SPEZIFITÄT UND SENSITIVITÄT DER REAL-TIME RT-PCR

Die erfolgreiche Detektion BDV-spezifischer RNA intra vitam und post mortem mittels nested RT-PCR ist bereits in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben worden (MIZUTANI et al., 1998; SAUDER et al., 1996; VAHLENKAMP et al., 2002; GRABNER et al., 2002; HOFER et al., 2006; MIRANDA et al., 2006). In den vergangenen Jahren hat die real-time RT-PCR als sensitive und spezifische Nachweismethode definierter Nukleinsäuren ihren festen Platz in der virologischen Diagnostik gefunden (Übersicht bei MAKAY et al., 2002). Während herkömmliche enzymatische in vitro-Replikationen eine rein qualitative Aussage über das Vorkommen der gesuchten Zielsequenz geben, ermöglicht die Anwendung der real-time RT-PCR eine zusätzliche quantitative Bestimmung. Ein weiterer Vorteil ist die schnelle Verfügbarkeit von Versuchsergebnissen und die minimale Kontaminationsgefahr, da postamplifikatorische Aufarbeitungen des Reaktionsansatzes nicht mehr nötig sind. Die Etablierung und Verwendung der real-time RT-PCR zum Nachweis von BDV-RNA wurde bereits beschrieben (WATANABE et al., 2001; SCHINDLER, 2004; HILBE et al., 2006;

POROMBKA et al., 2006; WOLFF et al., 2006). Die real-time RT-PCR wurde bisher zur Bestimmung der Viruslast in natürlich infizierten Pferden und Schafen eingesetzt (SCHINDLER, 2004), wobei die so gewonnenen Daten mit bereits vorliegenden

immunhistologischen Ergebnissen dieser Tiere korrelierten. Bislang dienten vor allem entsprechende Nukleinsäurabschnitte der hochexprimierten viralen Proteine BDV-N und BDV-P dem qualitativen und quantitativen BDV-RNA-Nachweis. Die Detektion von BDV-GP-, BDV-Intron I- und BDV-AG-spezifischer RNA mittels PCR ist bislang nicht beschrieben. Die Etablierung eines real-time RT-PCR-Assays für die gezielte Quantifizierung der spezifischen BDV +ssRNAs stellt eine innovative und sensitive Methode dar, die eine Charakterisierung der viralen Transkriptions- und Replikationsleistung im Verlauf der experimentellen BDV-Infektion erlaubt. Die strangspezifische Bestimmung von ausschließlich positiv- oder negativorientierter viraler RNA ist bisher für das Hepatitis C (CRAGGS et al., 2001; LIN et al., 2002; PRADEL et al., 2004), Dengue Virus (PEYREFITTE et al., 2003) und infectious hematopoietic necrosis virus (PURCELL et al., 2006) beschrieben. In der vorliegenden Arbeit konnte durch die Verwendung der spezifischen antisense-Primer für die reverse Transkription sichergestellt werden, dass ausschließlich positivorientierte RNA (subgenomische RNA, antigenomische RNA) in cDNA umgeschrieben wurde und die quantifizierten Mengen nicht durch koexistente genomische RNA verfälscht wurden.

Des Weiteren wurden in der vorliegenden Arbeit entsprechende TaqMan^®-Sonden als Fluorophor verwendet, die eine spezifische Detektion der gesuchten Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Das TaqMan^®-Assay zur Quantifizierung spezifischer DNA-Sequenzen nutzt die 5’-3’-Exonukleaseaktivität einer DNA-abhängigen DNA Polymerase (HOLLAND et al., 1991), die eine korrekt hybridisierte Sonde während der Elongationsphase der PCR exonukleolytisch spaltet. Dabei wird ein am 5’-Ende markiertes Fluorophor freigesetzt und das spezifische Signal emittiert. Die Abhängigkeit der Signalemission erfolgt streng sequenzspezifisch, da nicht 100% bindende Oligonukleotid-Sonden durch die Taq Polymerase von dem Matrizen-Strang verdrängt werden, ohne dass eine Sondenhydrolyse erfolgt. Als Vorlage für die Suche von Primer- und TaqMan^®-Sondenkombinationen dienten die klonierten und sequenzierten Abschnitte der rattenadaptierten BDV-Präparation (HERDEN et al., 2000), die für die experimentelle Infektion der Lewis Ratten verwendet wurde. Dies war insofern wichtig, da im Vergleich zu anderen rattenadaptierten Viruspräparationen Sequenzunterschiede gefunden wurden. Durch diese Vorgehensweise konnten spezifische TaqMan^®-Sonden konstruiert werden, die die spezifische Signalemission während der Amplifikation garantierten.

Die in dieser Arbeit verwendete Methode ermöglichte erstmals die exakte Messung kurzer BDV-Sequenzen, die nur in der antigenomischen RNA vorkommen. Auf diese Weise konnten die kompletten +ssRNA-Stränge von subgenomischen RNAs differenziert werden, was genaue Aussagen zur Replikationsleistung des BDV ermöglichte.

Im idealen Fall verdoppeln sich in jedem PCR-Zyklus die eingesetzten DNA-Moleküle (WIESNER, 1992; HIGUCHI et al., 1993; CHA und THILLY, 1995). Die im Experiment tatsächlich erzielte Effizienz unterliegt jedoch zahlreichen biologischen Varianzen die zu Abweichungen der theoretisch möglichen führen können. Verschiedene Möglichkeiten können zur Bestimmung der PCR-Effizienz herangezogen werden. Eine häufig gebrauchte Methode ist die Herstellung einer Standardverdünnungsreihe, aus deren Steigung die Effizienz der real-time PCR bestimmt wird (PFAFFL und HAGELEIT, 2001). Bei Verwendung von Standardkurven (BUSTIN, 2000; RUTLEDGE und CÔTÉ, 2003) berechnet sich die Effizienz aus deren Steigung nach der Formel „Effizienz=10[-1/Steigung]

-1“ und würde im Fall einer Verdopplung der DNA-Matrize pro PCR Zyklus 100% betragen (HIGUCHI et al., 1993;

AREZI et al., 2003). Die mittlere Effizienz der qPCR lag für alle BDV- und zellspezifischen Transkripte immer über 90% und meist nahe 100%. Der Korrelationskoeffizient der Standardreihe zu den Standardpunkten (R squared, Rsq) war immer Rsq≥0,996 und somit lagen die Standardpunkte nahe oder auf der von der Software erstellten Standardkurve und war gleichermaßen auch in Doppelversuchsansätzen reproduzierbar. Dies bewies eine stabile und hohe Effizienz des Assays, die zusammen mit dem hohen Korrelationskoeffizienten eine zuverlässige Bestimmung der Ausgangskopienzahlen der einzelnen BDV-spezifischen Transkripte ermöglichte.

SCHINDLER (2004) beschrieb die Etablierung der real-time RT-PCR für die Quantifizierung von N- und P-spezifischer RNA auf der Basis von Konsensussequenzen der BDV-Stämme Borna V, He/80, H1766 und No/98. Zur Überprüfung der Sensitivität der real-time RT-PCR wurde die molekulare Sensitivität durch Zugabe von verschiedenen Plasmidverdünnungen getestet. Dabei konnten ein bis zehn Plasmidmoleküle zuverlässig detektiert werden. Die verwendeten Standardverdünnungsreihen, die in der vorliegenden Studie erstellt wurden, konnten in einer Verdünnung bis zu 10 Kopien/µl zuverlässig und reproduzierbar nachgewiesen werden. Dies weist auf eine vergleichbar hohe Sensitivität des Assays wie bei SCHINDLER (2004) beschrieben hin. Der Nachweis von zellulärer und viraler RNA gelang aus verschiedenen Gewebemengen, wie z.B. dem gesamten Gehirnschnitt, Gewebearealen oder einzeln isolierten Zellen. Dies unterstreicht die Anwendbarkeit dieser Methode auch für verschiedene und sehr geringe Ausgangsmengen. Zudem konnten Ergebnisse mit geringen Kopienzahlen der Proben reproduziert werden. Die hohe Sensitivität der verwendeten real-time RT-PCR erlaubte den zuverlässigen Nachweis selbst geringer Ausgangskopienzahlen, wie sie bei der Gewebeisolation mittels Laser-basierter Mikrodissektion per se erzielt werden. Insgesamt stellen die in dieser Studie etablierten Taqman^®-Assays durch die hohe Sensitivität eine zuverlässige Methode dar, die für die exakte Quantifizierung spezifischer BDV-RNAs aus unterschiedlichen Gewebemengen geeignet ist.