Nachweis von Borna Disease Virus-spezifischen Proteinen und deren subgenomischer RNA bei natürlich infizierten
Pferden
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Dorothee Anne Algermissen Hildesheim
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D., Institut für Pathologie
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Volker Moennig
Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2010
Meiner Familie
Teilergebnisse der vorliegenden Studie wurden bereits auf Kongressen vorgestellt:
Algermissen, D., Porombka, D., Schaudien, D., Kramer, K., Baumgärtner, W., Herden, C. (2007):
Expression profile of Borna disease virus specific proteins and RNAs in naturally infected horses.
25th Meeting of the European Society of Veterinary Pathologists, 29.08. - 01.09.2007 in München
Algermissen, D., Porombka, D., Schaudien, D., Kramer, K., Baumgärtner, W., Herden, C. (2007):
Nachweis von Borna Disease Virus-spezifischen Proteinen und deren RNAs in natürlich infizierten Pferden.
50. Tagung der DVG Fachgruppe „Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie“, 09. - 11.03. 2007 in Fulda
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Die Bornasche Krankheit... 3
2.1.1 Geschichte ... 3
2.1.2 Klinik und Histopathologie ... 6
2.1.3 Pathogenese ... 9
2.1.4 Epidemiologie... 12
2.2 Ätiologie ... 13
2.2.1 Taxonomie und Morphologie... 13
2.2.2 Genomorganisation ... 14
2.2.3 Transkription und Replikation... 16
2.2.4 Regulation der Genexpression... 17
2.2.5 Proteine des Borna Disease Virus (BDV)... 23
2.2.6 Der virale Polymerase-Komplex... 30
2.3 Persistenz ... 31
3 Material und Methoden ... 34
3.1 Untersuchungsmaterial ... 34
3.1.1 BDV-infizierte Tiere ... 34
3.1.2 Kontrolltiere ... 35
3.1.3 Gewebeproben... 39
3.2 Histologie ... 40
3.2.1 Auswertung der Histologie ... 40
3.2.2 Statistische Datenanalyse der Histologie ... 43
3.3 Immunhistologie ... 44
3.3.1 Antikörper und Seren ... 44
3.3.2 Durchführung der Immunhistologie (ABC-Methode) ... 46
3.3.3 Kontrollen der Immunhistologie... 48
3.3.4 Auswertung der Immunhistologie ... 48
3.3.5 Statistische Datenanalyse der Immunhistologie... 50
3.4 In-situ-Hybridisierung (ISH) ... 50
3.4.1 Sonden und die entsprechenden cDNA-Klone... 53
3.4.2 Durchführung der In-situ-Hybridisierung... 57
3.4.3 Kontrollen der ISH... 60
3.4.4 Auswertung der ISH ... 60
3.4.5 Statistische Datenanalyse der ISH... 62
4 Ergebnisse... 63
4.1 Histopathologische Befunde... 63
4.1.1 Enzephalitis und Nachweis aktivierter Astrozyten ... 63
4.1.2 Joest-Degensche Einschlusskörperchen ... 69
4.1.3 Degenerative Veränderungen ... 70
4.2 Klinische Daten ... 70
4.3 Immunhistologische Befunde ... 73
4.3.1 Nachweis BDV-spezifischer Proteine ... 73
4.4 Nachweis BDV-spezifischer RNAs mittels In-situ-Hybridisierung ... 92
4.4.1 Genomische RNA (-ssRNA)... 93
4.4.2 Nukleoprotein-spezifische +ssRNA ... 96
4.4.3 Phosphoprotein-spezifische +ssRNA ... 99
4.4.4 Matrixprotein-spezifische +ssRNA ... 103
4.4.5 Glykoprotein-spezifische +ssRNA ... 106
4.4.6 L-Protein-spezifische +ssRNA... 109
4.4.7 Vergleichende Betrachtung der RNAs ... 114
4.5 Allgemeine Betrachtung der BDV-Proteinexpression und des Nachweises BDV-spezifischer RNAs ... 115
4.5.1 Nukleoprotein und +ssBDV-N ... 115
4.5.2 Phosphoprotein und +ssBDV-P... 116
4.5.3 Matrixprotein und +ssBDV-M ... 116
4.5.4 Glykoprotein und +ssBDV-GP... 117
4.6 Fotografische Dokumentation der Ergebnisse ... 118
5 Diskussion... 124
5.1 Klinik und histopathologische Befunde... 124
5.2 Immunhistologische Befunde und Befunde der In-situ-Hybridisierung ... 130
5.2.1 Nukleoprotein, Phosphoprotein und korrespondierende RNAs ... 131
5.2.2 Genomische RNA ... 135
5.2.3 X-Protein ... 136
5.2.4 L-Protein-spezifische RNAs ... 136
5.2.5 Matrixprotein, Glykoprotein und korrespondierende RNAs ... 138
5.3 Persistenz ... 143
5.4 Schlussbetrachtung... 146
6 Zusammenfassung ... 147
7 Summary... 150
8 Literaturverzeichnis ... 153
9 Anhang... 181
9.1 Tabellen ... 181
9.1.1 Histopathologische Befunde... 181
9.1.2 Immunhistologische Befunde ... 184
9.1.3 Befunde der In-situ-Hybridisierung... 187
9.2 Bezugsquellen für Reagenzien und Einmalware ... 191
9.3 Bezugsquellen für Geräte... 196
9.4 Lösungen und Puffer ... 198
9.4.1 Immunhistologie ... 198
9.4.2 Sondenherstellung und Gelelektrophorese ... 198
9.4.3 In-situ-Hybridisierung ... 199
9.5 Abkürzungen ... 207
10 Danksagung ... 209
1 Einleitung
Experimentelle Infektionen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV) führen zu einer persistierenden Virusinfektion des zentralen Nervensystems (ZNS), die histologisch durch eine nicht-eitrige Meningoenzephalitis gekennzeichnet ist. Der klinischen Erkrankung liegen hierbei virusinduzierte, immunpathologische Mechanismen zugrunde (NARAYAN et al., 1983a; RICHT et al., 1989; HALLENSLEBEN et al., 1998; STITZ et al., 2002; HAUSMANN et al., 2005).
Pferde, die an der Bornaschen Krankheit erkranken, zeigen typischerweise einen akuten Verlauf mit zunehmenden neurologischen Symptomen, die sich anfangs als Verhaltensänderungen wie Stupor, Somnolenz und Wickelkauen äußern. In späteren Stadien werden zunehmend Ataxien, Tremor und Drangwandern beobachtet (GRABNER u. FISCHER, 1991; UHLIG u. KINNE, 1998; RICHT u. ROTT, 2001;
RICHT et al., 2007). Neben diesem akuten klinischen Verlauf werden auch klinisch inapparente Infektionen und seltener auch chronische, zum Teil rezidivierende Krankheitsformen beschrieben (GRABNER et al., 2002; RICHT et al., 2007).
Die Expression der viralen Proteine und deren subgenomischen Ribonukleinsäuren (RNA) im Gehirn in der akuten und chronisch persistierenden Phase der Infektion wurde bereits bei experimentell infizierten Ratten und Mäusen detailliert untersucht.
Dabei wurde besonderer Wert auf die Expression des viralen Glykoproteins (BDV- GP) gelegt, da virale Glykoproteine häufig als Determinanten für den Zell- und Wirtstropismus sowie als Ziel für die antivirale Immunantwort angesehen werden. In experimentell infizierten Rattengehirnen konnte gezeigt werden, dass sich das BDV- GP in Bezug auf Expressionsmuster, Zeitpunkt der maximalen Expression post infectionem (p.i.) und Zelltropismus von der Expression des viralen Nukleo- und Matrixprotein (BDV-N und BDV-M) und deren kodierenden RNAs signifikant unterscheidet (WERNER-KEIŠS, 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008).
Auf Ebene der messenger RNA (mRNA) finden sich bei experimentell infizierten Ratten ebenfalls Unterschiede in Bezug auf die exprimierenden Zelltypen und die intrazelluläre Verteilung spezifischer viraler mRNAs. Des Weiteren weisen die viralen
mRNA-Spezies im Verlauf der Infektion quantitative und regionenspezifische Unterschiede auf (POROMBKA, 2006).
Diese bei experimentell infizierten Tieren erhobenen Daten deuten auf eine regulierte Expression viraler Transkripte und Protein hin. Insbesondere eine regulierte Expression der viralen Hüllproteine (BDV-GP und BDV-M) kann wesentlich zur Vermeidung einer Erkennung und Elimination durch das wirtsspezifische Immunsystem beitragen.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die bereits an experimentell infizierten Nagern gewonnenen Erkenntnisse mit der Expression der viralen Proteine und RNA-Spezies im natürlichen Wirt, dem Pferd, zu korrelieren. Des Weiteren wurde eine Korrelation der Lokalisation viraler Proteine und korrespondierender viraler RNAs mit den entzündlichen Veränderungen im Gehirn und den beteiligten Immunzellen sowie den residenten Zellen durchgeführt, um aufgrund der Ergebnisse eine Zuordnung zum Verlauf und Stadium bzw. Rückschlüsse zur Dauer der BDV-Infektion herzustellen.
Die vorliegende Studie stellt eine Verbindung zwischen experimentellen und natürlichen BDV-Infektionen dar, die durch Einbeziehung von Pferden mit verschiedenen Verlaufsformen der Krankheit wichtige Aussagen zur Regulation der BDV-Replikation und den viralen Persistenzmechanismen unter natürlichen Infektionsbedingungen erbringen sollte.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Bornasche Krankheit
2.1.1 Geschichte
Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) ist eine seit über 200 Jahren bei Pferd und Schaf bekannte Virusinfektion des ZNS, die histologisch durch eine nicht-eitrige Polioenzephalomyelitis gekennzeichnet ist. Einige der ersten Erwähnungen dieser Krankheit stammen aus Regionen Bayerns und Baden-Württemberg und reichen bis in das Jahr 1660 zurück. „Hitzige Kopfkrankheit der Pferde“, „Nervenfieber“ oder
„subakute Meningoenzephalitis“ sind nur einige der zahlreichen Synonyme unter der die BD in der Vergangenheit bekannt war. Ihr jetziger Name geht auf eine Epidemie unter Pferden in den Jahren 1894 bis 1896 in der Nähe der Stadt Borna in Sachsen zurück. Zwischen 1896 und 1940 fielen in Sachsen über 16000 Pferde periodisch wiederkehrenden Epidemien der BD zum Opfer (DÜRRWALD u. LUDWIG, 1997;
Übersicht bei LUDWIG u. BODE, 2000; DÜRRWALD et al., 2006). In den letzten 40 Jahren hat sich jedoch das epidemiologische Erscheinungsbild der BD von periodisch stattfindenden Epidemien hin zu einem endemischen Auftreten gewandelt.
Als mögliche Gründe dieser Wandlung werden eine deutliche Abnahme der Tierzahl aufgrund geringer werdender Bedeutung der Pferdehaltung und bessere Hygienebedingung diskutiert (DÜRRWALD et al., 2006). In Verbindung mit den histologischen Befunden im Gehirn beschrieben Joest und Degen im Jahr 1909 die nach ihnen benannten, als pathognomonisch für die BD geltenden, eosinophilen, intranukleären Einschlusskörperchen (Joest-Degensche Einschlusskörperchen) in den Neuronen des Hippocampus (Übersicht bei DÜRRWALD u. LUDWIG, 1997).
Ein eindeutiger Beweis der Virusätiologie gelang Zwick und Seifried in den zwanziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts durch die experimentelle Übertragung von BD, indem sie bakterienfreies Gehirnhomogenat eines an BD erkrankten Pferdes einem Kaninchen applizierten und nach einigen Passagen von Kaninchen zu Kaninchen wieder zurück ins Pferd übertrugen (ZWICK u. SEIFRIED, 1925; ZWICK et al., 1927). In den nachfolgenden Jahren wurden erfolgreiche experimentelle
Übertragungen von BDV auch bei anderen Tierarten wie Ratten, Meerschweinchen, Rhesusaffen, Hühnern, Schafen und Pferden beschrieben (HEINIG, 1969; Übersicht bei DANNER, 1982; ROTT u. BECHT, 1995; RICHT et al., 1997; Übersicht bei DÜRRWALD u. LUDWIG, 1997; KATZ et al., 1998).
Nachdem seit längerem Nager als ein mögliches Reservoir des BDV diskutiert wurden (STAEHELI et al., 2000; DÜRRWALD et al., 2006), konnten HILBE et al.
(2006) bei Feldspitzmäusen (Insektivore) in einem BDV-Endemiegebiet in der Schweiz BDV-Antigen und RNA nachweisen, was die Hypothese eines natürlichen Reservoirs unterstützt (s. 2.1.4).
Pferde und Schafe gelten als natürliche Wirte des BDV. Allerdings ist ein spora- disches Auftreten der BD auch bei anderen Equiden, Rindern, Katzen, Kaninchen, Alpakas sowie zahlreichen weiteren warmblütigen Spezies beschrieben (ALTMANN et al., 1976; METZLER et al., 1978; SCHÜPPEL et al., 1994, 1995; BODE et al., 1994b; JAUNIN et al., 1998; NAKAMURA et al., 1999; Übersicht bei LUDWIG u.
BODE, 2000; DEGIORGIS et al., 2000; Übersicht bei RICHT u. ROTT, 2001).
Natürliche BDV-Infektionen mit akuter klinischer Verlaufsform wurden bisher in endemischen Gebieten in Deutschland, Liechtenstein, Österreich und der Schweiz beschrieben (SUCHY et al., 1997; WEISSENBÖCK et al., 1998; CAPLAZI et al., 1999; Übersichten bei STAEHELI et al., 2000 und RICHT u. ROTT, 2001). Das Vorkommen natürlicher BDV-Infektionen außerhalb dieser Endemiegebiete und der Nachweis von BDV-spezifischen Serumantikörpern bei Pferden in vielen europäischen und außereuropäischen Staaten wird bis zum heutigen Tag kontrovers diskutiert (DÜRRWALD et al., 2006) (s. 2.1.4).
Seit kurzem wird ein Virus mit BDV-ähnlicher Genomorganisation, das sog. avian bornavirus (ABV), als potentielles ätiologisches Agens in Zusammenhang mit der Neuropathischen Drüsenmagendilatation der Psittaziden (Psittacine proventricular dilatation syndrom, Macaw wasting disease) diskutiert (KISTLER et al., 2008;
HONKAVUORI et al., 2008; STAEHELI et al., 2010). Inwieweit Vögel infolge dessen als ein weiteres potentielles BDV-Reservoir in Betracht gezogen werden müssen, ist ohne weiterführende Studien derzeit nicht abschließend beurteilbar.
Der Nachweis, dass BDV-Infektionen bei Spitzhörnchen (Tupaia glis) Verhaltens- änderungen auslösen (SPRANKEL et al., 1978), war der Anstoß zu Untersuchungen auf das Vorhandensein BDV-spezifischer Antikörper bei Menschen, die an psychiatrischen oder neurologischen Erkrankungen leiden (AMSTERDAM et al., 1985; BECHTER et al., 1987; BODE et al., 1992, 1993; WALTRIP et al., 1995;
SAUDER et al., 1996; BILLICH et al., 2002; Übersicht bei CHALMERS et al., 2005).
In Sera von Patienten mit verschiedenen psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie und Depressionen wurden derartige Antikörper nachgewiesen. In späteren Studien zeigte sich, dass auch bei einem geringen Prozentsatz klinisch gesunder Menschen BDV-spezifische Antikörper vorkommen. Berichte über erfolgreiche BDV-Isolierungen oder den Nachweis BDV-spezifischer RNA bei Menschen aus peripheren Blutzellen und Gehirngewebe (KISHI et al., 1995; BODE et al., 1996; KISHI et al., 1996; NAKAYA et al., 1996; DE LA TORRE et al., 1996;
NOWOTNY u. KOLODZIEJEK, 2000; NAKAMURA et al., 2000; MIRANDA et al., 2006) sind jedoch aufgrund der Sequenzhomologien der humanen Sequenzen mit den entsprechenden BDV-Laborstämmen am ehesten als Kontaminationen einzustufen (SCHWEMMLE et al., 1999; RICHT u. ROTT, 2001; DÜRRWALD et al., 2007).
Ob BDV bei psychiatrischen Erkrankungen des Menschen eine Rolle spielt, bleibt daher weiterhin fraglich. Allerdings weisen die serologischen Daten darauf hin, dass Menschen sich mit BDV oder einem BDV-ähnlichen Agens infizieren können (STAEHELI, 2002; SCHWEMMLE u. BILLICH, 2004). Inwieweit die kürzlich entdeckten endogenous Borna-like N (EBLN)-Elemente in verschiedenen Säugetiergenomen, inklusive des humanen Genoms, mit der Ausbildung psychiatrischer Erkrankungen in Zusammenhang stehen ist bis dato nicht abschließend zu beurteilen (FESCHOTTE, 2010; HORIE et al., 2010).
2.1.2 Klinik und Histopathologie
2.1.2.1 Natürliche Infektion
Bei Pferden variiert die Inkubationszeit nach natürlicher Infektion mit BDV zwischen zwei Wochen und mehreren Monaten und soll im Durchschnitt zwei bis drei Monate betragen (SCHMIDT, 1952; KATZ et al., 1998).
Pferde, die an der klinischen Verlaufsform der BD erkranken, zeigen typischerweise einen akuten Krankheitsverlauf mit zunehmenden neurologischen Symptomen, der bei mehr als 80% der betroffenen Tiere innerhalb von ein bis vier Wochen zum Tod führt (GRABNER u. FISCHER, 1991; UHLIG u. KINNE, 1998; Übersicht bei RICHT et al., 2000; RICHT u. ROTT, 2001; RICHT et al., 2007). Die klinische Symptomatik variiert hierbei von Tier zu Tier, abhängig von der Virusausbreitung im Gehirn und der Lokalisation der Entzündungsreaktionen (GRABNER u. FISCHER, 1991).
Das frühe Stadium der akuten Erkrankung ist durch Verhaltensänderungen in Form von Stupor und Somnolenz gekennzeichnet. Langsame Futteraufnahme, Kau- bewegungen ohne Abschlucken des Futters (sog. „Pfeifenrauchen“) und Leer- bzw.
Wickelkauen, unterbrochen durch häufiges Gähnen und Kopfpressen, sind ebenfalls wichtige diagnostische Hinweise. Als extraneurales Symptom ist in vielen Fällen anfangs zusätzlich therapieresistentes, rekurrierendes Fieber zu beobachten (UHLIG u. KINNE, 1998). Die Störungen der Kaubewegung und des Schluckvorganges führen außerdem zu einer deutlich verminderten Futter- und Wasseraufnahme, wodurch sich häufig eine inanitionsbedingte Hyperbilirubinämie entwickelt, die sich in leicht ikterischen Schleimhäuten manifestiert (GRABNER et al., 2002).
Im fortgeschrittenen Stadium der BD stehen Störungen der Bewegungskoordination und des Gleichgewichts im Vordergrund. Neben Kopfschiefhaltung und Ataxie ist das Fehlen adäquater Reaktionen auf Schmerzstimuli und fehlende Korrektur abnormer Körperhaltung als Zeichen gestörter Propriozeption auffällig.
Das Endstadium der BD geht bei vielen Tieren mit einem neurogenen Torticollis einher, der häufig mit zwanghaften Kreisbewegungen (sog. „Manegebewegungen“)
assoziiert ist. Kopfzuckungen, Krampfanfälle und Blindheit sind in diesem Stadium ebenfalls häufig zu beobachten. Schließlich fallen die Tiere ins Koma und sterben.
Seltener werden atypische Symptome wie hochgradige Abmagerung, rekurrierende Kolik, chronische Lahmheit und Verhaltensstörungen (z. B. Kopfschütteln) beschrieben (BODE et al., 1994a; DIECKHÖFER, 2008), die jedoch in anderen Studien nicht beobachtet wurden.
Neben dieser akuten klinischen Verlaufsform wird bei ca. 10% der klinisch apparent erkrankten Pferde ein chronischer, teils rezidivierender Krankheitsverlauf beschrieben.
Histopathologisch zeigen natürlich infizierte Pferde, vorwiegend im Bulbus olfactorius, Nucleus caudatus, Hippocampus, Thalamus und in den periventrikulären Gebieten der Medulla oblongata, eine nicht-eitrige Meningoenzephalitis mit perivaskulären, parenchymatösen und leptomeningealen Infiltraten, die sich aus T- Zellen, B-Zellen, Plasmazellen und Makrophagen zusammensetzen (BILZER et al., 1995; CAPLAZI u. EHRENSPERGER, 1998; HERDEN et al., 1999). Die pathognomonischen intranukleären Joest-Degensche Einschlusskörperchen treten vor allem in größeren Neuronen des Hippocampus auf (JOEST u. DEGEN, 1909).
Sie sind jedoch nur noch inkonstant zu beobachten (HERDEN et al., 1999; RICHT et al., 2000). Neuronendegeneration und Neuronophagie sind selten nachweisbar.
Allerdings wird in einigen Fällen ein Verlust von Pyramidenzellen des Hippocampus beobachtet. In Bereichen mit entzündlichen Veränderungen ist darüber hinaus regelmäßig eine reaktive Astrozytose nachweisbar (Übersicht bei RICHT et al., 2007).
2.1.2.2 Experimentelle Infektion
Bei Lewis-Ratten variiert das Krankheitsbild nach experimenteller Infektion in Abhängigkeit vom Alter und Immunstatus der Tiere, von der Art der Virusapplikation, sowie von der verwendeten Viruspräparation.
Bei adult BDV-infizierten Lewis-Ratten entwickelt sich eine persistierende Infektion mit einer nicht-eitrigen Meningoenzephalitis und einem typischen biphasischen Verlauf der klinischen Erkrankung (NITZSCHKE, 1963; NARAYAN et al., 1983a/b;
HERDEN et al., 2000). Das akute Stadium äußert sich, zeitgleich mit dem Auftreten der Entzündungsreaktion im Gehirn, ca. 20 Tage nach intrazerebraler Inokulation durch klinische Symptome in Form von aggressivem Verhalten, Hyperaktivität, Desorientierung, Ataxie und teilweise auch Paralysen, und dauert ungefähr bis zum 40. Tag post infectionem (p.i.) an. Die zweite, chronische Phase beginnt ab dem 60.
Tag p.i. und ist durch Apathie bis hin zur Somnolenz gekennzeichnet. Bis 100 Tage p.i. wird bei einigen Ratten eine Erblindung festgestellt (NARAYAN et al., 1983a). Die Ausbildung von Paresen bzw. Paralysen der Hintergliedmaßen (BIESENBACH et al., 1990; BIESENBACH, 1994) oder einer Obesitas (NARAYAN et al., 1983b; KAO, 1985; GOSZTONYI u. LUDWIG, 1995; ROTT u. BECHT, 1995; HERDEN et al., 2000) ist ebenfalls beschreiben.
Die Enzephalitis erreicht bei adult BDV-infizierten Lewis-Ratten ihr Maximum zwischen 30 und 40 Tagen p.i. und ist durch massive perivaskuläre, parenchymatöse und meningeale Entzündungszellinfiltrationen vor allem in zerebralem Cortex, Hippocampus, Thalamus und Amygdala gekennzeichnet (vgl. 2.1.3.2; Abb. 3). Nach ca. 42 Tagen p.i. ist eine Abnahme der entzündlichen Infiltrationen zu beobachten.
Infektiöses Virus und Astrogliose sind weiterhin zu finden (HIRANO et al., 1983;
NARAYAN et al., 1983a/b; DESCHL et al., 1990; GOSZTONYI u. LUDWIG, 1995;
HERDEN et al., 2000; KOLODZIEJEK et al., 2005; WERNER-KEIŠS et al., 2008). Je nach verwendeter Viruspräparation können mit Aufregulierung der entzündlichen Infiltrate auch neuronale Nekrosen auftreten (DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000).
Im Gegensatz dazu entwickeln neonatal BDV-infizierte Lewis-Ratten BDV-spezi- fische Antikörper und eine lebenslange Viruspersistenz, die durch das Fehlen klassischer klinischer Symptome und Entzündungszellinfiltrate gekennzeichnet ist (HIRANO et al., 1983; NARAYAN et al., 1983a). Es wurden jedoch Störungen der emotionalen und kognitiven Funktion sowie der physiologischen und neurologischen Entwicklung festgestellt (MORALES et al., 1988; PLETNIKOV et al., 1999, 2001;
LANCASTER et al., 2007).
Experimentell BDV-infizierte Mäuse erkranken hingegen nur, wenn sie neonatal infiziert werden, während adult BDV-infizierte Mäuse klinisch unauffällig bleiben und nur minimale entzündliche Veränderungen im Gehirn aufweisen (KAO et al., 1984;
RUBIN et al., 1993; HALLENSLEBEN et al., 1998).
Neonatal BDV-infizierte Mäuse entwickeln nach vier bis sechs Wochen, parallel zum Auftreten einer nicht-eitrigen Meningoenzephalitis, erste neurologische Symptome (HALLENSLEBEN et al., 1998). Darüber hinaus induziert eine TNF-Überexpression bei neonatal BDV-infizierten Mäusen spontane, epileptiforme Krämpfe (KRAMER et al., 2008).
2.1.3 Pathogenese
2.1.3.1 Infektion und Virusausbreitung im ZNS
Der Infektionsweg des BDV ist noch nicht vollständig aufgeklärt (Übersicht bei RICHT u. ROTT, 2001). Untersuchungen an experimentell infizierten Ratten lassen den Schluss zu, dass die natürliche Übertragung des BDV vermutlich rhinogen, mittels intranasaler Infektion über das olfaktorische Neuroepithel erfolgt (MORALES et al., 1988; SAUDER u. STAEHELI, 2003). Eine zweite mögliche Infektionsroute stellt die orale Infektion mit nachfolgender neuronalaszendierender Verbreitung des Virus über Endigungen des Nervus trigeminus dar (BILZER et al., 1996). Nach Eintritt in das Nervensystem migriert das BDV entlang der Axone (MORALES et al., 1988; Übersicht bei GOSZTONYI u. LUDWIG, 1995) und ist im ZNS zunächst vorwiegend im limbischen System nachweisbar. Im weiteren Verlauf der Infektion ist es jedoch disseminiert im gesamten ZNS und zu einem späten Infektionszeitpunkt schließlich auch im peripheren Nervensystem und den neuronalen Zellen der Retina detektierbar (KREY et al., 1979; NARAYAN et al., 1983b).
Im Rahmen einer Untersuchung zur Verteilung des BDV in natürlich infizierten Tieren mit klinischer Erkrankung wurde BDV-spezifische RNA bei allen Pferden in Bulbus olfactorius, Cortex cerebri, Nucleus caudatus und Hippocampus nachgewiesen, während andere Gehirnareale und Rückenmark nur in einigen Fällen ein positives Ergebnis, mit abnehmbarer Nachweishäufigkeit in kaudale Richtung ergaben.
Darüber hinaus enthielt der Liquor cerebrospinalis (CSF) bei keinem der
untersuchten Tiere BDV-spezifische RNA (LEBELT u. HAGENAU, 1996). In einer anderen Studie war dagegen bei 28% der BDV-infizierten Pferde BDV-spezifische RNA im Liquor nachweisbar (GRABNER et al., 2002).
Über die Ausbreitungsmechanismen des BDV im ZNS in vivo ist bislang nur wenig bekannt. Zunächst wurde, ähnlich wie bei den Rhabdoviridae, eine Ausbreitung in Form von unbehüllten Ribonukleoproteinkomplexen (RNP) vermutet (CARBONE et al., 1993; CUBITT u. DE LA TORRE, 1994; GONZALES-DUNIA et al., 1997; KOHNO et al., 1999). Anhand von BDV-infizierten hippocampalen Neuronen konnte jedoch gezeigt werden, dass BDV-GP für die transsynaptische Virusverbreitung zwingend notwendig scheint (BAJRAMOVIC et al., 2003; WERNER-KEIŠS et al., 2008).
Andererseits ergaben neuere in vitro-Untersuchungen, dass die Virusverbreitung von Zelle zu Zelle weder von den zellulären Rezeptoren abhängig ist, mit denen das BDV beim initialen Viruseintritt in die Wirtszelle interagiert (HONDA et al., 2009), noch die Furin-abhängige, proteolytische Spaltung des BDV-GP voraussetzt (CLEMENTE u.
DE LA TORRE, 2007). Darüber hinaus scheint zumindest der initiale Viruseintritt Cholesterol-abhängig zu sein (CLEMENTE et al., 2009).
Untersuchungen an Ratten und Kaninchen legen die Vermutung nahe, dass die horizontale Transmission des BDV über Nasensekret, Konjunktivalflüssigkeit, Speichel und Urin stattfindet (ZWICK et al., 1927; GOSZTONYI u. LUDWIG, 1995;
SAUDER u. STAEHELI, 2003).
Bei natürlich infizierten und an BD erkrankten Pferden war in einigen Fällen ebenfalls infektiöses Virus aus Konjunktivalflüssigkeit und Parotis isolierbar (HERZOG, persönl. Mitteilung). Auch BDV-spezifische RNA wurde in Konjunktivalflüssigkeit, Nasensekret und Speichel solcher Tiere detektiert (LEBELT u. HAGENAU, 1996).
Darüber hinaus existieren Berichte über den Nachweis von BDV-spezifischer RNA in Konjunktivalflüssigkeit von seropositiven, inapparent infizierten Pferden (HERZOG et al., 1994). Die Isolierung von infektiösem Virus in Konjuktivalflüssigkeit und Parotis gelang bei solchen Tieren dagegen nicht (RICHT et al., 2007).
Auch bei natürlich infizierten, seropositiven Schafen ohne klinische Symptomatik wurde angeblich BDV-spezifische RNA in Nasensekret, Konjunktivalflüssigkeit und Speichel detektiert (VAHLENKAMP et al., 2002).
Eine vertikale Virustransmission wurde von HAGIWARA et al. (2000) bei einer tragenden Stute mit neurologischer Symptomatik und deren Fetus beschrieben, die beide BDV-RNA im Gehirn aufwiesen. Im Gegensatz dazu waren jedoch bei zwei, per Kaiserschnitt entwickelten Fohlen einer postmortal BDV-positiven getesteten Stute keine BDV-spezifischen Marker nachweisbar (RICHT et al., 2000).
In Lämmern, deren Muttertiere serologisch BDV-positiv waren bzw. BDV-spezifische RNA aufwiesen, wurden nur sporadisch BDV-spezifische Antikörper detektiert. Dabei muss zudem bedacht werden, dass Aufnahme von Kolostrum zu einer Übertragung BDV-spezifischer Antikörper auf die neugeborenen Lämmer führt. Daher wird der Nachweis BDV-spezifischer Antikörper bei Lämmern erst ab dem dritten Monat post natum als aussagekräftig bewertet. BDV-spezifische RNA war dagegen bei keinem der Lämmer nachweisbar. Eine vertikale Virustransmission scheint daher von untergeordneter Bedeutung (VAHLENKAMP et al., 2002).
2.1.3.2 Immunpathologie
Untersuchungen an experimentell BDV-infizierten Mäusen und Ratten haben gezeigt, dass klinische Symptome nach einer BDV-Infektion auf virusinduzierte, immun- pathologische Mechanismen zurückzuführen sind (Übersicht bei STITZ et al., 2002).
Demnach resultiert eine Infektion adulter, immunkompetenter Ratten in einer nicht- eitrigen Meningoenzephalitis mit entsprechenden neurologischen Symptomen, während eine Infektion neonataler, athymischer oder immunsupprimierter Tiere weder zu entzündlichen Veränderungen im Gehirn, noch zu neurologischen Symptomen führt, obwohl bei diesen Tieren eine disseminierte Virusausbreitung im Gehirn und in die peripheren Organe nachweisbar ist (NARAYAN et al., 1983a;
HERZOG et al., 1984, 1985; Übersicht bei RICHT et al., 2007). Eine nähere Charakterisierung der beteiligten Entzündungszellen ergab eine Beteiligung von CD4+ und CD8+ T-Zellen, Makrophagen und B-Zellen an der entzündlichen Reaktion bei adulten, immunkompetenten Ratten (NARAYAN et al., 1983b; DESCHL et al.,
1990). In weiteren Studien wurde die entscheidende Rolle von CD4+ und CD8+ T- Zellen in der Pathogenese der BD herausgestellt (RICHT et al., 1989, 1990;
Übersichten bei STITZ et al., 2002, RICHT et al., 2007). Die klinische Symptomatik der BD ist demnach Ausdruck einer virusinduzierten, immunpathologischen Reaktion des Wirtsorganismus, die einer Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV) entspricht. Bei an BD erkrankten Pferden ist ebenfalls eine Infiltration mit T-Zellen (CD4+ und CD8+), Makrophagen und Plasmazellen nachweisbar, so dass aufgrund der ähnlichen Zusammensetzung der Zellinfiltrate bei Pferden infizierten Ratten und Mäusen angenommen wird, dass der Erkrankung natürlich infizierter Pferde und experimentell infizierter Nager eine gleichartige Pathogenese zugrunde liegt (BILZER et al., 1995; CAPLAZI u. EHRENSPERGER, 1998; HERDEN et al., 1999; Übersicht bei RICHT et al., 2007).
2.1.4 Epidemiologie
Bis zum heutigen Tag wurde die akute klinische Verlaufsform der BD ausschließlich in Deutschland, Liechtenstein, der Schweiz und Österreich, vor allem bei Pferden und Schafen, aber auch sporadisch bei zahlreichen anderen warmblütigen Spezies beschrieben (Übersicht bei ROTT u. BECHT, 1995; STAEHELI et al., 2000;
STAEHELI, 2002; RICHT et al., 2007) (vgl. 2.1.1). Allerdings wird aufgrund von Berichten über den Nachweis BDV-spezifischer Serumantikörper bei klinisch gesunden Pferden aus verschiedenen Ländern Europas, aus Israel, Japan, Iran, China, Australien und den USA ein weltweites Auftreten von BDV-Infektionen diskutiert (HERZOG et al., 1994; HERDEN et al., 1999; DÜRRWALD et al., 2006;
Übersicht bei RICHT et al., 2007).
Studien zur BDV-Seroprävalenz in Deutschland zeigen, dass BD vorwiegend in endemischen Regionen in Sachsen, Hessen, Bayern und Baden-Württemberg auftritt. Die durchschnittliche BDV-Seroprävalenz bei klinisch gesunden Pferden in Deutschland liegt bei 11,5% (HERZOG et al., 1994). In den oben genannten endemischen Regionen ist ein signifikanter Anstieg der Seroprävalenz auf 22,5 % zu beobachten, und in Ställen, in denen ein Pferd an BD erkrankt ist, steigt dieser Wert bei den gesunden Pferden der selben Ställe sogar auf über 50% an. In 72% der
Pferdehaltungen, in denen BD auftritt, zeigen lediglich Einzeltiere klinische Symptome (HERZOG et al., 1994; RICHT u. ROTT, 2001). Über eine schlüssige Erklärung dieser Diskrepanz zwischen hoher BDV-Seroprävalenz und niedriger BD- Inzidenz kann weiterhin nur spekuliert werden. Als mögliche prädisponierende Faktoren für den Ausbruch von BD nach einer BDV-Infektion werden Alter, Immunstatus und genetische Eigenschaften des Pferdes sowie die genetischen Eigenschaften des Virus in Betracht gezogen (RICHT et al., 2007).
Die BD weist ein epidemiologisches Muster auf, das neben der regionalen Begrenzung auch einen saisonalen Verlauf, mit einem vermehrten Auftreten von BD im Frühling und in den frühen Sommermonaten, sowie eine jährlich unterschiedliche Inzidenz beinhaltet. Diese epidemiologischen Faktoren führen, in Zusammenhang mit der Tatsache, dass BDV-Isolate aus der gleichen geographischen Region einen hohen Homologiegrad untereinander besitzen (genetic clustering; KOLODZIEJEK et al., 2005), zu der Vermutung, dass ein bzw. mehrere bisher noch unbekannte BDV- Reservoire existieren, dessen Lebensraum auf die Regionen begrenzt ist, in denen BD als endemisch gilt (RICHT u. ROTT, 2001; DÜRRWALD et al., 2006). Die Tatsache, dass bei immuninkompetenten bzw. neonatal und persistent infizierten Ratten BDV in zahlreichen Sekreten gefunden wurde, lässt vermuten, dass derartige Tiere ein natürliches Virusreservoir darstellen könnten (SAUDER u. STAEHELI, 2003). Bei neueren Untersuchungen an Maulwürfen und Mäusen in einem Endemiegebiet in der Schweiz war lediglich bei Feldspitzmäusen (Crocidura leucodon) BDV-Antigen und RNA im Gehirn nachweisbar. Feldspitzmäuse erfüllen aufgrund ihres Lebensraumes und ihrer Lebensweise die Kriterien eines potentiellen BDV-Reservoirs (DÜRRWALD et al., 2006), so dass Feldspitzmäuse in der Schweiz ein mögliches BDV-Reservoir darstellen (HILBE et al., 2006).
2.2 Ätiologie
2.2.1 Taxonomie und Morphologie
Das BDV ist ein behülltes Virus mit einem nicht segmentierten, einzelsträngigen, linearen RNA-Genom von negativer Polarität (non-segmented, negative single-
stranded RNA [NNS-RNA]) und einer Größe von 8,9 Kilobasen (DE LA TORRE et al., 1990; BRIESE et al., 1992; RICHT et al., 1993; CUBITT u. DE LA TORRE, 1994;
PRINGLE, 1996). Innerhalb der Ordnung der Mononegavirales stellt das BDV aufgrund verschiedener genetischer und biologischer Besonderheiten wie intranukleäre Replikation und Transkription den Prototypen der neu etablierten Familie Bornaviridae dar (BRIESE et al., 1994; CUBITT u. DE LA TORRE, 1994;
PRINGLE, 1996).
In der ultrastrukturellen Analyse von zellfreien infektiösen BDV-Partikeln ließen sich sphärische Virionen (Abb. 1) von ca. 70-130 nm Durchmesser darstellen (ZIMMERMANN et al., 1994; COMPANS et al., 1994; KOHNO et al., 1999).
Innerhalb dieser Partikel ist ein ca. 50-60 nm großer, elektronendichter Kern und ein helikales Nukleokapsid mit einer Breite von ca. 4 nm nachweisbar. Die äußere Hüllmembran, die diese Partikel umgibt, weist ca. 7 nm lange, spike-ähnliche Projektionen auf (KOHNO et al., 1999).
Abb. 1: Schematische Darstellung des Borna Disease Virus
2.2.2 Genomorganisation
Das BDV-Genom stellt mit einer Größe von 8,9 kb das kleinste Virus innerhalb der NNS-RNA-Viren dar. Mit dem Gen für die RNA-Polymerase am 5´-Ende und dem Gen für das Nukleoprotein am 3´-Ende entspricht die genomische RNA (virale RNA, vRNA) des BDV in seiner Organisation den anderen Viren aus der Ordnung der Mononegavirales. Eine komplette antigenomische positiv orientierte (+ss) RNA
(complementary RNA, cRNA) dient als Matrize zur de novo-Synthese der vRNA, die jedoch nur in sehr geringen Mengen im infizierten Gehirn vorkommt (POROMBKA et al., 2008). Sowohl die cRNA als auch die vRNA besitzen keine 5´-Kappe zum Schutz vor Exonukleasen, sind nicht polyadenyliert und kommen koexistent in infizierten Zellen bzw. im viralen Ribonukleoproteinkomplex (RNP) vor. Extracistronische nicht- kodierende 3´-leader- und 5´-trailer-Sequenzen an den Enden des Genoms besitzen hochkonservierte, sog. inverted terminal repeats (ITR), die die Promotoren für die virale Replikation beinhalten. BDV soll im Vergleich zu anderen Vertretern der Mononegavirales außergewöhnliche genomische und antigenomische ITRs besitzen, die aufgrund einer Verkürzung der 3´ bzw. 5´-Genomenden nicht vollständig komplementär zueinander sind, sondern unvollständig erscheinen (Übersicht bei DE LA TORRE, 2006). Diese Kürzung des Genoms stellt einen aktiven Prozess („programmierte“ Kürzung) im Verlauf der Replikation dar und soll eine Interferon- Induktion des Wirtes verhindern (SCHNEIDER et al., 2005, 2007; HABJAN et al., 2008).
BDV verfügt über drei Transkriptionseinheiten, die mindestens sechs offene Leseraster (open reading frame, ORF) beinhalten. In 3´-5´-Orientierung kodiert die vRNA für das Nukleoprotein BDV-N (ORF I), X-Protein BDV-X (ORF x1), Phosphoprotein BDV-P (ORF II), Matrixprotein BDV-M (ORF III), Glykoprotein BDV- GP (ORF IV) und am 5´-Ende für die RNA-abhängige RNA-Polymerase BDV-L (ORF V) (Abb. 2). ORF x1 und ORF IV befinden sich hierbei in einem anderen Leseraster, als ORF I, II, III und V.
BDV zeichnet sich durch eine ungewöhnlich hohe Konservierung des Virusgenoms aus, die durch eine über 95%igen Sequenzübereinstimmung einzelner Feldisolate und Laborstämme zum Ausdruck kommt (BINZ et al., 1994; PLESCHKA et al., 2001). Eine Ausnahme hiervon bildet das BDV-Isolat No/98 aus einem BDV- erkrankten Pferd in Österreich, das mit einer Abweichung seiner Nukleotidsequenz um ca. 15% im Gegensatz zu den anderen BDV-Isolaten den ersten beschriebenen BDV-Subtypen darstellt (NOWOTNY et al., 2000; Übersicht bei DÜRRWALD et al., 2006). Die Abweichungen in der Nukleotidsequenz dieses Subtypen haben bei einem Großteil der BDV-Proteine erstaunlicherweise nur geringe Auswirkungen auf
die Primärstruktur. Bei anderen Isolaten führten dagegen bereits einzelne Nukleotid- mutationen zu Proteinalterationen (RICHT et al., 1997; HERDEN et al., 1999).
Bei dem kürzlich isolierten ABV soll es sich um neue Mitglieder innerhalb der Familie der Bornaviridae mit mindestens sechs verschiedenen Genotypen handeln (s. 2.1.1).
Dies wäre der erste Vertreter der Bornaviridae, der sich mit einer Sequenzhomologie von unter 70% deutlich von allen bisherigen BDV-Isolaten unterscheiden würde (KISTLER et al., 2008; STAEHELI et al., 2010).
2.2.3 Transkription und Replikation
Hinsichtlich der Lokalisation von Transkription und Replikation stellt das BDV eine Besonderheit dar. Als einziger tierpathogener Vertreter unter den NNS-RNA-Viren transkribiert und repliziert sich das BDV im Zellkern, vermutlich im Nukleolus (PYPER et al., 1998), infizierter Zellen. Transkription und Replikation erfolgen hierbei über die viruskodierte RNA-abhängige RNA Polymerase, die neben kompletter cRNA auch polyadenylierte und mit 5’-Kappe versehene subgenomische Transkripte verschiedener Größe produziert. Die Transkription kodierender +ssRNAs folgt bei den NNS-RNA-Viren einem strengen 3´-5´-Gradienten (IVERSON u. ROSE, 1981), was zu einer Abnahme der Anzahl neu gebildeter Transkripte von 3´- zu 5´-terminal lokalisierten Genen führt. Beim BDV ist ein ähnlicher, wenn auch weniger stark ausgeprägter Gradient, zu erkennen (TOMONAGA et al., 2002).
Im Gegensatz zu anderen Viren der Mononegavirales nutzt das BDV außergewöhnliche Transkriptions- und Replikationsstrategien, die es ihm ermöglichen von nur drei Transkriptionseinheiten (I-III) mindestens sechs Proteine zu exprimieren (Übersicht bei RICHT et al., 2007). Hierzu zählen das Vorkommen überlappender ORFs, das Durchlesen von Transkriptionsterminations-Signalen (read through) und alternatives Spleißen (SCHNEEMANN et al., 1994; Übersicht bei SCHNEEMANN et al., 1995; DE LA TORRE, 2002; TOMONAGA et al., 2002).
Innerhalb der Mononegavirales besitzen die Virusgenome Transkriptionsinitiations- signale (S) und Polyadenylierungs-/Terminationssignale (T) in den intergenetischen Regionen des Genoms. Das BDV-Genom besitzt mindestens drei Transkriptions- initiationssignale (S1-S3) und mindestens vier Terminationssignale (T1-T4) zur
Festlegung der drei Transkriptionseinheiten. Die ungewöhnliche Lage dieser Signale innerhalb des BDV-Genoms (Abb. 2) hat die erwähnte Überlappung der ORFs zur Folge (BRIESE et al., 1994; SCHNEEMANN et al., 1994; Übersichten bei DE LA TORRE, 2002, TOMONAGA et al., 2002). Ein fünftes hypothetisches Terminations- signal (t6) wurde von BRIESE et al. (1994) beschrieben. Die Bedeutung von t6 bei Transkription und Replikation ist noch nicht geklärt. Es wird jedoch vermutet, dass t6 in die Regulation des alternativen Spleißens involviert ist (TOMONAGA et al., 2000;
CUBITT et al., 2001).
Die Synthese des Virusgenoms erfolgt anhand einer kompletten cRNA (s. 2.2.2), die dem RNP als Matrize dient. Voraussetzung hierfür ist eine Inhibition der intergene- tischen Regulationssignale, die den Start und die Termination der spezifischen Transkripte markieren. Zudem müssen sowohl das Antigenom, als auch das neu synthetisierte Virusgenom von Nukleoproteinen umhüllt werden, um eine enzymatische Degradierung durch zelluläre RNasen und eine Hybridisierung beider komplementären Stränge zu vermeiden (BANERJEE et al., 1991).
2.2.4 Regulation der Genexpression
Transkriptionseinheit I (S1-T1) stellt die einzige monocistronische Transkriptions- einheit des BDV-Genoms dar. Sie enthält das ORF I, das für das BDV-N kodiert. In der bicistronischen Transkriptionseinheit II (S2-T2) liegen die überlappenden ORF II und ORF x1, die für BDV-P und BDV-X kodieren. Die Expression beider Proteine wird vermutlich am Ribosom durch Überlesen (leaky scanning) von stromaufwärts gelegenen Startkodons reguliert (WEHNER et al., 1997). Alternativ ist eine tricistronische Transkriptionseinheit (S1-T2) beschrieben, die durch Überlesen (readthrough) von T1 entstehen soll und sowohl ORF I, als auch ORF II und ORF x1 beinhaltet (POENISCH et al., 2008b).
Darüber hinaus ermöglicht sowohl in der ersten, als auch in der zweiten Transkriptionseinheit eine alternative Nutzung von zwei im Leseraster befindlichen Translations-Initiationskodons die Expression von zwei Isoformen des BDV-N (s.
2.2.5.1) bzw. des BDV-P (s. 2.2.5.2).
Die primären Transkripte der dritten Transkriptionseinheit haben ihren Ursprung am dritten Transkriptionsinitiationssignal (S3) und enden entweder am dritten oder am vierten Terminationssignal (T3/T4). Abhängig von der Lokalisation der Termination haben diese Transkripte primär eine Größe von 2,8 kb (S3-T3) bzw. 7,2 kb (S3-T4) und beinhalten die sich überlappenden ORF III und ORF IV für BDV-M und BDV-GP sowie bei einer Termination an T4 zusätzlich das ORF V für BDV-L. Üblicherweise endet die Transkription der dritten Transkriptionseinheit an T3. Nur in bis zu 5% der Fälle kommt es zu einem readthrough von T3 mit nachfolgender Termination an T4 (SCHNEEMANN et al., 1995; Übersicht bei SCHNEIDER, 2005).
3‘
Intron II Intron I
N P 5‘
X
L M
GP
S1 S2 S3
T1 T2 T3 T4
t6 Intron III
P X
GP M
GP
L M
GP M
L 1,2 kB N
0,8/3,5 kB
2,8 kB
7,2 kB
1,6/6,1 kB
2,7/7,1 kB
6,0 kB
165 kDa
8,4 kDa
1,9 kB N X P
3‘
Intron II Intron I
N P 5‘
X
L M
GP
S1 S2 S3
T1 T2 T3 T4
t6 Intron III
3‘
Intron II Intron I
N 5‘
N PP
X X
L L M
M
GP GP
S1 S2 S3
T1 T2 T3 T4
t6 Intron III
P X
P P X X
GP GP GP M
GP M
M
GP
L M
GP
L M
M
GP M
M M
L L 1,2 kB NNN
1,2 kB
0,8/3,5 kB
2,8 kB
7,2 kB
1,6/6,1 kB
2,7/7,1 kB
6,0 kB
165 kDa
8,4 kDa
1,9 kB N X P
1,9 kB NN X PP
Abb. 2: Schematische Darstellung des BDV-Genoms und der subgenomischen RNAs (in Anlehnung an DE LA TORRE, 2002 und CUBITT et al., 2001)
Abb. 2 (Fortsetzung):
Die open reading frames (ORFs) des BDV sind als Rechtecke im Virusgenom dargestellt. Die Positionen der Transkriptionsinitiations- und Terminationssignale sind als gewinkelte Pfeile (S1-S3) bzw. als rote Marken (T1-T4, t6) eingezeichnet. Die ungewöhnliche Lage dieser Signale hat teilweise überlappende ORFs zur Folge: Das Signal S2 der Transkriptionseinheit II ist 18 Nukleotide stromabwärts des Terminationssignals der Transkriptionseinheit I (T1) lokalisiert, während das Terminationssignal der Transkriptionseinheit II (T2) dagegen in dem S3-Signal der Transkriptionseinheit III in toto inkorporiert ist. Neben der 1,2 kB großen, BDV-N kodierenden, subgenomischen RNA und den primären Transkripten, die ORF II (BDV-P) und ORF x1 (BDV-X) beinhalten (0,8 bzw. 3,5 kB) existiert eine 1,9 kB große subgenomische RNA, die sowohl ORF I als auch ORF II und ORF x1 enthält.
Die primären Transkripte der Transkriptionseinheit III (S3-T3/T4) werden alternativ gespleißt. Primär weisen diese Transkripte eine Größe von 2,8 kB bzw. 7,2 kB auf. Das 2,8 kB große Transkript enthält die sich überlappenden ORF III (BDV-M) und ORF IV (BDV-GP). 7,2 kB große Transkripte enthalten zusätzlich das ORF V (BDV-L). Das Überlesen des Terminationssignals T3 ist für die Synthese der 7,2 kB großen subgenomischen RNA und somit für die Expression des BDV-L essentiell.
Posttranskriptionelles Spleißen und Fehlen der Introns in den subgenomischen RNAs sind durch nach oben offene Kerben gekennzeichnet. Die Größe der jeweiligen subgenomischen RNA ist links im Bild angegeben (blaue Schrift = Spleißvarianten). Durch das Spleißen von Intron III sollen subgenomische RNAs entstehen, die für zwei weitere BDV-Proteine mit einer Molekularmasse von 8,4 kDa (S3-t6) und 165 kDa (p165; S3-T4) kodieren könnten (rote Schrift). Das p165 stellt hierbei möglicherweise eine neue Form der Polymerase dar.
N: Nukleoprotein; P: Phosphoprotein; X: X-Protein; M: Matrixprotein; GP: Glykoprotein; L: large protein (Polymerase); schraffierte Boxen: entsprechendes ORF wird nicht translatiert
In den primären polycistronischen Transkripten der dritten Transkriptionseinheit sind grundsätzlich drei Introns (I-III) lokalisiert (Abb. 2). Das nur 94 Nukleotide (nt) große Intron I liegt im ORF III, während das 1294 nt große Intron II im ORF IV lokalisiert ist.
Intron III (ca. 2150 nt) teilt sich die 5’-splice donor site mit Intron II, die entsprechende 3’-splice acceptor site liegt jedoch weiter stromabwärts als die des Intron II (SCHNEIDER et al., 1994; TOMONAGA et al., 2000; CUBITT et al., 2001).
Die posttranskriptionelle Modifikation in Form von alternativem Spleißen dieser Introns wird mit Hilfe der zellulären Spleiß-Maschinerie verwirklicht (BRIESE et al., 1992; SCHNEIDER et al., 1994, 1997b; SCHNEEMANN et al., 1994; DE LA TORRE, 2002) und erlaubt eine regulierte Expression von BDV-M, BDV-GP oder BDV-L.
Grundsätzlich wird davon ausgegangen, dass eine Synthese des BDV-M von allen subgenomischen RNAs ab S3 erfolgt, die Intron I enthalten. Hierzu zählen zum einen die bereits erwähnten primären, ungepleißten Transkripte mit einer Größe von 2,8 kb und 7,2 kb, zum anderen Intron II-gespleißte RNAs, die entsprechend ihrer Termination an T3 oder T4 eine Größe von 1,6 bzw. 6,1 kb aufweisen (Abb. 2).
BDV-GP wird von subgenomischen RNAs translatiert, die Intron II enthalten. Splei- ßen von Intron I soll dabei eine wesentliche Voraussetzung für eine effiziente Trans- lation von BDV-GP darstellen und führt zu subgenomischen RNAs mit einer Größe von 2,7 bzw. 7,1 kb (SCHNEIDER et al., 1994, 1997b; Übersicht bei SCHNEIDER, 2005) (Abb. 2). Nur ein geringer Anteil BDV-GP soll durch leaky scanning auch von Intron-I-haltiger subgenomischer RNA synthetisiert werden (SCHNEIDER et al., 1997b). BDV-L kann nur von Intron II-gespleißten Transkripten exprimiert werden, die an T4 enden, da erst durch diese Prozessierung das BDV-L kodierenden ORF geschaffen wird (WALKER et al., 2000; Übersicht bei SCHNEIDER, 2005). Eine effiziente Synthese des BDV-L scheint zudem nur nach zusätzlichem Spleißen von Intron I zu erfolgen (SCHNEIDER, 2005). Demzufolge entsteht hierbei eine subgenomische RNA mit einer Größe von 6,0 kb (Abb. 2).
Durch Spleißen von Intron III sollen subgenomische RNAs entstehen, die für zwei weitere BDV-Proteine mit einer Molekularmasse von 8,4 kDa (S3-t6) und 165 kDa (p165; S3-T4) kodieren könnten (Abb. 2).
Die Relevanz von Intron III bleibt jedoch unklar. Zum einen fehlt diese Spleißstelle im BDV-Isolat No/98 in toto (PLESCHKA et al., 2001), zum anderen wird bei den übrigen BDV-Isolaten die Nutzung von Intron III durch eine exon splicing suppressor sequence (ESS) unterdrückt. Theoretisch würde jedoch bei einer Termination an t6 die ESS aufgrund ihrer Lokalisation nicht mehr transkribiert, wodurch die Hemmung des Intron III-Spleißens aufgehoben werden könnte (TOMONAGA et al., 2000).
Die Regulation der Genexpression wird bei experimentell infizierten Tieren durch Differenzen in Bezug auf den Zeitpunkt der maximalen Expression viraler Proteine post infectionem (p.i.) deutlich (Abb. 3).
Bei intrazerebral infizierten Lewis-Ratten tritt die maximale Expression des BDV-GP früher ein, als die des BDV-N und BDV-M. Zu späteren Zeitpunkten ist eine Abnahme von BDV-GP und BDV-M zu beobachten, während BDV-N maximal exprimiert bleibt (WERNER-KEIŠS, 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008).
Auch hinsichtlich Zelltropismus, intrazerebraler und intrazellulärer Ausbreitung weist BDV-GP gegenüber BDV-N und BDV-M Unterschiede auf (s. 2.2.5).
prominenteste perivaskuläre und hochgradige parenchymatöse Entzündungszellinfiltrate
0 7 14 18 24 31 42 50 60
akutes klinisches Stadium Übergang zum chronischen klinischen Stadium
leptomeningeale Entzündungszell-
infiltrate
perivaskuläre Entzündungszell-
infiltrate
reaktive Astrogliose
Abnahme entzündlicher Infiltrate
Entwicklung eines Hydrocephalus
internus BDV-N, BDV-M
und BDV-GP immunhistologisch
nachweisbar
Max.
BDV-GP
Max. BDV-N Max. BDV-M
BDV-N- und BDV- GP-spezifische
mRNA und genomische RNA
mittels ISH nachweisbar
Max. BDV-N- und BDV-GP-spezifische mRNA und genomische RNA
Tage p. i.
prominenteste perivaskuläre und hochgradige parenchymatöse Entzündungszellinfiltrate
0 7 14 18 24 31 42 50 60
akutes klinisches Stadium Übergang zum chronischen klinischen Stadium
leptomeningeale Entzündungszell-
infiltrate
perivaskuläre Entzündungszell-
infiltrate
reaktive Astrogliose
Abnahme entzündlicher Infiltrate
Entwicklung eines Hydrocephalus
internus BDV-N, BDV-M
und BDV-GP immunhistologisch
nachweisbar
Max.
BDV-GP
Max. BDV-N Max. BDV-M
BDV-N- und BDV- GP-spezifische
mRNA und genomische RNA
mittels ISH nachweisbar
Max. BDV-N- und BDV-GP-spezifische mRNA und genomische RNA
Tage p. i.
Abb. 3: Darstellung des zeitlichen Verlaufes von Klinik, Entzündungsreaktion und Expression der BDV-Strukturproteine sowie deren subgenomischen RNAs nach intrazerebraler Infektion von Lewis-Ratten (nach WERNER-KEIŠS, 2006)
Dargestellt sind klinischer Verlauf (schwarze Schrift), zeitlicher Ablauf der Entzündungsreaktion (blaue Schrift), Zeitpunkt des frühesten immunhistologischen Nachweises von BDV-N, BDV-M und BDV-GP, sowie der Zeitraum ( ) ihrer maximalen Expression (rote Schrift) und der Zeitpunkt des frühesten Nachweises BDV-N- und BDV-GP-spezifischer RNA mittels ISH, sowie der Zeitraum ( ) ihrer maximalen Expression (grüne Schrift) bei intrazerebral BDV-infizierten Lewis-Ratten.
p. i.: post infectionem; BDV-N: Nukleoprotein; BDV-M: Matrixprotein; BDV-GP: Glykoprotein;
Max.: maximale Expression
Auf RNA-Ebene (mRNA, genomische RNA) ist der Zeitraum der maximalen Expres- sion BDV-N- und BDV-GP-spezifischer RNAs bei experimentell infizierten Ratten identisch (Abb. 3), während sich in Bezug auf die exprimierenden Zelltypen und die intrazelluläre Verteilung Unterschiede ergeben. Während BDV-N-spezifische RNA im
gesamten Gehirn detektiert wird, ist BDV-GP-spezifische RNA in weniger Zellen und nur in bestimmten Gehirnarealen verstärkt nachweisbar. BDV-N-spezifische mRNA liegt vorranging im Zytoplasma und in den Fortsätzen, zum Teil auch in den Nuklei von Neuronen und Ependymzellen vor. BDV-GP-spezifische mRNA wird dagegen nur in Neuronen eindeutig im Zytoplasma nachgewiesen, während sie in anderen Zelltypen des ZNS nur im Kern zu finden ist. Genomische RNA tritt generell vor- wiegend in Zellkernen auf (WERNER-KEIŠS, 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008).
Die meisten der oben genannten Ergebnisse stammen aus experimentellen in vitro- und in vivo-Untersuchungen. Inwieweit eine gleichartige Expressionsstrategie viraler Transkripte und Proteine beim natürlich infizierten Pferd erfolgt, ist nicht detailliert untersucht.
2.2.5 Proteine des Borna Disease Virus (BDV)
2.2.5.1 Nukleoprotein
Die erste Transkriptionseinheit enthält das ORF I, das für das virale Nukleoprotein (BDV-N) kodiert. Die alternative Nutzung von zwei im Leseraster befindlichen Translations-Initiationskodons, die 13 Aminosäuren voneinander entfernt liegen, führt zu einer Expression von zwei Isoformen des Nukleoproteins mit einem Molekular- gewicht von 40 kDa (p40) bzw. 38 kDa (p38) (PYPER u. GARTNER, 1997). Lediglich die p40-Isoform besitzt an ihrem N-terminalen Ende ein Kern-Lokalisierungs-Signal (nuclear localization signal, NLS), das als karyophile Sequenz für die Translokation des Proteins in den Zellkern verantwortlich ist (Abb. 4). Des Weiteren werden zwei N- terminal gelegene hydrophobe Interaktionsdomänen beschrieben, die eine Bindung beider Isoformen mit BDV-P ermöglichen (BERG et al., 1998). Beide Isoformen weisen außerdem ein Leucin-reiches Kern-Export-Signal (nuclear export signal, NES) auf, das mit einer dieser Interaktionsdomänen überlappt und die TELEISSI- Region, welche das immundominante Epitop des BDV-N für CD8+ T-Zellen bei der Maus darstellt, enthält (KOBAYASHI et al., 2001; SCHAMEL et al., 2001).
Generell sind Nukleoproteine der NNS-RNA-Viren essentieller Bestandteil des Nukleokapsids (THOMAS et al., 1985; CALAIN u. ROUX, 1993; BHELLA et al., 2002) und funktioneller Bestandteil des viralen Polymerase-Komplexes. BDV-N stellt
aufgrund des Pendelns zwischen Zytoplasma und Nukleus (nucleocytoplasmatic shuttling) einen wichtigen Faktor beim Transport des viralen RNP aus dem Kern dar (KOBAYASHI et al., 2001).
In vivo ist BDV-N bei experimentell infizierten Lewis-Ratten und TNFα-transgenen Mäusen disseminiert im Gehirn nachweisbar und stellt das am höchsten exprimierte virale Protein dar. Es wurde sowohl in Neuronen, als auch in Astrozyten, Oligoden- drozyten und Ependymzellen detektiert. Im Unterschied zu in vitro-Untersuchungen, in denen BDV-N lediglich im Zellkern infizierter Zellen nachweisbar war (PYPER u.
GARTNER, 1997), lag BDV-N bei diesen Ratten und Mäusen sowohl im Nukleus als auch im Perikaryon und den Fortsätzen infizierter Zellen vor (HERDEN, 1997;
HERDEN et al., 2000; KRAMER, 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008). Natürlich infizierte Pferde weisen in Bezug auf Zelltropismus und intrazelluläre Verteilung des BDV-N eine vergleichbare Expression auf (HERDEN et al., 1999).
2.2.5.2 Phosphoprotein
Das Phosphoprotein (BDV-P) entsteht aus einer bicistronischen mRNA, deren Trans- kription am zweiten Initiationssignal (S2) beginnt, und die neben dem Phosphopro- tein auch das X-Protein codiert. Wie beim BDV-N bereits beschrieben, existieren auch von BDV-P zwei Isoformen, die durch alternative Nutzung zweier im Leseraster befindlichen Translations-Initiationskodons entstehen und ein Molekulargewicht von 24 kDa (p24) bzw. 16 kDa (p16) besitzen (KOBAYASHI et al., 2000). Die p24- Isoform weist zwei unabhängige, Prolin-reiche NLS auf, von denen eins am N- und das andere am C-terminalen Ende lokalisiert ist (SHOYA et al., 1998). Im Unter- schied zu der p24-Isoform zeichnet sich die p16-Isoform durch Fehlen der ersten 55 Aminosäurereste und demzufolge auch durch Fehlen des N-terminalen NLS aus, das in diesem Bereich lokalisiert ist (KOBAYASHI et al., 2000). BDV-P verfügt außerdem über fünf weitere Interaktionsdomänen (Abb. 4). Dieses sind eine BDV-N- und BDV- L-Interaktionsdomäne, sowie eine Homo-Oligomerisationsdomäne am C-Terminus und eine BDV-X- und BDV-M-bindende Domäne am N-Terminus (SCHWEMMLE et al., 1998; SCHNEIDER et al., 2004; CHASE et al., 2007). Des Weiteren wurde ein
potentielles NES im Bereich der Homo-Oligomerisationsdomäne identifiziert (YANAI et al., 2006).
Phosphoproteine anderer NNS-RNA-Viren stellen essentielle Kofaktoren für die virale Polymerase dar (BANERJEE et al., 1991; HORIKAMI et al., 1992). Im Fall des BDV-P werden aufgrund der möglichen Interaktion mit BDV-N, BDV-L und BDV-X, sowie des potentiellen aktiven nukleozytoplasmatischen Transportes mit Hilfe von NLS bzw. NES ähnliche Funktionen angenommen. Des Weiteren wurde bewiesen, dass die Kofaktoraktivität des BDV-P durch Phosphorylierung negativ beeinflusst wird (SCHMID et al., 2007). BDV-P-Oligomere sollen zudem eine Gerüstfunktion innehaben, welche die RNA-Polymerase in unmittelbare Nähe der viralen RNA führt und somit die RNA-Synthese einleitet (SCHNEIDER et al., 2004). Ein ähnlicher Mechanismus wurde bereits beim Sendai-Virus beschrieben (CURRAN, 1998).
In vitro ist BDV-P vorwiegend im Nukleus, aber auch im Zytoplasma infizierter Zellen nachweisbar (KOBAYASHI et al., 1998, 2003; SCHWEMMLE et al., 1998; SHOYA et al., 1998). Bei experimentell infizierten Lewis-Ratten liegt BDV-P disseminiert im Ge- hirn vor. Es ist hier wie bei natürlich infizierten Pferden auch sowohl in Nukleus, als auch in Zytoplasma, Fortsätzen und Neuropil von Neuronen, Astrozyten, Oligoden- drozyten und Ependymzellen nachweisbar (HERDEN, 1997; HERDEN et al., 1999).
2.2.5.3 X-Protein
Das X-Protein (BDV-X) ist ein Nicht-Strukturprotein, das mit einer Molekularmasse von ca. 10 kDa (p10) das kleinste beschriebene BDV-spezifische Protein darstellt.
Das BDV-X-kodierende ORF x1 startet 49 Nukleotide stromaufwärts des ORF II und überlappt dessen N-terminales Ende in einem unterschiedlichen Leseraster (WEHNER et al., 1997; TOMONAGA et al., 2002). BDV-X verfügt an Aminosäure- position 8-15 über eine Leucin-reiche Interaktionsdomäne, die eine direkte Bindung an BDV-P ermöglicht (Abb. 4). Die BDV-X-Interaktionsdomäne weist darüber hinaus Ähnlichkeit mit einem NES auf (WOLFF et al., 2000) und ermöglicht eine Kolokalisation mit Mitochondrien (mitochondrial targeting) (POENISCH et al., 2009).
In vitro bindet BDV-X über eine karyophile Aminosäuresequenz an seinem N- Terminus an den zellulären NLS-Rezeptor Importin α und gelangt höchstwahrscheinlich auf diesem Weg in den Nukleus (WOLFF et al., 2002).
Einige NNS-RNA-Viren kodieren Hilfsproteine, die nicht mittelbar für die virale RNA- Synthese benötigt werden, aber an der Regulation verschiedener Phasen im viralen Vermehrungszyklus beteiligt sind (NAGAI u. KATO, 1999; NEUMANN et al., 2002).
BDV-X fungiert über Interaktion mit BDV-P als Regulationsfaktor des viralen Poly- merase-Komplexes (2.2.6). Aufgrund von in vitro-Untersuchungen werden BDV-X zudem essentielle Funktionen bei der Virusreplikation und der Etablierung der viralen Persistenz zugeschrieben (POENISCH et al., 2007, 2009).
In vitro liegt BDV-X vorwiegend im Nukleus, in Kolokalisation mit der p38-Isoform von BDV-N, vor (SCHWARDT et al., 2005), während die geringere zytoplasmatische Fraktion fast ausschließlich mit Mitochondrien kolokalisiert ist (POENISCH et al., 2009). Bei natürlich und experimentell infizierten Tieren hingegen, ist BDV-X vor allem im Zytoplasma nachweisbar (WEHNER et al., 1997; HERDEN et al., 1999).
2.2.5.4 Matrixprotein
Das BDV zeichnet sich innerhalb der Mononegavirales durch das kleinste Matrix- protein (BDV-M, p16) aus. Bei dem vom ORF III kodierten BDV-M handelt es sich entgegen früheren Berichten, die das BDV-M als an der Virusoberfläche lokalisiertes Glykoprotein darstellten, um ein nicht glykosiliertes Matrixprotein, das mit der inneren Schicht der Hüllmembran des Virions assoziiert ist (KRAUS et al., 2001).
Matrixproteine behüllter RNA-Viren zeichnen sich durch die Interaktion mit dem Ribonukleoprotein einerseits und viruskodierten Proteinen der Hüllmembran andererseits als ein wichtiger Faktor bei der Freisetzung reifer Viruspartikel aus (MARTIN u. HELENIUS, 1991; GAROFF et al., 1998).
Für das BDV-M wird eine ähnliche Beteiligung an Viruszusammensetzung und -freisetzung angenommen (KRAUS et al., 2001, 2005).
In Untersuchungen mit rekombinantem BDV-M (rBDV-M) wurde eine Homo-Oligome- risation von BDV-M unter Ausbildung stabiler Tetramere und Tendenz zur Formation hochmolekularer, zweidimensionaler Gitterstrukturen nachgewiesen. NEUMANN et al. (2009) zeigten des Weiteren, dass BDV-M in der Lage ist, Lipidmembranen und RNA simultan zu binden. Eine nukleäre Kolokalisation des BDV-M mit BDV-N, BDV- P und BDV-X und dem viralen Genom sowie der Nachweis einer spezifischen
Interaktion mit BDV-P und RNA macht außerdem deutlich, dass es sich bei BDV-M um eine wesentliche Komponente des viralen RNPs handelt. BDV-M könnte folglich, durch Ausbildung einer Gerüststruktur an der inneren Hüllmembran mit gleichzeitiger Bindung viraler RNA, eine zentrale Rolle in der Viruszusammensetzung innehaben (KRAUS et al., 2005).
Die Interaktion des BDV-M mit dem RNP scheint die Polymeraseaktivität nicht zu beeinflussen, was als ein möglicher Regulationsmechanismus für die Freisetzung maturer Viruspartikel angesehen wird (vgl. 2.3) (CHASE et al., 2007).
In vitro-Untersuchungen ergaben, dass BDV-M sowohl im Zytoplasma, als auch im Nukleus infizierter Zellen zu finden ist. In vivo ist BDV-M bei experimentell infizierten Lewis-Ratten in vor allem in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen nachweisbar und ist in diesen Zellen vorwiegend im Zytoplasma, in Oligodendrozyten und Ependymzellen vereinzelt auch im Nukleus lokalisiert (WERNER-KEIŠS et al., 2002; WERNER-KEIŠS, 2006). Bei experimentell infizierten TNFα-transgenen Mäusen wurde BDV-M disseminiert im Gehirn, sowohl im Zytoplasma und den Fortsätzen von Neuronen, als auch im Zytoplasma von Astrozyten und Oligodendrozyten detektiert (KRAMER, 2006). Über Zelltropismus und intrazelluläre Verteilung des BDV-M bei natürlich infizierten Pferden sind bis dato keine detaillierten Untersuchungen bekannt.
2.2.5.5 Glykoprotein
Der in der Transkriptionseinheit III gelegene ORF IV kodiert für das einzige BDV- spezifische Glykoprotein (BDV-GP). Das BDV-GP besteht aus einer Polypetidkette mit insgesamt 503 AS, die 13 potentielle Glykosilierungsstellen aufweist und im nicht glykosilierten Zustand ein Molekulargewicht von 56 kDa (p56) besitzt. Dieses nicht glykosilierte p56-Vorläuferprotein inseriert als Typ I Membranprotein im endoplasmatischen Retikulum (ER). Hier findet eine N-Glykosilierung statt, wodurch die molekulare Masse des BDV-GP auf 94 kDa (gp94) erhöht wird (SCHNEIDER et al., 1997a). Die N-Glykosilierung des BDV-GP stellt einen wichtigen Faktor für die Stabilität der Proteinstruktur und die Maskierung antigener Epitope dar (GONZALES- DUNIA et al., 1997; RICHT et al., 1998; EICKMANN et al., 2005). Im weiteren Verlauf der Glykoproteinreifung gelangen diese N-glykosilierten Proteine, abgesehen von
