsprodukte beobachtet werden. Die positiven Signale in den Zellen des Neocortex lagen wie am 42. Tag p.i. in Form von intranukleären, umschriebenen Aggregaten ohne deutlichen zytoplasmatischen Anteil vor. Bei einigen Neuronen fanden sich positive Signale in Form eines feingranulären perinukleären Saums. In Zellen des Thalamus wurde eine vorwiegend intra- und perinukleäre Verteilung der Reaktionsprodukte beobachtet, die der subzellulären Verteilung im Neocortex zu diesem Zeitpunkt annähernd entsprach. Im Corpus callosum fanden sich multifokal lokalisierte runde bis längsovalen Zellen, die über kleine bis prominente punktförmige und streng intranukleäre Aggregate verfügten. Diese intranukleären Reaktionsprodukte konnten vereinzelt auch als feingranuläre Signale vorkommen. Das Reaktionsmuster in den Ependymzellen und in Zellen der Leptomeninx zeigte sich unverändert.

Zwischen den einzelnen Zeitpunkten p.i. konnten eine statistisch auffällige Variationen der BDV-Intron I +ssRNA ermittelt werden (Abb. 37; p=0,0788).

4.6.2 Nachweis von genomischer RNA 4.6.2.1 Generelles Reaktionsschema

In allen untersuchten BDV-infizierten Tieren ließ sich genomische Virus-RNA (-ssRNA) zu allen untersuchten Zeitpunkten p.i. nachweisen. Positive Reaktionsprodukte in Form von blauschwarzen Farbniederschlägen faden sich ausschließlich in den Zellkernen von Neuronen (Abb. 32 bis Abb. 34), Zellen im Corpus callosum (Abb. 35), sowie in ependymalen und leptomeningealen Zellen (Abb. 35). Zu Beginn der Untersuchung war das positive Signal durch einzelne umschriebene Aggregate charakterisiert, später lagen Reaktionsprodukte auch feingranulär im Karyoplasma verteilt vor.

Zu frühen Zeitpunkten p.i. konnten in den Zellkernen von Neuronen meist einzelne und punktförmige Reaktionsprodukte beobachtet werden, die - soweit lichtmikroskopisch zu beurteilen - im Nukleolus der Zelle lokalisiert waren. Im weiteren Verlauf war zunehmend eine feingranuläre bis diffuse Kernreaktion zu beobachten. Bei einzelnen Zellen konnten ab dem 24. Tag p.i. auch geringe Signale im Zytoplasma entdeckt werden, wobei dieses Reaktionsmuster die Ausnahme darstellte. Zusätzlich traten ab dem 24. Tag p.i. erste dezente, und ab dem 42. Tag p.i. deutliche diffuse Faserreaktionen im Stratum lucidum der CA3-Region im Ammonshorn auf.

Im Corpus callosum fanden sich rundovale bis längsovale Zellen mit umschriebenen oder feingranulären intranukleären Reaktionsprodukten (Abb. 35). Zur eindeutigen Charakterisierung der positiven Zellen wurde eine zusätzliche immunhistologische Zelltypisierung zum Nachweis von Astro- und Oligodendrozyten durchgeführt (4.6.3).

In einzelnen Zellen des Ependyms und in der Leptomeninx lagen positive intranukleäre Reaktionen generell nur in Form von punktförmigen Aggregaten vor.

Zu keinem Zeitpunkt der Untersuchung war BDV-Intron I +ssRNA in Entzündungszellen perivaskulärer bzw. parenchymaler Infiltrate, in neuronalen Satellitenzellen oder in weiteren Strukturelementen des Gehirns darstellbar. In den Gehirnarealen von MOCK-infizierten Tieren und bei den Negativkontrollen konnte in keinem Fall genomische BDV-RNA nachgewiesen werden.

4.6.2.2 Ausbreitung und Lokalisation

Genomische Virus-RNA konnte ab dem 14. Tag p.i. meist als schwach positives intranukleäres Reaktionsprodukt in einzelnen Gehirnarealen nachgewiesen werden.

Schwach positive Signale zeigten sich als einzelne oder selten mehrere punktförmige intranukleär lokalisierte Aggregate in den Pyramidenzellen der CA3- und zusätzlich bei

einem Tier in der CA1-Region. Im Stratum granulosum des DG waren ebenfalls kleine Aggregate in den neuronalen Nuklei lokalisiert. Vereinzelte bzw. fokale Reaktionsprodukte fanden sich in den Neuronen des Bulbus olfactorius, Neocortex (Abb. 33), CPu, Thalamus, Mesencephalon und ganz vereinzelt in Cerebellum und der Medulla oblongata. Im Corpus callosum konnten zu diesem Zeitpunkt keine Signale beobachtet werden. Während bei einem Tier in den Nuklei einzelner Zellen des Ependyms und der Leptomeninx -ssRNA nachzuweisen war, zeigte ein weiteres Tier der Untersuchungsgruppe noch keine positiven Signale in diesen Zellpopulationen.

Eine deutliche Zunahme der Reaktionsprodukte war am 24. Tag p.i. ersichtlich. Augenfällig waren dabei die disseminierten Reaktionen in Neocortex, Ammonshorn, Thalamus und in geringerer Anzahl in Mesencephalon, Medulla oblongata und im CPu. Die Signale waren in Form von umschriebenen Aggregaten bzw. als feingranulärer Niederschlag im Karyoplasma detektierbar. Die feingranulären Reaktionen fanden sich vor allem in den Pyramidenzellen der CA3-Region des Ammonshorns (Abb. 32), sowie in Neuronen des Neocortex und Thalamus (Abb. 33 und Abb. 34). Ab dem 24. Tag p.i. gelang der vermehrte Nachweis von genomischer Virus-RNA in der CA1-Region, die sich als feine intranukleäre Granula in den Pyramidenzellen darstellte. Bei einzelnen Neuronen konnte ab dem 24. Tag p.i. auch geringe Signale im Zytoplasma entdeckt werden. Neuropilreaktionen im Stratum lucidum der CA3-Region im Ammonshorn konnten, sofern im Anschnitt zu beurteilen war, ab dem 24.

Tag p.i. bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes festgestellt werden. Generell fanden sich vereinzelt bis multifokale Reaktionsprodukte in Form umschriebener Aggregate in den Nuklei von Zellen des Corpus callosum, des Ependyms und der Leptomeninx (Abb. 35). Im weiteren Verlauf zeigte sich am 42. und 90. Tag p.i. kaum eine Veränderung des Reaktionsmusters in Neocortex, Ammonshorn, Thalamus, Corpus callosum und in den Zellen des Ependyms und der Leptomeninx (Abb. 32 bis Abb. 35). Ein deutlicher Rückgang der Anzahl positiver Zellen war im DG, Bulbus olfactorius und Cerebellum zu erkennen, wo sich am 90. Tag p.i. nur noch vereinzelt oder fokal punktförmige Aggregate in den Nuklei fanden.

Zwischen den einzelnen Zeitpunkten p.i. konnte keine statistisch signifikante Zunahme genomischer BDV-RNA ermittelt werden (Abb. 37).

4.6.3 Doppelmarkierungen

Zur Beurteilung der subzellulären Lokalisation verschiedener BDV-RNAs und zum Nachweis dieser in Astrozyten und Oligodendrozyten wurde eine gleichzeitige Darstellung dieser Zelltypen und der viralen RNA (BDV-N +ssRNA, BDV-GP-C +ssRNA, BDV-Intron I +ssRNA und genomische RNA) durchgeführt.

Diese Untersuchung erfolgte exemplarisch anhand ausgewählter BDV-infizierter Lewis Ratten am 24. und 42. Tag p.i. (n=2 pro Zeitpunkt). Die Darstellung der genomischen RNA in Astrozyten und Oligodendrozyten erfolgte beispielhaft bei einem Tier (42. Tag p.i.).

4.6.3.1 Nachweis von BDV-RNA in Astrozyten Nachweis von Astrozyten mittels GFAP

GFAP-positive Zellen fanden sich in allen untersuchten Gehirnarealen der BDV-infizierten Lewis Ratten und waren durch einen zytoplasmatisch lokalisierten dunkelbraunen Niederschlag und eine sternförmige Morphologie der Zelle charakterisiert (Abb. 36). Am 42.

Tag p.i. fanden sich vermehrt große GFAP-positive Zellen vor allem im Cortex, Ammonshorn und Thalamus mit einem prominenten Zytoplasmaanteil im Vergleich zum 24. Tag p.i.

Nachweis von BDV-N +ssRNA in Astrozyten

BDV-N +ssRNA konnte disseminiert im Gehirn nachgewiesen werden, wobei die +ssRNA vorwiegend im Zytoplasma und in den Fortsätzen von Neuronen entdeckt werden konnte.

Zudem war BDV-N +ssRNA im Nukleus einzelner Ependymzellen vorhanden.

Während BDV-N +ssRNA in Neuronen vorwiegend im Zytoplasma zu beobachten war, war BDV-N +ssRNA am 24. Tag p.i. in Astrozyten vor allem in den Zellkernen und nur ganz vereinzelt im Zytoplasma zu finden. Einzelne GFAP-positive Zellen mit BDV-N +ssRNA waren am 24. Tag p.i. in Corpus callosum, Cortex cerebri, Ammonhorn, Thalamus und selten in Mesencephalon, Medulla oblongata und Cerebellum zu erkennen. Am 42. Tag p.i. nahm die Anzahl doppelt markierter Astrozyten zu (Abb. 36). BDV-N +ssRNA war nun etwas häufiger im Zytoplasma lokalisiert.

Nachweis von BDV-GP-C +ssRNA in Astrozyten

BDV-GP-C-spezifische +ssRNA konnte in Neuronen des Neocortex, der CA3- und CA1-Region und DG des Ammonshorns, sowie im Thalamus nachgewiesen werden. Die Reaktionsprodukte waren dabei vorwiegend als feine Granula oder homogene Niederschläge im Zellkern lokalisiert. Zusätzlich konnten feine zytoplasmatische Reaktionen in Neuronen des Neocortex, Ammonshorns, Thalamus und am 24. Tag p.i. in Purkinjezellen beobachtet werden. Weiterhin fanden sich intranukleäre Akkumulationen in Zellen des

Corpus callosums, der Capsula externa, des Ependyms und der Leptomeninx zu beiden untersuchten Zeitpunkten p.i.

Eine disseminierte Kolokalisation von BDV-GP-C +ssRNA in GFAP-positiven Zellen war am 24. Tag und 42. Tag p.i. vor allem in Ammonshorn, Neocortex, Corpus callosum, Thalamus und Capsula externa zu beobachten (Abb. 36). Nur vereinzelt konnten doppelt markierte Zellen in CPu, Cerebellum und in der Medulla oblongata detektiert werden. Die BDV-GP-C +ssRNA wies vorwiegend eine intranukleäre Lokalisation auf.

Nachweis von BDV-Intron I +ssRNA in Astrozyten

Eine Kolokalisation von BDV-Intron I +ssRNA in GFAP-positiven Zellen war am 24. und 42.

Tag p.i. in Einzelzellen vor allem in Neocortex, Corpus callosum, Ammonshorn, CPu, Thalamus, Mesencephalon und bei einem Tier am Tag 24 p.i. auch im Cerebellum zu beobachten (Abb. 36). Die BDV-Intron I +ssRNA ließ sich dabei im Nukleus der Zellen nachweisen, eine eindeutige zytoplasmatische Lokalisation der +ssRNA war aufgrund des intensiv dunkelbraun gefärbten Zytoplasmas der GFAP-positiven Zellen nicht möglich.

Nachweis von genomischer BDV-RNA in Astrozyten

Genomische RNA war in zahlreichen Astrozyten des Bulbus olfactorius, Neocortex, Ammonshorns, Thalamus, Cerebellums und der Medulla oblongata nachweisbar (Abb. 36).

Die virale RNA lag in den entsprechenden Zellen als intranukleäre feine Granula vor. Eine hohe Dichte GFAP-positiver Zellen mit genomischer BDV-RNA konnte vor allem in Ammonshorn, Thalamus und Neocortex beobachtet werden, etwas weniger kamen derartig markierte Zellen in Bulbus olfactorius, Corpus callosum, und CPu und nur vereinzelt in Cerebellum und Medulla oblongata vor. Bei den -ssRNA-haltigen GFAP-positiven Zellen in Ammonshorn, Thalamus und Neocortex handelte es sich vor allem um reaktive Astrozyten mit einem ausgeprägtem Zytoplasmaanteil.

4.6.3.2 Nachweis von BDV-RNA in Oligodendrozyten Nachweis von Oligodendrozyten mittels CNPase

CNPase-positive Zellen fanden sich in allen Gehirnarealen der untersuchten BDV-infizierten Lewis Ratten, vor allem aber in Bulbus olfactorius, Neocortex (vor allem in der Lamina multiformis), Corpus callosum, CPu und Capsula externa, in den lateralen Anteilen des Thalamus, im Arbor vitae des Cerebellums und weniger ausgeprägt im Mesencephalon. Die Reaktion war durch ein homogenes, hellbraunes intrazytoplasmatisches Präzipitat gekennzeichnet, das den Zellen ein siegelringförmiges Aussehen verlieh oder sich als filamentöser feingranulärer Niederschlag darstellte, der in Form von Bündeln und Bahnen organisiert vorlag (Myelin; Abb. 36).

Nachweis von BDV-N +ssRNA in Oligodendrozyten (Zur Verteilung BDV-N +ssRNA s. 4.6.3.1)

Einzelne Oligodendrozyten mit BDV-N +ssRNA im Kern waren am 24. Tag p.i. in Gehirngebieten mit Faserzügen wie Corpus callosum, CPu, Capsula externa, Thalamus, Mesencephalon, Cerebellum, sowie ganz vereinzelt in Cortex cerebri und Ammonshorn zu finden (Abb. 36). Am 42. Tag p.i. nahm die Anzahl doppelt positiver Oligodendrozyten zu und BDV-N +ssRNA war intranukleär, aber auch teilweise im Zytoplasma lokalisiert.

Nachweis von BDV-GP-C +ssRNA in Oligodendrozyten (Zur Verteilung BDV-GP-C +ssRNA s. 4.6.3.1)

BDV-GP-C +ssRNA war multifokal in CNPase-positiven Zellen am 24. Tag und 42. Tag p.i.

vor allem in der Lamina molecularis und multiformis des Neocortex, in Ammonshorn, CPu, Thalamus und im Arbor vitae des Cerebellums zu erkennen (Abb. 36). Ein disseminiertes Vorkommen doppelt markierter Zellen wurde weiterhin in Corpus Callosum und Capsula externa beobachtet. Nur vereinzelt konnten diese Zellen in Mesencephalon und Medulla oblongata detektiert werden. Die BDV-GP-C-spezifische +ssRNA wies vorwiegend eine intranukleäre Lokalisation auf.

Nachweis von BDV-Intron I +ssRNA in Oligodendrozyten

BDV-Intron I +ssRNA war am 24. Tag p.i. in einzelnen CNPase-positiven Zellen der Lamina multiformis des Neocortex, des Corpus callosums, CPu, Capsula externa, Thalamus und des Cerebellums zu beobachten (Abb. 36). Dabei waren die Reaktionsprodukte vor allem im Nukleus der Zelle eindeutig lokalisierbar, ein zytoplasmatisches Signal konnte aufgrund der homogen braunen Immunreaktion der CNPase-positiven Zellen nicht mit Sicherheit beobachtet werden. Das Reaktionsmuster entsprach am 42. Tag p.i. weitestgehend der Verteilung und Anzahl positiver Zellen am 24. Tag p.i. Eine vermehrte Kolokalisation von BDV-Intron I +ssRNA konnte jedoch in CNPase-positiven Zellen der Lamina molecularis des Neocortex festgestellt werden. Hier fand sich zudem eine zusätzliche zytoplasmatische Lokalisation der BDV-Intron I +ssRNA in einzelnen CNPase-positiven Zellen, die durch eine braun-violette Mischfarbe gekennzeichnet war.

Nachweis von genomischer BDV-RNA in Oligodendrozyten

Der Nachweis von -ssRNA in Oligodendrozyten gelang im Bulbus olfactorius, Neocortex, Corpus callosum, Ammonshorn, CPu und der Capsula externa, Thalamus, in der weißen Substanz des Cerebellums und in der Medulla oblongata (Abb. 36). Die virale RNA war in den entsprechenden Zellen in allen Hirnarealen intranukleär in Form feiner Granula oder Aggregate lokalisiert. Eine Häufung CNPase-positiver Zellen mit intranukleärer genomischer

Der Nachweis von -ssRNA in Oligodendrozyten gelang im Bulbus olfactorius, Neocortex, Corpus callosum, Ammonshorn, CPu und der Capsula externa, Thalamus, in der weißen Substanz des Cerebellums und in der Medulla oblongata (Abb. 36). Die virale RNA war in den entsprechenden Zellen in allen Hirnarealen intranukleär in Form feiner Granula oder Aggregate lokalisiert. Eine Häufung CNPase-positiver Zellen mit intranukleärer genomischer

Im Dokument Untersuchungen zur Transkription, Replikation und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit im Gehirn von experimentell infizierten Lewis Ratten mittels real-time RT-PCR (Seite 122-140)