Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit

Aus dem Institut für Pathologie Tierärztlichen Hochschule Hannover

Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit –

Einfluss auf Zytokinprofil,

Neurodegeneration und Neuroprotektion

THESE

zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)

im Fachgebiet Pathologie

durch die

Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Dirk Schaudien

aus Leverkusen

Hannover 2007

Supervisor: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

Univ.-Prof. Dr. Georg Herrler PD. Dr. Ulrich Eisel

1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Univ.-Prof. Dr. Georg Herrler

Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover PD. Dr. Ulrich Eisel

Department of Molecular Neurobiology, University of Groningen, Netherlands 2. Gutachten: Univ.Prof. Dr. Felix Ehrensberger

Institut für Veterinärpathologie der Universität Zürich, Schweiz

Datum der mündlichen Prüfung: 19. November 2007

Der Fortgang der wissenschaftlichen Entwicklung ist im Endeffekt eine ständige Flucht vor dem Staunen.

Albert Einstein

Daten der vorliegenden Arbeit wurden für folgende Publikation verwandt:

Dirk Schaudien, Wolfgang Baumgärtner and Christiane Herden (2007) High Preservation of DNA Standards Diluted in 50% Glycerol

Diag Mol Pathol, 16: 153-157

Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeiträge präsentiert:

Schaudien D, Herden C, Kramer K, Marchetti L, Eisel U, Richt J, Baumgärtner W (2004)

Unusual degenerative changes in the brain of TNFα- transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus

Poster auf der 22ste Jahrestagung der Europäischen Gesellschaft für Veterinärpathologie (ESVP) 15.–18. 09. 2004 in Olsztyn, Polen

Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Richt J, Baumgärtner W, Herden C (2005)

Degenerative brain lesions of TNFα- transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus

Poster auf dem Kongress des Zentrums für Systemische Neurowissenschaften (ZSN), Brainstorming I, 18.–21. 05. 2005 in Hannover

Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C (2006)

Role of TNF and its receptor 1 and 2 in Borna disease virus infected TNF-transgenic mice Poster auf der 51ste Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie (DGNN) vom 20.-24. 09. 2006 in Mannheim

Acta Neuropathol, 112: 372

Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C (2007)

Caspase-dependent and -independent apoptosis in TNF-transgenic mice infected with the neurotropic Borna Disease virus

Poster auf der 25ste Jahrestagung der Europäischen Gesellschaft für Veterinärpathologie (ESVP) vom 29. 08.–01. 09. 2007 in München

Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C (2007)

Cytokine profile of TNF-transgenic mice infected with the neurotropic Borna disease virus resembles incomplete Th1 response

Vortrag auf der 25ste Jahrestagung der Europäischen Gesellschaft für Veterinärpathologie (ESVP) vom 29. 08.–01. 09 2007 in München

Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C (2007)

Up-regulation of BDNF mRNA in the hippocampus of Borna Disease virus-infected TNF- transgenic mice

Poster auf der 52ste Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie (DGNN) vom 05.-08. 09. 2007 in Greifswald

Acta Neuropathol, 114: 324

Schaudien D, Kramer K, Eisel U, Baumgärtner W, Herden C (2007)

Impact of TNF overexpression on the cytokine profile after infection with the neurotropic Borna disease virus

Vortrag auf der 52ste Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neuropathologie und Neuroanatomie (DGNN) vom 05.-08. 09. 2007 in Greifswald

Acta Neuropathol, 114: 324

1

Einleitung _____________________________________________________________ 1

2

Literaturübersicht_______________________________________________________ 3 2.1 Die Bornasche Krankheit ____________________________________________ 3 2.1.1 Experimentelle BDV-Infektion von Ratten____________________________ 4 2.1.2 Experimentelle BDV-Infektion von Mäusen __________________________ 8 2.2 Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) _____________________________________ 11 2.2.1 TNF und TNF- vermittelte Signalwege _____________________________ 11 2.2.2 Funktionen des TNF und seiner Rezeptoren im ZNS ___________________ 14 2.2.3 TNF-transgene Mausmodelle _____________________________________ 19 2.3 Expression weiterer Zytokine im Gehirn ______________________________ 20 2.3.1 Proinflammatorische Zytokine ____________________________________ 21 2.3.2 Antiinflammatorische Zytokine ___________________________________ 24 2.4 Neuroprotektive Faktoren __________________________________________ 25 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) __________________________ 25 2.4.2 Activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) ___________________ 27

3

Material und Methoden _________________________________________________ 29 3.1 Mäuse ___________________________________________________________ 29 3.1.1 Tierhaltung ___________________________________________________ 29 3.1.2 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels quantitativer Polymerase

Kettenreaktion (qPCR) __________________________________________ 30 3.2 Viruspräparation__________________________________________________ 33 3.3 Versuchsdurchführung und Versuchsablauf ___________________________ 34 3.3.1 Infektion _____________________________________________________ 35 3.3.2 Probenentnahme und untersuchte Gehirnregionen _____________________ 35 3.4 Histopathologische Präparation______________________________________ 37 3.4.1 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung _________________________________ 37 3.4.2 Auswertung und Statistik ________________________________________ 37 3.4.3 Luxol-Fast-Blue-/Kresylechtviolett-Färbung _________________________ 38 3.4.4 Auswertung ___________________________________________________ 39 3.5 Immunhistologie __________________________________________________ 39 3.5.1 Antikörper und Seren ___________________________________________ 39 3.5.2 Protokolle der immunhistologischen Färbungen (ABC-Methode) _________ 42 3.5.3 Kontrollen ____________________________________________________ 44 3.5.4 Auswertung und Statistik ________________________________________ 44 3.6 Doppelmarkierungen ______________________________________________ 46 3.7 TUNEL-Methode__________________________________________________ 46 3.7.1 Protokoll der TUNEL-Methode ___________________________________ 46 3.7.2 Kontrollen ____________________________________________________ 47 3.7.3 Auswertung und Statistik ________________________________________ 48 3.8 Elektronenmikroskopie ____________________________________________ 48 3.8.1 Protokoll der Herstellung der Epoxidharzblöcke ______________________ 48 3.8.2 Auswertung ___________________________________________________ 49

3.9.1 RNA-Isolierung________________________________________________ 49 3.9.2 Aufreinigung der RNA __________________________________________ 50 3.9.3 Reverse Transkription (RT) ______________________________________ 51 3.9.4 Primer _______________________________________________________ 53 3.9.5 Standardreihen_________________________________________________ 54 3.9.6 Reaktionsansatz qRT-PCR _______________________________________ 60 3.9.7 Kontrollen ____________________________________________________ 62 3.9.8 Auswertung und Statistik ________________________________________ 62

4

Ergebnisse____________________________________________________________ 64 4.1 Immunhistologischer Nachweis des viralen Nukleoproteins im Gehirn _____ 64 4.2 Morphologische Charakterisierung der Entzündungsreaktion ____________ 65 4.2.1 Auswertung der HE-gefärbten Schnitte _____________________________ 65 4.2.2 Quantifizierung der Zellkerngröße GFAP-positiver Zellen ______________ 67 4.2.3 Immunhistologischer Nachweis von TNFR1 _________________________ 69 4.2.4 Immunhistologischer Nachweis von TNFR2 _________________________ 71 4.3 Degenerative Veränderungen________________________________________ 73 4.3.1 Quantifizierung der Vakuolisierung ________________________________ 73 4.3.2 Quantifizierung der Zellen mit Anzeichen von Apoptose _______________ 75 4.3.3 Auswertung der Luxol-Fast-Blue-Färbung ___________________________ 77 4.3.4 Auswertung der Elektronenmikroskopie_____________________________ 77 4.3.5 Nachweis von aktivierter Caspase 3 ________________________________ 78 4.3.6 Nachweis TUNEL-positiver Zellen ________________________________ 80 4.4 Immunhistologischer Nachweis protektiver Faktoren ___________________ 82 4.4.1 NF-κB Untereinheit p50 _________________________________________ 82 4.4.2 BDNF _______________________________________________________ 84 4.4.3 ADNP _______________________________________________________ 85 4.5 Quantifizierung zellulärer Gene mittels real-time RT-PCR _______________ 87 4.5.1 Transgenes TNF mRNA _________________________________________ 89 4.5.2 Gesamt-TNF mRNA ____________________________________________ 91 4.5.3 TNFR1 mRNA ________________________________________________ 94 4.5.4 TNFR2 mRNA ________________________________________________ 97 4.5.5 IL-1α mRNA __________________________________________________ 99 4.5.6 IL-2 mRNA __________________________________________________ 102 4.5.7 IL-6 mRNA __________________________________________________ 103 4.5.8 IL-12 mRNA _________________________________________________ 104 4.5.9 IFNγ mRNA _________________________________________________ 105 4.5.10 IL-4 mRNA __________________________________________________ 109 4.5.11 IL-5 mRNA __________________________________________________ 109 4.5.12 IL-10 mRNA _________________________________________________ 111 4.5.13 TGFβ1 mRNA________________________________________________ 114 4.5.14 BDNF mRNA ________________________________________________ 115 4.5.15 NR2B-Rezeptor mRNA ________________________________________ 118 4.5.16 Kainat1-Rezeptor mRNA _______________________________________ 120 4.6 Fotographische Dokumentation der Ergebnisse _______________________ 121

5

Diskussion___________________________________________________________ 133 5.1 Entzündliche Reaktion ____________________________________________ 135

5.2 GFAP-Zellkerndurchmesser _______________________________________ 135 5.3 TNF-Rezeptoren _________________________________________________ 136 5.4 Quantifizierung des TNF __________________________________________ 139 5.5 Degenerative Prozesse_____________________________________________ 141 5.5.1 Caspase 3 und TUNEL _________________________________________ 143 5.6 Protektive Faktoren ______________________________________________ 145 5.7 Quantifizierung der Zytokine ______________________________________ 149 5.7.1 Proinflammatorische Zytokine ___________________________________ 150 5.7.2 Antiinflammatorische Zytokine __________________________________ 152 5.8 Zytokinprofil ____________________________________________________ 154 5.9 Schlussbetrachtung _______________________________________________ 155

6

Zusammenfassung ____________________________________________________ 158

7

Summary____________________________________________________________ 161

8

Literaturverzeichnis ___________________________________________________ 164

9

Anhang _____________________________________________________________ 193 9.1 Tabellen ________________________________________________________ 193 9.1.1 Nachweis viraler Proteine _______________________________________ 193 9.1.2 Histopathologische Befunde _____________________________________ 194 9.1.3 Immunhistologische Befunde ____________________________________ 195 9.1.4 Untersuchung degenerativer Veränderungen ________________________ 197 9.1.5 Immunhistologische Untersuchungen protektiver Faktoren _____________ 200 9.1.6 Übersicht der Ergebnisse der real-time RT-PCR _____________________ 201 9.2 Mäusehaltung ___________________________________________________ 210 9.3 Lösungen und Puffer______________________________________________ 211 9.3.1 Elektronenmikroskopie _________________________________________ 211 9.3.2 Immunhistologie ______________________________________________ 211 9.3.3 Klonierungsreaktion ___________________________________________ 211 9.3.4 RNA-Isolierung, RT-PCR, real-time RT-PCR und Gelelektrophorese ____ 212 9.4 Bezugsquellen für Reagenzien und Antikörper ________________________ 214 9.5 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel__________________________ 218 9.6 Abkürzungen ____________________________________________________ 222

1 Einleitung

Die experimentelle Infektion mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV) führt zu einer virusinduzierten, immunpathologisch bedingten Erkrankung mit Viruspersistenz im zentralen Nervensystem (ZNS), welche sich durch eine nicht eitrige Meningoenzephalitis auszeichnet. Zum Studium der zugrunde liegenden Pathogenitätsmechanismen werden verschiedene Nagermodelle verwendet. Der Einsatz transgener oder knock out Mäuse eröffnet die Möglichkeit durch gezielte genetische Veränderungen spezielle Fragestellungen der Immunpathogenese und des Virusverhaltens in vivo zu untersuchen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass an den immunpathologischen Prozessen Zytokine, Chemokine und andere Entzündungsmediatoren maßgeblich beteiligt sind. Dabei wird vor allem dem Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) als proinflammatorisches Zytokin eine wichtige Rolle bei der BDV-Infektion zugeschrieben, wobei das Zytokinprofil im ZNS der Maus nach BDV-Infektion bisher noch nicht genauer untersucht ist. Weiterhin liegen keine Untersuchungen zur Modulation der TNF-Expression im ZNS vor. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass TNF je nach Expressionsgrad eine degenerative oder protektive Wirkung entfalten kann.

Die vielfältigen Wirkungsweisen des TNF bei virusinduzierten immunpathologischen Vorgängen im ZNS sollen im Rahmen dieser Studie anhand der experimentellen BDV- Infektion einer transgenen Mauslinie mit neuronaler TNF-Überexpression näher charakterisiert werden. Die Expression des TNF über den N-methyl-D-aspartat (NMDA)- Glutamatrezeptor bewirkt eine moderate Überexpression in Ammonshorn, Cortex cerebri, Thalamus und Striatum. In diesen Lokalisationen ist schon zu frühen Zeitpunkten nach der Infektion Virus konstant vorhanden, so dass eine Wechselwirkung zwischen der TNF- Überexpression und der Entwicklung entzündlicher Reaktionen und konsekutiver degenerativer/protektiver Prozesse zu erwarten ist. Die moderate TNF-Überexpression per se führt bei nicht infizierten Tieren zu keinen spontanen entzündlichen oder degenerativen Veränderungen im ZNS. Durch den Einsatz homo- und heterozygoter Tiere kann weiterhin der Einfluss von TNF detailliert untersucht werden.

Ziel dieser Arbeit war es, durch eine transgen induzierte TNF-Überexpression degenerative und protektive Effekte im Rahmen der murinen BDV-Infektion zu modulieren und zu charakterisieren, wobei zusätzlich erstmals das Zytokinprofil in transgen-exprimierenden und nicht exprimierenden Gehirnarealen bei der Maus nach BDV-Infektion analysiert werden sollte. Diese Untersuchungen stellen einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis

virusinduzierter immunbedingter Enzephalitiden und damit verbundener degenerativer und protektiver Prozesse dar.

2 Literaturübersicht

2.1 Die Bornasche Krankheit

Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) ist eine seit langem bekannte persistente Virusinfektion des zentralen Nervensystems (ZNS; ZWICK 1939; HEINIG, 1969; ROTT und BECHT, 1995). Sie wird durch das Borna disease Virus (BDV), ein nicht segmentiertes, einzelsträngiges, behülltes RNA-Virus, verursacht, welches in die Familie Bornaviridae, Ordnung Mononegavirales eingeordnet ist. Das Genom weist eine negative Polarität und eine Größe von etwa 8,9 kB auf. Es enthält sechs offene Leserahmen, die für das virale Nukleoprotein (BDV-N, p40), das Phosphoprotein (BDV-P, p24), das Matrixprotein (BDV- M, p16) das Glykoprotein (BDV-GP, gp94), die RNA-abhängige RNA-Polymerase (L- Protein, p180) und das X-Protein (BDV-X, p10) kodieren (BRIESE et al., 1994; CUBITT et al., 1994; DE LA TORRE, 2002; TOMONAGA et al., 2002).

In den Jahren 1894 und 1896 kam es zu verheerenden, endemischen Ausbrüchen der damals als „Seuchenhafte Gehirn-Rückenmarksentzündung“ bezeichneten Erkrankung unter Kavalleriepferden in der sächsischen Stadt Borna, welche letztendlich der Krankheit den heutigen Namen „Bornasche Krankheit“ gaben. Natürliche Infektionen werden vor allem bei Pferden und Schafen beobachtet; histologisch ist die BD typischerweise durch eine nichteitrige Meningoenzephalitis gekennzeichnet (ZWICK, 1939; HEINIG, 1969; ROTT und BECHT, 1995, STAEHELI et al., 2000; RICHT et al., 2001). Darüber hinaus haben neuere Studien ergeben, dass bei einer Reihe anderer Säugetiere, zum Beispiel Rinder, Hunde, Kaninchen, Alpakas, Zwergflusspferde, Faultiere und Vari-Äffchen, natürliche BDV- Infektionen mit klinischer Erkrankung vorkommen können. Das Virus kann experimentell durch intrazerebrale und intranasale Inokulation auf diverse Tierarten übertragen werden. Das Spektrum reicht vom Huhn bis zum nichthumanen Primaten (HEINIG, 1969; ROTT und BECHT, 1995). Dies weist somit auf ein deutlich breiteres Wirtsspektrum, als ursprünglich angenommen, hin.

Zum Studium der Pathogenese insbesondere der Immunpathogenese der BD wurden verschiedene Tiermodelle erfolgreich etabliert. So gelten Lewis-Ratten und verschiedene Mausstämme als geeignete Versuchstiere.

2.1.1 Experimentelle BDV-Infektion von Ratten

Bei der experimentellen Infektion von Ratten ist der Krankheitsverlauf sowohl von der verwendeten Viruspassage als auch von dem verwendeten Rattenstamm abhängig. Während adult infizierte Lewis Ratten typischerweise eine persistierende Infektion mit biphasischem neurologischen Krankheitsverlauf und begleitender nichteitrige Meningoenzephalitis entwickeln, wird bei Infektion von neonatalen immuntoleranten Ratten eine persistierende Infektion ohne auffällige klinische und neurologische Symptome und entzündlichen Veränderungen im Gehirn beobachtet. Dabei werden die klinischen Symptome bei adult- infizierten Ratten nicht auf die Virusreplikation sondern auf immunpathogenetische Prozesse mit resultierender Enzephalitis zurückgeführt (RICHT et al., 1989, 1994; STITZ et al., 1993, 2002).

2.1.1.1 Pathogenese

Das Auftreten klinischer Symptome bei adult infizierten Lewis-Ratten korreliert mit dem Erscheinen entzündlicher Veränderungen im Gehirn und wird je nach verwendeter Viruspräparation etwa um den 20. Tag post infectionem (p.i.) beobachtet. Charakteristisch ist dabei eine massive perivaskuläre, parenchymatöse und meningeale Infiltration von Makrophagen, CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, an der in späteren Stadien der Infektion auch Plasmazellen beteiligt sind (NARAYAN et al., 1983a,b; DESCHL et al., 1990; STITZ et al., 1991; HERDEN et al., 2000). Dabei erreicht die entzündliche Reaktion bei dem biphasischem Verlauf der BD ihr Maximum zwischen 30 und 40 Tagen p.i. Vorwiegend betroffene Gehirnareale sind Ammonshorn, Hypothalamus, Thalamus und Cortex cerebri, sowie zu späteren Zeitpunkten der Infektion auch Cerebellum und Medulla oblongata. Das BDV ist bei adult infizierten Lewis Ratten in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Schwann Zellen und Ependymzellen nachweisbar (NARAYAN et al., 1983b; CARBONE et al., 1989;

DESCHL et al., 1990; CARBONE et al., 1991, 1993). Bei BDV-Infektionen adulter Lewis- Ratten tritt in der späten Phase (nach ca. 42 Tage p.i.) ein Rückgang der entzündlichen Infiltration bei bestehender Astrogliose auf (NARAYAN et al., 1983a,b; HIRANO et al., 1983; DESCHL et al., 1990; GOSZTONYI und LUDWIG, 1995; HERDEN et al., 2000, 2005). Im Verlauf der BDV-Infektion können je nach verwendeter Viruspräparation bei der adult infizierten Lewis Ratte mit Aufregulierung der entzündlichen Infiltrate auch neuronale Nekrosen auftreten, die vorwiegend in frontalem und parietalem Cortex, der CA3-Region und im Gyrus dentatus des Ammonshorns zu finden sind (DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000).

Im Gegensatz dazu verläuft die experimentelle BDV-Infektion von neonatal infizierten immuninkompetenten Lewis Ratten als tolerierte, persistierende Infektion ohne auffällige entzündliche Veränderungen im ZNS. Es wurden jedoch Degenerationen der Neuronen des Gyrus dentatus und des Cerebellum (NARAYAN et al., 1983a,b; MORALES et al., 1988;

CARBONE et al., 1991; HORNIG et al., 1999; RUBIN et al., 1999; Williams et al., 2006) und eine Ausbreitung des BDV in die Peripherie mit Nachweis von infektiösem Virus auch in parenchymale Zellen beobachtet (HERZOG et al., 1984; MORALES et al., 1988).

2.1.1.2 Immunpathogenese

Die klinische Erkrankung der adult BDV-infizierten Ratte korreliert mit dem Auftreten der entzündlichen Infiltrate und wird auf virusinduzierte, immunpathologische Mechanismen zurückgeführt, wobei der Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ eine zentrale Rolle zugesprochen wird (RICHT et al., 1989, 1994; PLANZ et al., 1993; RICHT und ROTT, 2001;

STITZ et al., 2002).

Die am Entzündungsgeschehen bei adulten und immunkompetenten Ratten beteiligten Zellen bestehen aus CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, Makrophagen, B-Zellen und Plasmazellen (NARAYAN et al., 1983b; DESCHL et al., 1990). Eine Antigenspezifität für das virale Nukleoprotein konnte sowohl für CD4⁺ T-Zellen (RICHT et al., 1994; SCHMEEL et al., 1995), als auch für CD8⁺ T-Zellen (PLANZ et al., 1993, 1995; STITZ et al., 1995, 2002) gezeigt werden. In weiteren Studien wurde die Rolle der CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen für die Entstehung der klinischen Erkrankung nachgewiesen (RICHT et al., 1989, 1994; SCHMEEL et al., 1995, STITZ et al., 1995). Weiterhin soll ein direkter Zusammenhang zwischen der Schwere des Krankheitsverlaufes und der Infiltration von CD8⁺ T-Zellen ins Gehirn bestehen (FURRER et al., 2001). Eine weitere Studie konnte durch den Einsatz monoklonaler Antikörper gegen CD8⁺ T-Zellen den Einfluss dieser Zellen auf den Verlauf der Erkrankung bekräftigen. Durch Gabe dieser Antikörper kurz vor oder nach der BDV-Infektion immun- kompetenter Ratten konnte das Auftreten der Erkrankung verzögert oder die Symptome und die Enzephalitis deutlich verringert werden (RICHT et al., 1989; STITZ et al., 1992). Die Studie von NÖSKE et al. (1998) konnte ebenfalls die protektive Wirkung von BDV- spezifischen CD4⁺ T-Zellen zeigen, wenn sie vor einer BDV-Infektion appliziert werden.

Zudem fanden sich in dieser Studie Hinweise dafür, dass CD8⁺ T-Zellen über Perforin durch CD4⁺ T-Zellen aktiviert zu der Viruseliminierung führen. Ein adoptiver Transfer von BDV- spezifischen CD4⁺ T-Zellen vor einer BDV-Infektion konnte adult infizierte Ratten vor der Entwicklung klinischer Symptome und der chronischen Infektion schützen. Wurden die gleichen T-Zellen allerdings kurz nach der BDV-Infektion bei adult infizierten Tieren

übertragen, kam es zu einem vorzeitigen Einsetzen der klinischen Symptome (RICHT et al., 1994; SCHMEEL et al., 1995). Dies lässt auf eine zentrale Rolle der T-Zellen bei der Entwicklung der BD schließen.

Zu der Rolle neutralisierender Antikörper liegen verschiedene Beobachtungen vor. Unter- suchungen von STITZ et al. (1998) deuten darauf hin, dass neutralisierende Antikörper möglicherweise eine generalisierte Infektion verhindern, da nach Transfer von Serum chronisch infizierter Ratten in immunsupprimierte, BDV-infizierte Ratten das Virus nur im ZNS nachweisbar war. In anderen Studien wurden neutralisierende Antikörper nicht regelmäßig und erst zu späten Zeitpunkten nach der Infektion beobachtet (RICHT und ROTT, 2001). Eine weitere Untersuchung konnte die Beteiligung von Komplementfakoren an der Immunpathogenese zeigen, da die mRNA des C1q, einer Untereinheit des Komplementsystems der Ratte, einen parallel zum Entzündungsgeschehen verlaufenden Anstieg zeigte (DIETZSCHOLD et al., 1995).

BDV-infizierte Neuronen werden weder bei der Ratte noch bei der Maus von T-Zellen lysiert.

Eine entscheidende Rolle bei der Induktion, Auf- und Herunterregulation des entzündlichen Geschehens spielen vielmehr, unter anderem, Zytokine (SHANKAR et al., 1992; AKAIKE et al., 1995; HATALSKI et al., 1998; DIETZSCHOLD et al., 2001). Hinweise auf eine Aufregulierung von mRNA spezifisch für die proinflammatorischen Zytokine TNF, Interleukin (IL)-1α und IL-6 fanden STITZ et al. (1995) in Gehirnen BDV-infizierter Ratten.

SHANKER et al. (1992) konnten eine Korrelation zwischen der nachweisbaren mRNA spezifisch für TNF, IL-1α und IL-6 und der Stärke der Enzephalitis feststellen. Weiterhin fanden sie eine Korrelation der mRNA spezifisch für IL-2 und Interferon (INF)γ mit der nachweisbaren Menge an mRNA spezifisch für CD4⁺ bzw. CD8⁺ T-Zellen. Beide T-Zellsub- populationen waren in der akuten und chronischen Phase der Erkrankung nachweisbar.

HATALSKI et al. (1998) fanden ebenfalls in der frühen Phase der BDV-Infektion zahlreiche CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, sowie hohe mRNA-Level von IL-1α, IL-2, IL-6, TNF und IFNγ. In der chronischen Phase der Infektion waren vermehrt natürliche Killerzellen (NK)-Zellen, B-Zellen und aktivierte Mikroglia sowie hohe Mengen von IL-4 spezifischer mRNA nach- weisbar. Diese Beobachtungen sprechen für den Wechsel von einer von T-Helferzellen des Typs 1 (Th1) zu einer von T-Helferzellen des Typs 2 (Th2) abhängigen Immunantwort, die auf die Abnahme der entzündlichen Reaktion zurückzuführen sein könnte (HATALSKI et al., 1998). Zu diesem Zeitpunkt sollen zudem niedrigere Werte proinflammatorischer Zytokine wie beispielsweise TNF vorliegen (HATALSKI et al., 1998). Da jedoch auch in dieser Phase der BDV-Infektion eine anhaltende Mikrogliaaktivierung und Astrogliose zu beobachten ist,

können auch andere Zytokine wie IL-1 und TNF weiterhin eine Rolle spielen. In Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen bei Dexamethason-immunsupprimierten Ratten, ließen sich nach einer BDV-Infektion erhöhte mRNA-Level von TNF, IL-6, macrophage inflammatory protein (MIP)-1β und dem CXC Chemokin mob-1 nachweisen. Dieses wird als initiale Zytokinantwort der ZNS-residenten Zellen bewertet (MORIMOTO et al., 1996). Andere Studien konnten zeigen, dass eine Behandlung von BDV-infizierten Ratten mit transforming growth factor (TGF)-β2 zu einer Reduktion der Infiltration von CD8⁺ T-Zellen im Gehirn und der MHC II-Expression führte und die Erkrankung bei den Tieren verzögert auftrat (STITZ et al., 1991). KOPROWSKI et al. (1993) und AKAIKE et al. (1995) konnten einen möglichen Zusammenhang zwischen der Neuropathogenese und einer Veränderung der nitric oxide synthetase (NOS) Aktivität zeigen. Nach BDV-Infektion konnten verminderte Werte von NOS in Neuronen und vermehrte Werte induzierbarer NOS (iNOS) in aktivierten Makrophagen und Mikroglia gefunden werden. Weiterhin sollen Entzündungsmediatoren wie Peroxinitrite (HOOPER et al., 2001), Cyclooxygenase (RÖHRENBECK et al., 1999) und macrophage migration inhibitory factor (MIF, BACHER et al., 2002) ebenfalls an der Entstehung der entzündlichen Veränderungen im Gehirn beteiligt sein.

Ein weiterer Ansatz zu Klärung der Pathogenese der BD stellte die Untersuchung des Einflusses der BDV-Infektion auf zelluläre Signalwege dar, wie beispielsweise den nerve growth factor (NGF). In neuronalen und glialen Zellkulturen soll NGF die Replikation des BDV steigern (CARBONE et al., 1993; IBRAHIM et al., 2002). Weiterhin konnte ein positiver Einfluss von Neurotrophinen auf die BDV-Replikation in infizierten Neuronen festgestellt werden (2.4.1). Umgekehrt hemmten Inhibitoren des Ras/MEK/ERK-Signalwegs die Virusausbreitung (CARBONE et al., 1993; HANS et al., 2001; PLANZ et al., 2001;

HANS et al., 2004). Zudem konnte in der neuronalen Meerschweinchen-Zelllinie CRL gezeigt werden, dass eine Aktivierung des nukleären Faktors κB (NF-κB) auch zu einer Verringerung der Virusreplikation führte (BOURTEELE et al., 2005).

Eine weitere Möglichkeit, wie BDV in zelluläre antivirale Signalwege eingreift, wurde durch die Studie von UNTERSTAB et al. (2005) gezeigt, in der das BDV-P Protein einen inhibitorischen Einfluss auf die Traf family member-associated NF-κB activator (TANK)- binding kinase (TBK-1) hatte. TBK-1 ist die regulatorische Kinase des IFN regulatory factor 3 (IRF 3), welcher die Transkription von IFN-α und β induziert. Dadurch kann das BDV-P Protein über TBK-1 und IRF 3 die Bildung weiterer antiviraler Faktoren, hier IFN-α und β, hemmen.

2.1.2 Experimentelle BDV-Infektion von Mäusen

Im Gegensatz zu der BD bei Ratten, wo die Erkrankung ausschließlich bei adult infizierten Ratten auftritt, erkranken Mäuse nur, wenn sie neonatal infiziert werden. HALLENSLEBEN et al. (1998) konnte in neonatal mit einer mausadaptierten BDV-Präparation infizierten Mäusen eine schwere neurologische Erkrankung erzeugen. Worauf der unterschiedliche Verlauf der Erkrankung bei neonatal und adult infizierten Mäusen und Ratten beruht, ist bislang nicht bekannt (HALLENSLEBEN et al., 1998; BRAYTON et al., 2001).

Durch den Einsatz transgener Mäuse ist es heutzutage möglich, die Mechanismen der Immunpathogenese, insbesondere den Effekt einzelner Zytokine und Entzündungsmediatoren im Verlauf der BDV-Infektion zu analysieren.

2.1.2.1 Pathogenese

Empfängliche Mäuse, die mit einem mausadaptierten BDV-Stamm neonatal infiziert werden, entwickeln nach vier bis sechs Wochen erste neurologische Symptome, ähnlich denen der akut erkrankten Ratten. Sie zeigen stumpfes Fell, Kopfschiefhaltung, Kümmern und verlieren etwa 20% an Körpergewicht innerhalb von vier Tagen (HALLENSLEBEN et al., 1998).

Werden dagegen adulte Mäuse mit BDV infiziert, verhalten sie sich klinisch unauffällig und zeigen histologisch nur minimale entzündliche Veränderungen im Gehirn (KAO et al., 1984;

RUBIN et al., 1993). Histologisch zeigen die neonatal infizierten Mäuse eine mononukleäre, perivaskuläre, parenchymatöse und meningeale Infiltration im Gehirn. Vor allem in Cortex cerebri und Ammonshorn wird eine massive Infiltration von vorwiegend T-Zellen beobachtet.

Cerebellum und Thalamus wiesen meist geringer ausgeprägte entzündliche Infiltrate auf (HALLENSLEBEN et al., 1998; FREUDE et al., 2002).

BDV-spezifische RNA kann ab dem 20. Tag p.i regelmäßig im Gehirn nachgewiesen werden.

Die Menge an viraler RNA erreicht um 28 Tage p.i. ihr Maximum (HALLENSLEBEN et al., 1998). Trotz ähnlicher Ausbreitung des BDV im Gehirn variiert die Inzidenz und Schwere der Erkrankung bei neonatal infizierten Mäuse zwischen den verschiedenen Mausstämmen (HALLENSLEBEN et al., 1998). Besonders deutliche Krankheitszeichen und eine deutliche Empfänglichkeit für die BDV-Infektion fand sich bei MRL-Mäusen, während C57BL/6- und SJL-Mäuse klinisch nur eine dezente Symptomatik zeigten und nur wenige Tiere erkrankten.

(RUBIN et al., 1993; HALLENSLEBEN et al., 1998). In Abhängigkeit vom Mausstamm und der BDV-Präparation beträgt die Mortalität, ähnlich der Ratte, bis zu 100%.

2.1.2.2 Immunpathogenese

Wie schon von der Ratte bekannt, weisen auch die Mäuse eine positive Korrelation zwischen der Ausprägung der klinischen Symptome und der Stärke der Entzündungsreaktion auf und es konnte gezeigt werden, dass ebenfalls nicht das Virus, sondern die infiltrierenden Entzündungszellen über eine Hypersensibilitätsreaktion vom Typ IV die Entstehung der BD auslösen (HALLENSLEBEN et al., 1998). Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Schwere der Erkrankung an das MHC I-Allel gekoppelt ist, da alle Mausstämme, die schwere klinische Symptome entwickelten, dem H-2^k Haplotyp angehören (HALLENSLEBEN et al., 1998). Ursächlich wurde dieser Unterschied auf die Erkennung eines spezifischen T- Zellepitops (TELEISSI) des BDV-Nukleoproteins, zurückgeführt, welcher von den meisten infiltrierenden zytotoxischen CD8⁺ T-Zellen in Mäusen des H-2^k Haplotyps erkannt wurde (SCHAMEL et al., 2001). Beobachtungen, dass eine periphere Immunisierung mit dendritischen Zellen, die mit dem TELEISSI-Epitop ummantelt waren, die immunologische Toleranz einer persistierenden BDV-Infektion des ZNS beendeten und die Tiere schwere neurologische Symptome entwickelten, unterstützten die zentrale Rolle des TELEISSI- Epitops bei der Entwicklung der BD (FASSNACHT et al., 2004). In einer weiteren Studie konnte jedoch gezeigt werden, dass eine transgene Expression des BDV-N in Neuronen oder Astrozyten bei Mäusen mit einem B10.BR-Hintergrund per se zu keiner Erkrankung oder Verhaltensänderungen führte (RAUER et al., 2004). Allerdings verhinderte die neuronale BDV-N-Expression eine Infektion der transgenen Neuronen, dagegen hatte die transgene Expression des BDV-N in Astrozyten keinen Einfluss auf die Virusausbreitung. Weiterhin war die CD8⁺ T-Zell-vermittelte Immunantwort gegen das BDV-N durch die transgene Expression des BDV-N in Neuronen und Astrozyten beeinträchtigt (RAUER et al., 2004). Bei experimentell BDV-infizierten MRL-Mäusen waren sowohl aktivierte CD4⁺ T-Zellen, als auch aktivierte CD8⁺ T-Zellen im Gehirn nachweisbar, wobei die CD8⁺ T-Zellen vor allem eine Antigenspezifität für das BDV-N zeigten (HAUSMANN et al., 1999, PLANZ und STITZ, 1999). Mittels Untersuchungen an neonatal intra cerebral (i.c.) infizierten, CD8⁺ T- Zell-defizienten Mäusen zweier verschiedener Mausstämme (MRL und C57Bl/6) konnte nachgewiesen werden, dass die neurologischen Symptome der BDV-Infektion vorwiegend auf einen CD8⁺ T-Zell-vermittelten Prozess zurückzuführen waren (HALLENSLEBEN et al., 1998; HAUSMANN et al., 2005a). Einen Einfluss des Perforins auf die Kinetik der Virusausbreitung oder die Ausprägung der Krankheitssymptome nach BDV-Infektion konnte jedoch anhand von perforindefizienten Mäusen nicht gefunden werden (HAUSMANN et al.

2001). BDV-N spezifische CD8⁺ T-Zellen konnten interessanterweise auch in persistierend

BDV-infizierten Mäusen nachgewiesen werden. Allerdings zeigten diese T-Zellen eine verminderte funktionale Avidität (ENGELHARDT et al., 2005).

BDV-infizierte Neuronen werden, wie schon von der Ratte bekannt (NARAYAN et al., 1983;

RICHT et al., 1989; DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000), auch bei der Maus nicht von T-Zellen lysiert (HAUSMANN et al., 2001), obgleich im Gegensatz zur Ratte die CD8+

T-Zellen die Haupteffektorzellen bei der BD der Maus sein sollen. Vielmehr scheinen bei der Entstehung der entzündlichen Veränderungen im Gehirn auch bei der Maus proinflammatorische Zytokine und andere Entzündungsmediatoren eine wichtige Rolle zu spielen. In der Studie von SAUDER et al. (2000) konnte eine starke Aufregulierung von TNF in Gehirnen BDV-infizierter Mäuse (MRL und AGR) beobachtet werden. Zudem wird IL-12 eine wichtige Rolle bei der Immunpathogenese der BD zugesprochen, da die Überexpression von IL-12 in Mäusen mit einem BDV-resistenten genetischen Hintergrund (C57Bl/6 x SJL) eine klinisch manifeste Erkrankung zu induzieren vermochte (FREUDE et al., 2002).

Allerdings wurde dieser Effekt vermutlich über die Induktion von IFNγ vermittelt, wobei IFNγ alleine keine Erkrankung auslösen konnte; erst die Anwesenheit von IFNγ- sezernierenden Lymphozyten führte zu klinischen Symptomen (HOFER et al., 2004). Anhand von slide culture-Untersuchungen wurde der Effekt von IFNγ auf die BDV-Infektion unabhängig von Lymphozyten betrachtet. Dabei zeigte sich, dass IFNγ zwar noch nicht infizierte Zellen in BDV-infizierten Kulturen des Ammonshorns und des Cerebellum vor der Infektion schützen konnte, jedoch nicht in der Lage war, in den bereits BDV-infizierten slide- Zellkulturen das Virus zu eliminieren (FRIEDL et al., 2004). Eine mögliche neuroprotektive Wirkung des IFNγ konnte aufgrund zweier Studien angenommen werden. So entwickelten IFNγ-defiziente Mäuse (MRL und BALB/c), auch wenn sie adult infiziert wurden, neurologische Symptome, wohingegen adult infizierte Tiere des jeweiligen Wildtyps (wt) keine Symptome einer BD zeigten (HAUSMANN et al., 2005a). Bei IFNγ-defizienten Mäusen konnten zudem eine leicht erhöhte Inzidenz und Schwere der Erkrankung im Vergleich zu wt-Kontrolltieren festgestellt werden (HAUSMANN et al., 2004).

Der Gebrauch von knock out-Mäusen mit MRL-Hintergrund, denen die Gene für Fas/FasL, Chemokinrezeptor CXCR3 bzw. induzierbare NOS ausgeschaltet wurden, zeigte keinen Einfluss auf den Krankheitsverlauf nach BDV-Infektion. Ebenso wenig konnte eine CXCL10- Expression (T-Zell anlockendes Chemokin) in Astrozyten den Krankheitsverlauf in MRL- Mäusen beeinflussen. In allen diesen Modellen zeigte die disseminierte Virusausbreitung keine Unterschiede zwischen transgenen und wt-Mäusen (HAUSMANN et al., 2004).

Zusammenfassend konnten die bisher durchgeführten Untersuchungen anhand von genetisch veränderten Mäusen für IL-12 und IFNγ eine direkte oder indirekte Beteiligung an der Immunpathogenese der BDV zeigen. Zahlreiche andere Faktoren (Fas/FasL, CXCR3, NO- Synthetase) scheinen allerdings keine Rolle bei der Verhinderung der Virusausbreitung zu spielen. Über die Rolle des TNF bei der Immunpathogenese der BDV-Infektion liegen bisher noch keine detaillierten Untersuchungen zur vor.

2.2 Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF)

2.2.1 TNF und TNF- vermittelte Signalwege

TNF ist als pleiotrophes Zytokin Mitglied einer großen Familie von Proteinen. Es ist in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse involviert und wird als Prototyp proinflammatorischer Moleküle angesehen. Durch Zellmembranbestandteile gramnegativer Bakterien (LPS) wird TNF in Makrophagen gebildet und spielt als Hauptmediator der akuten Entzündungsreaktion eine zentrale Rolle in der bakteriellen, als auch viralen und parasitären Abwehr (ABBAS et al., 2005). Seine Funktion reicht zudem von der Regulation der Lymphozytenproliferation bis hin zur Induktion der Apoptose (VASSALLI, 1992; WARE et al., 1995). TNF wird intrazellulär als 26kDa großes Typ II transmembranes Glykoprotein synthetisiert, welches eine Länge von 235 Aminosäuren (AS) aufweist und sich zu nicht- kovalent gebundenen Homotrimeren zusammenlagert (PENNICA et al., 1984; FRANSEN et al., 1985; KRIEGLER et al., 1988). Die transmembrane Form beinhaltet eine 35 AS große zytoplasmatische Domäne, ein 21 AS großes in der Zellmembran liegendes Segment und eine 179 AS extrazelluläre Region (PENNICA et al., 1984). Nach Spaltung am C-terminalen Ende des Transmembransegmentes durch eine membran-assoziierte Metalloproteinase entsteht ein 17 kDa schweres Polypeptid (MOSS et al., 1997; LOCKSLEY et al., 2001). Drei dieser Polypeptide lagern sich zusammen und bilden das lösliche TNF (51 kDa). Sowohl die membrangebundene als auch die lösliche Form des TNF können an die spezifischen TNF- Rezeptoren binden. Das murine TNF weist eine 80%ige Homologie zum humanen und eine 95%ige Homologie zum TNF der Ratten auf (PENNICA et al., 1984; MARMENOUT et al., 1985; KWON et al., 1993). Zudem zeigen das murine und das humane TNF eine signifikante kreuzreaktive Bioaktivität (PENNICA et al., 1984).

Innerhalb des ZNS kann TNF von aktivierten Makrophagen und Mikroglia, Astrozyten und einigen Neuronen, sowie unter pathologischen Bedingungen von infiltrierenden Lymphozyten

und Makrophagen exprimiert werden (CHENSUE et al., 1988; LEE et al., 1993; HOPKINS et al., 1995; TCHELINGERIAN et al., 1996; MEDANA et al., 1997).

Bisher sind zwei verschiedene TNF-Rezeptoren (TNFR) beschrieben. Der TNFR1 oder auch TNF receptor superfamily member 1A (TNFRSF1A, D120a, p55/60) ist der Prototyp der TNF-Rezeptor-Superfamilie, die die unterschiedlichsten Rezeptoren, unter anderem den nerve growth factor receptor/p75 und Fas und Trail Rezeptoren, beinhaltet (LOTZ et al., 1996). Die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie sind Typ 1 transmembrane Glykoproteine, welche durch multiple Wiederholungen von konservierten zysteinreichen Motiven in ihrer ligandbindenen extrazellulären Domaine charakterisiert sind. TNFR1 ist ein 55-60 kDa großes, 425 AS langes Glykoprotein, welches eine 219 AS große zytoplasmatische Domaine, ein 23 AS großes, in der Zellmembran liegendes Segment und eine 183 AS lange extrazelluläre Region besitzt. Der TNFR1 kann zudem als 27-30 kDA schwere lösliche Form (sTNFR1) vorliegen, welche durch proteolytische Ablösung von der Zellmembran entsteht (NOPHAR et al., 1990). TNFR1 wird konstitutiv in fast allen Zellen und Gewebetypen exprimiert. Die Bindung von TNF an TNFR1 triggert zahlreiche intrazelluläre Reaktionen, die einerseits über die Aktivierung der zwei Haupttranskriptionsfaktoren (NF-κB, c-Jun) die Transkription proinflammatorischer und immunmodulierender Gene induzieren können (Abb.

1). Über die Caspase-8-Kaskade kann andererseits die Apoptose ausgelöst werden (Abb. 1;

KUMAR et al., 2004; HERBEIN und O’BRIEN, 2000; CHEN und GOEDDEL, 2002). In Neuronen finden sich die gleichen grundlegenden Apoptoseprogramme wie in anderen Zellen, die verschiedenen Typen von Neuronen zeigen lediglich unterschiedliche Kombinationen von Bcl-2 und Enzymen der Caspasekaskade (YUAN und YANKNER, 2000). Nach Bindung des TNF an den TNFR1 beginnt die Apoptose mit der Ablösung des inhibitorischen Proteins silencer of death domain (SODD) von der inneren Membranseite der Zielzelle. Nachfolgend können sich Adapterproteine wie TNF receptor-associated death domain (TRADD), TNF-R-associated factor 2 (TRAF2), receptor-interacting protein (RIP) und Fas-associated death domain (FADD) anlagern. Die Bindung weiterer Schlüsselenzyme wie Caspase-8 an die Adapterproteine (BAUD und KARIN, 2001) führt im weiteren Verlauf zur Aktivierung von Caspase-3, wodurch die Fragmentierung der DNA und Apoptose initiiert wird (HERBEIN und O´BRIEN, 2000). Eine über den TNFR1 vermittelte antiapoptotische Signalkaskade verläuft via Proteinkinase RIP und TRAF2, die Schlüsselrollen bei der Aktivierung des NF-κB besitzen sollen (KELLIHER et al., 1998; HERBEIN und O´BRIEN, 2000). Durch Phosphorilierung der Inhibitorproteine IκB wird NF-κB im Zytoplasma aktiviert

und gelangt in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor die Expression diverser Gene steuern kann.

Der TNFR2 oder auch TNF receptor superfamily member 1B (TNFRSF1B, CD120b, p75/80) ist ein 75-80 kDa großes, 452 AS langes Membranprotein. Es besteht aus einem 188 AS großen zytoplasmatischen Segment, einer 29 AS langen in der Zellmembran gelegenen Region und einem 235 AS großen extrazellulären Anteil (LEWIS et al., 1991). Auch vom TNFR2 ist eine lösliche Form bekannt (sTNFR2). Im Gegensatz zum TNFR1 besitzt TNFR2 keine death domain. Allerdings ist TNF in der Lage über den TNFR2, direkt TRAF2 und damit NF-κB zu aktivieren (Abb. 1). Eine weitere über den TNFR2 stimulierte Signalkaskade, an deren Ende NF-κB steht, verläuft über die Phosphatidylinositol (PI)3-Kinase. Die PI3- Kinase stellt ein wichtiges Überlebenssignal der Zelle dar (CANTLEY, 2002). Sie sorgt über die Serin/Threoninkinase (Akt, Proteinkinase B) für die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB (ROMASHKOVA und MAKAROV, 1999).

Im Gegensatz dazu soll die Aktivierung der PI3-Kinase über den TNFR1 als silencer of survival signals verhindert werden, dieses wird wahrscheinlich über die Hemmung des wichtigen Überlebenssignals insulin growth factor (IGF)-1 vermittelt. (VENTERS et al., 2000). TNF kann somit gleichzeitig zelluläre Überlebens- und Todessignalkaskaden einleiten.

Das Verhältnis der Aktivierung dieser Wege, insbesondere die Aktivierung von NF-κB, entscheidet zwischen Überleben und Untergang/Apoptose der Zelle. Bezogen auf das neuronale Gewebe wirkt TNF neurotoxisch, wenn die NF-κB Aktivität unterdrückt wird (BOTCHKINA et al., 1999; FRIDMACHER et al., 2003) bzw. neuroprotektiv (FONTAINE et al., 2002; VENTERS et al., 2001) über die Aktivierung von NF-κB. Es scheint, dass die Übermittlung neuroprotektiver Signale über den TNFR2 und die Aktivierung von Akt vermittelt werden können (FONTAINE et al., 2002). Beide TNFR sind in der Lage, NF-κB zu aktivieren und damit die Zelle vor der Apoptose zu schützen, dabei kommt es über den TNFR2 zu einer länger andauernden Aktivierung von NF-κB als über den TNFR1 (MARCHETTI et al., 2004).

Ein Vergleich der Bindungsfähigkeit des TNF zu seinen Rezeptoren ergab, dass TNF an den TNFR1 mit einer höheren Affinität als an den TNFR2 bindet (YANG et al., 2002; ABBAS et al., 2005). Allerdings stellt die membranständige Form des TNF den Hauptaktivator des TNFR2 dar (GRELL et al., 1995). Die jeweilige lösliche Form des TNFR1 und TNFR2 ist ebenfalls in der Lage TNF zu binden. Dabei haben sie in hohen Konzentration einen inhibitorischen Effekt auf die TNF Aktivität (LOETSCHER et al., 1991), während sie in

geringen Konzentrationen die biologische Halbwertszeit der TNF Aktivität erhöhen (ADERKA et al., 1992).

Abb. 1: TNF-vermittelte Signalwege

a) TNFR1-vermittelte Apoptose via TRADD, FADD and Caspase8

b) TNFR1-vermittelter, antiapoptotischer Übertragungsweg via TRAF2 oder RIP c) TNFR1 Wirkung als silencer of survival signals über Inhibitierung der PI3-kinase d) TNFR2-vermittelter, antiapoptotischer Übertragungsweg via TRAF2 and NF-κB und

vermuteter antiapoptotischer Effekt via PI3-Kinase und Phospho-Akt-Aktivierung

2.2.2 Funktionen des TNF und seiner Rezeptoren im ZNS

Im ZNS sind Mikroglia, Astrozyten und einige Neuronen sowie eingewanderte Lymphozyten und Makrophagen in der Lage, TNF zu produzieren (LEE et al., 1993; HOPKINS et al., 1995). TNF wiederum induziert die Proliferation von Astrozyten (SELMAJ et al., 1990).

Rezeptoren für TNF finden sich auf Mikroglia, Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten, sowie Endothelzellen (DOPP et al., 1997). Bei Mäusen konnte eine konstitutive TNF- Expression in Neuronen, Glia und Mikroglia-ähnlichen Zellen im Gehirn nachgewiesen

werden, welche durch extrinsische und intrinsische Faktoren beeinflusst wurde (GAHRING et al., 1996). Eine hohe konstitutive Expression des TNFR1 wurde in vielen Neuronen im Hirnstamm, Kerngebieten motorischer Neuronen und Neuronen in den sensorischen Endkernen des Trigeminus beobachtet, während eine TNFR2-Expression nur in Endothelzellen und in einzelnen Mikroglia-ähnlichen Zellen gezeigt werden konnte (DOPP et al., 1997; BETTE et al., 2003).

Eine Überproduktion von TNF wird im ZNS bei einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet. Eine Übersicht über die vielfältigen neurotoxischen und neuroprotektiven Effekte einer verstärkten TNF-Synthese am Beispiel einer HIV-Infektion des ZNS gibt Abb. 2. Deutlich erhöhte Werte von TNF und anderen proinflammatorischen Zytokinen werden bei dem AIDS-Dementia-Komplex, Schlaganfall, Trauma, bei cerebraler Malaria, Multipler Sklerose (MS) und Alzheimer-Krankheit beobachtet (TYOR et al., 1992;

MINAGAR et al., 2002; NELSON et al., 2002; WILLIAMS und HICHKEY, 2002). In akuten MS Läsionen konnte eine Aufregulation sowohl von TNF als auch von seinen beiden Rezeptoren gezeigt werden und die Menge des TNF in der Zerebrospinalflüssigkeit korreliert hierbei mit der Schwere der Erkrankung (HOFMAN et al., 1989; SELMAJ et al., 1991;

SHARIEF and HENTGES, 1991; RAINE et al., 1998). Wichtig für die Rolle des TNF im Zuge von Demyelinisierungsprozessen ist, dass TNFR1 und TNFR2 selektiv auf Oligodendrozyten am Rand von akuten MS exprimiert wird und TNF in der Lage ist Apoptose in Oligodendrozyten einzuleiten (D´SOUZA et al., 1995; SELMAJ and RAINE, 1998). Zudem führte die transgene TNF-Überexpression in Mausmodellen im ZNS auch zu progressiven neurodegenerativen Erkrankungen (PROBERT et al., 1995; AKASSOGLOU et al., 1997; TAUPIN et al., 1997). Bei zwei verschiedenen Mausmodellen entwickelten sich dabei spontane Apopotosen der Oligodendrozyten, Vakuolisierungen des Myelins und eine primäre Demyelinisierung, welche unter der Anwesenheit einer großen Anzahl von T- Lymphozyten fortschritt und phagozytierende Makrophagen anlockte (AKASSOGLOU et al., 1998). In einem Mausmodell (Tg6074) wurde eine hohe TNF-Überexpression unter der Kontrolle des endogenen TNF-Promoters durch den zufälligen Einbau des Genkonstruktes in das Genom induziert (PROBERT et al., 1995; AKASSOGLOU et al., 1998). Im anderen Mausmodell (TgK21) wurde eine spezifische, nur in Astrozyten transmembran vorkommende, Expression des human TNF unter der Kontrolle des sauren Gliafaser-Protein (GFAP) Promoters erzeugt (AKASSOGLOU et al., 1997). Eine wichtige Rolle der Signalübertragung über den TNFR1 bei der Entstehung der Entzündung und Demyelinisierung in diesen beiden Modellen konnte durch Rückkreuzung in einen TNFR1-

bzw. in einen TNFR2-knockout-Hintergrund gezeigt werden. Dabei kam es bei der Rückkreuzung in einen TNFR1-knockout-Hintergrund zu einer kompletten Unterdrückung der entzündlichen und demyelinisierenden Erscheinungen, während die Rückkreuzung in den TNFR2-knockout-Hintergrund keine Wirkung auf die Veränderungen im Gehirn hatte (AKASSOGLOU et al., 1998). Im Gegensatz dazu wurde für TNF auch eine Rolle bei der

yten exprimiertes transmembranes TNF nur über den Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen und der Remyelinisierung gefunden, wobei dieser Effekt vorrangig über den TNFR2 übermittelt zu werden scheint (ARNETT et al., 2001).

Der neurotoxische Effekt des TNF kann über zahlreiche Mechanismen vollführt werden. Eine Möglichkeit liegt darin, dass TNF an den Endothelzellen des Gehirns die Expression des vascular adhesion molecule (VCAM)-1, an das aktivierte T- Zellen binden, bevor sie in das ZNS einwandern können, erhöht und somit den Influx von Immunzellen ermöglicht (LIEBERT, 2001; NOTTET, 2005). Bei der Aktivierung der Endothelzellen wird vor allem dem TNFR2 bei der Signalübertragung eine wichtige Rolle beigemessen. Dieses liegt zum einen darin begründet, dass der TNFR2 immunhistologisch vorrangig in Endothelzellen gefunden wurde (DOPP et al., 1998). In einem weiteren Versuch kam es in einem transgenen Mausmodell, in dem von Astroz

überexprimierten membrangebundenen TNFR2 eine Signalkaskade auslösen konnte, zu Vaskulopathien, die durch Fibrose und zu späteren Zeitpunkten durch entzündliche Reaktionen und ischämischen Prozessen charakterisiert waren (PROBERT und AKASSOGLOU, 2001).

Ein weiterer neurotoxischer Effekt des TNF ergibt sich dadurch, dass TNF die Glutamat- Aufnahme der Astrozyten inhibiert und über einen erhöhten extrazellulären Glutamatspiegel neurotoxisch wirkt (FINE et al., 1996). Ein weiterer Weg, auf dem TNF neurodegenerativ wirken kann, verläuft über die Aktivierung von Astrozyten, Makrophagen und Mikroglia. In Astrozyten wird beispielsweise über die Aktivierung des NF-κB die Synthese von proinflammatorischen Zytokinen angeregt (HAN et al., 2001). In einer Studie mit fetalen humanen Astrozyten wurde zudem eine konstitutive Expression des TNFR1 gefunden, wohingegen die Expression des TNFR2 erst durch die Zugabe von TNF induziert wurde (CHOI et al., 2005). In einer weiteren Studie konnte die Induktion von TNFR2 nach Gabe von TNF in primären Astrozytenkulturen von Ratten gezeigt werden (LUNG et al., 2001). In fetalen humanen mikroglialen Zellen wurde nach Zugabe von TNF eine Produktion von IL-1β nachgewiesen (LEE et al., 1993).

Neben diesen schon lange bekannten neurotoxischen Effekten von TNF, konnte in jüngeren Studien ebenfalls ein neuroprotektiver Effekt des TNF im ZNS nachgewiesen werden. So konnte CHENG et al. (1994) in Gehirnzellkulturen von embryonalen Ratten eine TNF- abhängige Stabilisierung der Ca²⁺-Homöostase nachweisen, welche der Ca²⁺-abhängigen Neurotoxizität entgegenwirkt. Eine Vorbehandlung mit TNF schützte neuronale Zellkulturen auch vor NMDA-induzierter Exzitotoxizität (HOUZEN et al., 1997). Diesen Beobachtungen konnten in vivo bestätigt werden. Bei TNF-transgenen Mäusen mit neuronaler TNF- Überexpression konnte ein deutlicher Schutz der Neuronen gegen Glutamat-induzierte Neurotoxizität in Abhängigkeit der TNF-Spiegel nachgewiesen werden (MARCHETTI et al., 2004). Nach intrazerebraler Mikroinjektion von TNF in SJL- und BALB-Mäuse waren erhöhte Werte der proinflammatorischen Mediatoren RANTES, MIP-1α und MIP-1β nachweisbar, interessanterweise wurde nach dieser lokalen TNF-Applikation jedoch keine Infiltration von Lymphozyten ins Gehirn beobachtet (GLABINSKI et al., 2003), so dass anscheinend TNF allein nicht ausreichend ist, eine Infiltration von Entzündungszellen in das Gehirn zu erreichen. TNFR-knockout-Mäuse, denen beide TNF-Rezeptoren fehlten, zeigten nach zerebraler Ischämie und Kainic-Säure-induzierten Verletzungen vermehrt oxidativen Stress und reduzierte Mengen an antioxidativen Enzymen im Vergleich zu Kontrolltieren, welches auf die fehlende neuroprotektive Wirkung des TNF zurückzuführen ist. Weiterhin war bei diesen TNFR-knockout-Mäusen die Mikrogliaaktivierung reduziert, was die Bedeutung des TNF für die Immunreaktion unterstreicht (BRUCE et al., 1996).

Abb. 2: Überblick über die neuroprotektiven und neurodegenerativen Eigenschaften des TNF am Beispiel der HIV-Infektion

Grüne Pfeile: Neuroprotektive Effekte, rote Pfeile: neurodegenerative Effekte, orange Pfeile: neuroprotektive und -degenerative Effekte, nach BRABERS und NOTTET (2006)

2.2.3 TNF-transgene Mausmodelle

Zur Untersuchung einer TNF-Überexpression im Gehirn sind bereits einige TNF-transgene Mausmodelle etabliert (siehe Tab. 1). In diesen TNF-transgenen Mäusen wird TNF über Promotoren der Gene für myelin basic protein (MBP), glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Neurofilament (NF) sowie über den endogenen TNF-Promotor exprimiert und führt bei einigen Mauslinien schon im Alter von weniger als zwei Monaten, bei anderen nach etwa einem Jahr zum Auftreten spontaner pathologischer Veränderungen (PROBERT et al., 1997;

TAUPIN et al., 1997; AKASSOGLOU et al., 1998).

Bei einer Überexpression des TNF unter dem GFAP-Promotor (TgK21), das zu einer spezifischen nur in Astrozyten transmembran vorkommenden Expression des humanen TNF führte, wurde eine Demyelisierung, sowie zusätzlich Mikroglia- und Makrophagenaktivierung beschrieben (PROBERT et al., 1997). Die Expression des TNF unter dem endogenen TNF- Rezeptor bewirkte ebenfalls eine Demyelinisierung und Immunzellinfiltration (AKASSOGLOU et al., 1998). Eine wichtige Rolle der Signalübertragung über den TNFR1 bei der Entstehung der Entzündung und Demyelinisierung in diesen beiden Modellen konnte durch Rückkreuzung in einen TNFR1- bzw. in einen TNFR2-knockout-Hintergrund gezeigt werden. Dabei kam es bei der Rückkreuzung in einen TNFR1-knockout-Hintergrund zu einer kompletten Unterdrückung der entzündlichen und demyelinisierenden Erscheinungen, während die Rückkreuzung in den TNFR2-knockout-Hintergrund keine Wirkung auf die Veränderungen im Gehirn bewirkte (AKASSOGLOU et al., 1998).

Bei einer neuronalen Expression des löslichen (TgK742) bzw. des membranständigen (TgK3, 11, 14) TNF unter dem NF-Promotor waren keine spontanen Veränderungen zu beobachten, obgleich die Menge des exprimierten TNF denen bei dem TgK21 TNF-transgenen Modell entsprach oder sogar überschritt (AKASSOGLOU et al., 1997, 1999). Dieses verdeutlicht, dass nicht nur die Menge des TNF sondern auch der Expressionsort für die jeweilige Wirkung des TNF wichtig ist.

In den Mäusen, die das TNF über MBP exprimieren, konnten in einer Linie spontane Demyelinisierungen beobachtet werden. Zwei andere Linien zeigten keine spontane Pathologie, erwiesen sich jedoch empfänglicher für die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE; TAUPIN et al., 1997; OWENS et al., 2001).

Die in der vorliegenden Studie eingesetzten TNF-transgenen Mäuse exprimieren das TNF unter der Kontrolle des Promotors eines speziellen Glutamatrezeptorsubtyps, genannt NR2B, der bei der Maus auch als ε2 bezeichnet wird. Diese führt zu einer neuronalen Expression des TNF als auch dessen lösliche Form. Sie zeigen keine spontanen entzündlichen oder

degenerativen Veränderungen im ZNS, lediglich eine Mikrogliaaktivierung konnte in den Gehirngebieten mit der höchsten TNF-Expression beobachtet werden (MARCHETTI et al., 2004).

Tab. 1: Übersicht über TNF-transgene Mausmodelle TNF-Genexpression

(Name der transgenen

Linie) Zelluläre Quelle der

transgenen Expression TNF-Rezeptor Status resultierende Pathologie

Normal

Apoptose von Oligodendrozyten,

Entzündung, Demyelinisierungen: Modell

für chronische MS

TNFR1-/- Keine Überexpression von

murinem TNF (Tg6074) Gliale Vorläuferzellen ab der ersten postnatalen Woche

TNFR2-/- Wie Tg6074 oben

Normal

Apoptose von Oligodendrozyten,

Entzündung, Demyelinisierungen: Modell

für akute MS

TNFR1-/- Keine TNFR2-/- Wie TgK21 oben

Transmembrane Überexpression von

humanem TNF (TgK21)

Astrozyten

Überexpression des humanen TNFR2 mit

korrekt regulierter

Expression/TNFR1-/- Vaskuläre Entzündung und Ischämie

Transmembrane Überexpression von

humanem TNF (TgK3, 11,14)

Neuronen Normal Keine

TNF-/- Keine TNF-Genexpression Normal Verzögerte Einleitung MBP- induzierter EAE, normale T-

Zellantwort

TNF: Tumor-Nekrose-Faktor α, TNFR1-/-: TNF-Rezeptor 1 knockout, TNFR2-/-: TNF-Rezeptor 2 knockout, MS: Multiple Sklerose, EAE: Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis, MBP: myelin basic protein, nach PROBERT und AKASSOGLOU (2001)

2.3 Expression weiterer Zytokine im Gehirn

Während IL-2 im Gehirn bisher in eingewanderten Immunzellen und Astrozyten nachgewiesen werden konnten (HOFMAN et al., 1986; RAINE et al., 1994; BROSNAN et al., 1995; SIERRA et al., 1997), wurde die Produktion von IFNγ, IL-10 und TGFβ1 in Lymphozyten, Astrozyten und Mikroglia gezeigt (NAGANO et al., 1994; BROSNAN et al., 1995). Darüber hinaus wurde eine Bildung von IL-1, IL-6 und IL-12 auch in Neuronen

gefunden (BROSNAN et al., 1995; WOODROOFE, 1995; SIERRA et al., 1997; LI et al., 2000).

2.3.1 Proinflammatorische Zytokine

Interleukin-1 wird als der Prototyp der proinflammatorischen Zytokine angesehen. Es gibt zwei unterschiedliche Formen des IL-1, das IL-1α und das IL-1β, von denen angenommen wird, dass sie die gleichen Wirkungen zeigen. Sie binden beiden an den IL-1 Rezeptor (IL- 1RI; SIMS et al., 1988), dass eine Signaltransduktion einleitet, wohingegen die Bindung an den IL1RII zu keiner Signalübertragung führt (SIMS et al., 1993). Sowohl IL-1α als auch IL- 1β werden als Vorläuferproteine produziert, von denen aber die Vorläuferform von IL-1α bereits eine biologische Aktivität zeigt. Die Vorläuferform des IL-1β ist inaktiv und muss erst durch eine Protease (Caspase 1) umgesetzt werden (THORNBERRY et al., 1992).

Beide IL-1 können von Gehirnzellen exprimiert werden. Allerdings sind die Mengen im normalen Gehirn gering (VITKOVIC et al., 2000). Mikroglia, die ebenfalls Caspase 1 produzieren, scheinen die primäre Quelle von IL-1 in frühen Prozessen nach Traumatisierung des Gehirn zu sein (DAVIES et al., 1999; TOUZANI et al., 1999). In der Zellkultur konnte durch Zugabe von TNF zu humanen fetalen mikroglialen Zellen eine Produktion des IL-1 induziert werden (LEE et al., 1993). Astrozyten, die ebenfalls in der Lage sind IL-1 zu produzieren, exprimieren dieses Interleukin im Laufe eines zerebralen Traumas etwas später (DAVIES et al., 1999; PEARSON et al., 1999). Eine Expression von IL-1 wurde auch in Oligodendrozyten, Neuronen und zirkulierenen Immunzellen beobachtet (BLASI et al., 1999;

PEARSON et al., 1999; VITKOVIC et al., 2000).

Eine Beteiligung des IL-1 bei neurodegenerativen Prozessen wird deshalb angenommen, da die Expression des IL-1 bei Nagern nach ischämischen, hypoxischen, exzitatorischen und traumatischen Bedingung im Gehirn drastisch ansteigt (ROTHWELL et al., 1997). Eine direkte Injektion des IL-1 ins Gehirn allein führte bei Nagern zwar nicht zu neurodegenerativen Vorgängen, in Kombination mit ischämischen, exitatorischen und traumatischen Bedingungen kam es aber zu stärkeren Läsionen. Im Gegensatz dazu verursachte die Inhibition des IL-1 nach cerebraler Ischämie, mechanischen Läsionen oder Zuführungen von Exzitatoren dramatisch verringerte neuronale Zelluntergänge (ROTHWELL et al., 1997; TOUZANI et al., 1999).

Die Rolle des IL-1 im Verlauf von demyelinisierenden und entzündlichen Prozessen im Gehirn ist allerdings noch nicht bis ins Detail geklärt. So scheint IL-1 auch bei der

Entwicklung des ZNS eine Rolle zu spielen (MEHLER et al., 1997) und IL-1 inhibiert in primären neuronalen Zellen den Zelltod (ROTHWELL et al., 1995; STRIJBOS et al., 1995) Interleukin-2 ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokine, welches direkt Wachstum und Differenzierung hautpsächlich von T-Zellen, aber auch B-Zellen, natürlichen Killerzellen, Monozyten, Makrophagen und Oligodendrozyten, fördert. Zusätzlich zur wachstumfördernden Eigenschaft, kann IL-2 auch T-Zellen zur Produktion von weiteren Zytokinen, insbesondere IFNγ und IL-4 anregen (FARRAR et al., 1982; HOWARD et al., 1983). Die Ausschaltung von autoreaktiven T-Zellen mittels Behandlung mit IL-2 führte zur Unterdrückung der EAE (CRITCHFIELD et al., 1994). Die Überexpression des humanen IL- 2 unter der Kontrolle des Metallothioninpromoters führte in der Maus zu Ataxien aufgrund von lymphozytären Infiltration ins Kleinhirn (PETITTO et al., 1999).

Dem proinflammatorischen Zytokin Interleukin-6 wird bei demyelinisierenden Prozessen neben TNF und IL-1 eine wichtige Rolle zugesprochen. So wurde eine deutliche Aufregulierung der mRNA dieses Interleukins in aktiven MS Läsionen gefunden (BARANZINI et al., 2000). Eine Aufregulation des IL-6 konnte aber auch in zahlreichen anderen Erkrankungen, wie dem AIDS-Demenz-Komplex, der Alzheimerschen Erkrankung, Trauma, sowie viralen und bakteriellen Meningitiden, gezeigt werden (HULL et al., 1996;

GRUOL und NELSON, 1997). Nach VAN WAGONER et al. (1999) scheinen vor allem aktivierte Astrozyten die Quelle von IL-6 im Gehirn zu sein. IL-6 ist in der Lage, Adhäsionsmoleküle auf Endothelzellen zu induzieren, Astrozyten zu aktivieren und einen Verlust von Myelin zu verursachen (POBER, 1987; WOODROOFE, 1995; MERRILL und BENVENISTE, 1996; BRUNELLO et al., 2000). Transgene Mäuse, die IL-6 unter der Kontrolle des GFAP-Promotors überexprimieren, zeigten Astrogliose, Mikrogliaaktivierung, Neurodegeneration, Angiogenese, sowie erhöhte Werte von GFAP, IL-1, TNF und ICAM-1 (CAMPBELL et al., 1993; CHIANG et al., 1994). Auf der anderen Seite sind IL-6 knockout Mäuse resistent gegen MOG-induzierte EAE (OKUDA et al., 1998, 1999), wohingegen IL-6 knockout Mäuse in dem Modell der fokalen Ischämie keine Neuroprotektion entwickelten (CLARK et al., 2000). So scheint IL-6 mehr eine reaktive Rolle als eine ätiologische Rolle bei der Entstehung von pathologischen Veränderungen im Gehirn zuzukommen (EISEL, 2002).

Die Rolle des IL-6 im Gehirn ist noch nicht bis ins Detail geklärt, da IL-6 zudem auch eine neuroprotektive Eigenschaft zugeordnet werden konnte (MIDDLETON et al., 2000).

Interleukin-12 ist ein proinflammatorisches Zytokin, welches sich aus einer 35 kDa (p35) und einer 40 kDa (p40) schweren Untereinheit zusammensetzt. IL-12 ist allerdings nur als heterodimere Form (p70) biologisch aktiv (KOBAYASHI et al., 1989; PODLASKI et al., 1992; TRINCHIERI, 1997). Während die p40-Untereinheit die Bindung an den IL-12 Rezeptor vermittelt, ist die p35-Untereinheit für die Signalübertragung notwendig (GILLESSEN et al., 1995). IL-12 hat antivirale Eigenschaften und fördert die Differenzierung von Th1-Zellen (TRINCHIERI und GEROSA, 1996; TSUNG et al., 1997). Im Nervengewebe konnte IL-12 in freien Nervenenden, Axonen, Gliazellen, peripheren Nerven und Rückenmarkgewebe nachgewiesen werden (CHEHIMI und TRICHIERI, 1994; TRINCHIERI und GEROSA, 1996; GORAK et al., 1998). Verschiedene Zytokine regulieren die IL-12- Produktion phagozytierender Zellen. IFNγ und der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender-Faktor (GM-CSF) unter anderen fördern, IL-10 hemmt die IL-12-Produktion (D´ANDREA et al., 1992; TRICHIERI et al., 1992; GAZZINELLI et al., 1993; CHEHIMI und TRINCHIERI, 1994; SKEEN et al., 1996; SNIJDERS et al., 1996; BÜTTNER et al., 1998). In einer Studie, in der das Immunsystem der Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit LPS stimuliert wurden, konnte p40-mRNA im Gehirn nachgewiesen werden, wohingegen p35-mRNA konstitutiv exprimiert wurde. Vor allem Mikroglia waren dabei im Gehirn p40- positiv (STALDER et al., 1997). Bei Kokultivierung von Astrozyten mit Mikroglia hemmen die Astrozyten die Sezernierung von IL-12 aus stimulierten Mikroglia, so dass Astrozyten die IL-12-Produktion zu regulieren scheinen.

Interferon-γ ist einer der Hauptbeteiligten der primären antiviralen Reaktion. Zusätzlich zu dieser Eigenschaft besitzt IFNγ auch immunmodulatorische Fähigkeiten. Die Produktion des IFNγ obliegt hauptsächlich T-Zellen als auch natürlichen Killerzellen. In Anwesenheit des IFNγ wird die Proliferation von Th2-Zellen behindert, während Th1-Zellen unbeeinflusst bleiben (GAJEWSKI und FITCH, 1988). Um die Wirkung des IFNγ im Gehirn zu erforschen sind verschiedene transgene Mäuse gezüchtet worden. Die Überexpression des IFNγ unter der Kontrolle des myelin basic protein Promoters führte zu demyelinisierenden Prozesse und einer starken Mikrogliaaktivierung (CORBIN et al., 1996; HORWITZ et al., 1997). Die Nutzung von IFNγ-Rezeptor-knockout-Mäusen zeigte in dem Modell der MOG-induzierten EAE, dass IFNγ sowohl für die Einleitung als auch für die Remission von der Krankheit eine wichtige Rolle spielt. In einer weiteren Studie konnte BALB/c-Mäuse, welche normalerweise resistent gegenüber einer MBP-induzierten EAE sind, durch das IFNγ-knockout empfänglich gemacht werden, so dass dem IFNγ neben der neurodegenerativen auch eine neuroprotektive

Eigenschaft zugesprochen werden kann (KRAKOWSKI und OWENS, 1996). IP-10, ein Faktor der normalerweise von Astrozyten bei EAE synthetisiert wird, wurde allerdings bei den IFNγ-knockout-Mäusen nicht gebildet, was vermuten lässt, das Astrozyten durch IFNγ beeinflusst sind (GLABINSKI et al., 1999).

2.3.2 Antiinflammatorische Zytokine

Interleukin-4 hat während immunologischer Prozesse zwei Hauptaufgaben. Zum einen fördert IL-4 den Wechsel zur IgE und IgG-Subklassen IgG2A und IgG3 Antikörpersynthese in B-Zellen, was eine zu IFNγ antagonistische Wirkung auf B-Zellen darstellt (ABBAS, 2005). Zum anderen fördert IL-4 die Entwicklung von Th2-Zellen aus naiven CD4⁺ T- Helferzellen und stellt einen autokrinen Wachstumsfaktor für die Th2-Zellen dar (ABBAS, 2005). Zudem antagonisiert IL-4 den makrophagenaktivierenden Effekt von IFNγ und inhibiert dadurch die zellvermittelte Immunantwort, was einen Mechanismus darstellt, durch den Th2-Zellen als Inhibitoren einer Entzündung wirken (ABBAS, 2005).

Interleukin-5 aktiviert eosinophile Granulozyten und stimuliert diese zu Wachstum und Differenzierung. Außerdem regt IL-5 B-Zellen zum Wachstum und zur Produktion von IgA an. IL-5 wird von T-Lymphozyten gebildet und stellt mit IL-4 zusammen das wichtigste Zytokin der Th2-Zellenvermittelten Immunantwort dar (ABBAS, 2005).

Interleukin-10 ist ein Hemmer aktivierter Makrophagen und dadurch in die Kontrolle der zellvermittelten Immunantwort involviert. Es wird hauptsächlich von T-Lymphoyzten, unter anderen von regulatorischen T-Zellen und aktivierten Makrophagen gebildet und stellt ein negatives Feedbacksignal für Makrophagen dar (GROUX, 2003; ABBAS, 2005). Dabei werden Makrophagen vor allem daran gehindert TNF, MIP-1α, RANTES und IL-12 zu bilden (ABBAS, 2005; KREMLEV und PALMER, 2005).

Transforming growth factor β (TGFβ) ist ein antiinflammatorisches Zytokin, welches zelluläre Proliferation und Differenzierungen reguliert. TGFβ existiert in drei Isoformen (TGFβ1-3). Alle Organe exprimieren im Laufe der Entwicklung im Zusammenhang mit Gewebedifferenzierung eine oder mehrere Isoformen des TGFβ. Weiterhin wird TGFβ von T- Zellen, B-Zellen, Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, Thrombozyten, Fibroblasten, Myozyten, Chondrozyten, Osteoklasten und –blasten sowie Astrozyten gebildet (KEHRL et