GFAP-Zellkerndurchmesser

Reaktive Astrozyten zeichnen sich durch eine Hypertrophie und einen geschwollenen Zellkern aus (GRAEBER et al., 2002). Dabei deutet eine Schwellung speziell des Zellkern auf eine vermehrte Transskriptionsleistung der Zelle hin. In einer vorherigen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die Anzahl der GFAP-positiven, reaktiven Astrozyten abhängig von dem Transgenstatus (ntg, tg+/- und tg+/+) der BDV-infizierten Tiere bis zum Tag 42 p.i.

anstieg (KRAMER, 2006). Bei der Messung der Zellkerndurchmesser der GFAP-positiven Zellen ergaben sich 42 Tage p.i. bereits bei den nicht infizierten transgenen Tieren

signifikante höhere Werte zwischen den Gehirnregionen mit und denen mit nahezu keiner Expression von transgenem TNF, was auf einen Einfluss des TNF auf den Zellkerndurchmesser GFAP-positiver Astrozyten und damit auf deren Aktivierungszustand, hindeutet. Einen stärkeren direkten oder indirekten Einfluss auf die Astroyzten zeigte die BDV-Infektion, da es durch diese in nahezu allen Gehirnregionen zu einer signifikanten Vergrößerung der Zellkerndurchmesser gegenüber den entsprechenden nicht infizierten Tieren kam. Auffällig war dabei, dass das Ammonshorn eine Sonderstellung einzunehmen scheint. Es kam in allen drei Gruppen zu signifikant geringeren Werten im Ammonshorn im Vergleich zum Cortex cerebri und Striatum. Eine Aktivierung von Astrozyten im Zuge einer BDV-Infektion ist bei der Lewis Ratte (DESCHL et al., 1990; HERDEN et al., 2000, 2005), als auch bei MRL-Maus beschrieben (HALLENSLEBEN et al., 1998), wobei es bei den MRL-Mäusen nicht zu einer vermehrten GFAP-Expression sondern nur zu einer Schwellung der Astrozyten kam. Allerdings wurden in den früheren Studien die Zellkerndurchmesser der Astrozyten nicht vermessen und mit denen aus verschiedenen Gehirnregionen verglichen.

Astrozyten spielen bei der Reaktion des ZNS auf Noxen eine wichtige Rolle, wobei eine Astrogliose nicht unbedingt durch eine vermehrte Expression proinflammatorischer Zytokine entstehen muss (LITTLE et al., 2001). Allerdings ähnelt dass Transskriptionsmuster aktivierter Astrozyten in vielen Aspekten dem von aktivierten Makrophagen der Peripherie (FALSIG et al., 2006). Zudem konnte in der Zellkultur gezeigt werden, dass Astrozyten durch die Zugabe von TNF aktiviert und zur Zytokinproduktion angeregt werden können (SELMAJ et al., 1990; LEE et al., 1993). Da es nach der BDV-Infektion zu signifikant größeren Zellkerndurchmessern GFAP-positiver Astrozyten in Gehirngebieten mit transgener TNF Expression im Vergleich zu den entsprechenden nicht transgenen Tieren kam, ist von einem sich gegenseitig verstärkenden direkten oder indirekten Effekt der TNF Expression und der BDV-Infektion auszugehen. Dabei können auch andere Chemokine, wie IL-1, IL-6, SDF-α und RANTES, die ebenfalls Astrozyten aktivieren können, eine Rolle spielen (PETERSON et al., 2004) und eine IL-1-Aufregulation wurde unter anderem auch nach BDV-Infektion der transgenen Tiere beobachtete.

5.3 TNF-Rezeptoren

Bei der immunhistologischen Untersuchung konnte in den drei Gruppen der nicht infizierten Tiere eine geringe Anzahl TNFR1-positiver Neuronen festgestellt werden. Diese lagen in Ammonshorn, Cortex cerebri, Striatum und in weiteren Gehirnregionen wie dem Cerebellum.

Diese Daten stimmen mit vorangegangenen Studien überein, in denen eine konstitutive Expression des TNFR1 in Neuronen ermittelt wurde (DOPP et al., 1997; BETTE et al., 2003).

In der Zellkultur konnte auch in Astrozyten eine konstitutive TNFR1-Expression nachgewiesen werden (CHOI et al., 2005). In der vorliegenden Studie wurde allerdings nur in Neuronen konstitutiv TNFR1 festgestellt, was an einer höheren Nachweisgrenze der durchgeführten Immunhistologie liegen könnte. So können viele Faktoren auf die Nachweisgrenze der Immunhistologie Einfluss nehmen. Dies sind unter anderem das Gewebe, die Fixierung, die Vorbehandlung sowie die Art des Erst- und Zweitantikörpers (RAMOS-VARA, 2005). Weiterhin könnte auch ein Unterschied zwischen der in vitro und der in vivo TNFR1-Expression bestehen. Durch die BDV-Infektion kam es vor allem bei den transgenen Tieren im Rahmen der entzündlichen Reaktion zu einem signifikanten Anstieg TNFR1-positiver Zellen, vor allem durch die Infiltration des Gehirns mit Lymphozyten und Makrophagen. Zum anderen trugen auch residente Zellen des Gehirns, die im Rahmen der entzündlichen Reaktion hauptsächlich bei den transgenen Tieren aktiviert wurden, zu dem Pool der TNFR1-positiven Zellen bei. Darunter befanden sich rodshaped Mikroglia, Astrozyten, Oligodendrozyten und Endothelzellen. Diese Daten entsprechen früheren Studien, in denen schon die Expression von TNFR1 sowohl in ins Gehirn infiltrierten Lymphozyten und Makrophagen als auch in aktivierter Mikroglia und Astrozyten nachgewiesen wurde. In der real-time RT-PCR konnte ebenfalls eine signifikante Erhöhung der TNFR1 mRNA-Werte im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Tieren durch die BDV-Infektion festgestellt werden. So lagen die Kopienzahlen im Vorderhirn bei den nicht infizierten Mäusen aller ruppen zwischen 1015 und 1319 Kopien und bei den BDV-infizierten Tieren zwischen 1686 und 5442 Kopien. Zudem kam es durch die BDV-Infektion bei den transgenen Mäusen zu

e 1 mRNA in den Gehirnregionen, in denen auch

G

iner signifikanten Aufregulation der TNFR

die TNF-Überexpression bzw. die Entzündungsreaktion festgestellt wurde. Insofern scheint ein Großteil der beobachteten mRNA Aufregulation durch die Infiltration und Aktivierung von Entzündungszellen und Aktivierung residenter Astrozyten und Mikroglia bedingt zu sein.

Allerdings kam es schon zu Beginn der entzündlichen Reaktion am Tag 21 p.i. bei den transgenen Tieren (tg+/- und tg+/+) zu einer signifikanten Erhöhung der TNFR1 mRNA.

Zudem war am Tag 42 p.i. bei den nicht transgenen BDV-infizierten Tieren eine signifikante Erhöhung der TNFR1 mRNA in Vorderhirn, Ammonshorn und Cerebellum ohne starke inflammatorische Reaktion festzustellen, wobei die Basalwerte signifikant geringer als bei den transgenen Tieren waren. Dies deutet auf eine auch durch die BDV-Infektion bedingte Aufregulation der TNFR1 mRNA vermutlich in den residenten Zellen hin, die durch die

TNF-Überexpression verstärkt wurde. Dass immunhistologisch am Tag 21 p.i. bei den transgenen Mäusen und Tag 42 p.i. bei den nicht transgenen BDV-infizierten Tieren wenige zusätzliche Zellen TNFR1-positiv waren, könnte darin begründet liegen, dass die positiven Zellen

ktion nachgewiesen. Da zusätzlich auch eine filtration von Entzündungszellen beobachtet wurde, ist auch in dieser Studie von einer Aktivierung der Endothelzellen durch die Aufregulation des TNFR2 und eventuell des TNFR1 auszugehen. In der real-time RT-PCR kam es im Vorderhirn in der Gruppe der ntg verstärkt TNFR1 mRNA produzieren. Zudem ist ein Vergleich zwischen der Protein detektierenden qualitativen Immunhistologie und der mRNA nachweisenden quantitativen real-time RT-PCR nur eingeschränkt möglich. Durchschnittlich entsteht normalerweise zwar aus einer mRNA 0,43 bis 0,48 Proteine (ANDERSON und ANDERSON, 1998), allerdings ist die Expression der TNF-Rezeptoren stark reguliert, wobei detaillierte Daten bislang nicht vorliegen (WARE et al., 1995). Des Weiteren ist eine mögliche direkte oder indirekte Beeinflussung der TNFR1-Expression durch das BDV bisher nicht analysiert. Die Diskussion der downstream der TNF-Rezeptoren liegenden Faktoren (z.B. Caspase 3, NF-κB etc.) befindet sich im weiteren Verlauf des Diskussionteils (ab 5.5.1).

Bei den nicht infizierten Tieren konnte an allen untersuchten Zeitpunkten nur einzelne periventrikulär im Striatum gelegene oder vereinzelte cortical gelegene TNFR2-positive Neuronen beobachtet werden. Diese Daten stimmen mit vorangegangenen Studien überein, in denen nahezu keine konstitutive Expression des TNFR2 im Gehirn ermittelt wurde (BETTE et al., 2003). Durch die BDV-Infektion kam es zu einem signifikanten Anstieg TNFR2-positiver Zellen in allen drei Gruppen, wobei in der Gruppe der transgenen BDV-infizierten Tiere ein stärkerer Anstieg zu verzeichnen war. Die positiven Zellen waren vor allem infiltrierte Entzündungszellen, Endothelzellen und auch aktivierte, kommaartige Mikroglia und teilweise auch Astrozyten sowie Oligodendrozyten. Diese Zellen kamen vor allem in den Gehirnregionen mit starker Entzündungszellinfiltration wie Cortex cerebri und Striatum zu erkennen. Eine induzierte Expression von TNFR2 ist in vielen Studien bereits beschrieben worden (LUNG et al., 2001; BETTE et al., 2003; CHOI et al., 2005). Für die Expression von Adhäsionsmolekülen auf den Endothelzellen und damit für die Infiltration von Entzündungszellen soll vor allem die Expression von TNFR2 auf den Endothelzellen entscheidend sein (DOPP et al., 1997; PROBERT und AKASSOGLOU, 2001; SIBSON et al., 2002). Allerdings konnte in einer aktuellen Studie auch eine über TNFR1 und NF-κB vermittelte Expression von ICAM-1 und VCAM-1 auf Endothelzellen gezeigt werden (ZHOU et al., 2007). In der vorliegenden Studie wurde eine Expression des TNFR1 und des TNFR2 auf Endothelzellen im Gehirn nach BDV-Infe

In

und tg+/+ BDV-infizierten Tiere am Tag 21 und am Tag 42 p.i. in allen Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) zu einem signifikanten Anstieg der TNFR2-Kopienzahlen im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Tieren. Die TNFR2 mRNA-Werte bei den tg+/+ Mäusen waren am Tag 42 p.i. im Vergleich zu den entsprechenden ntg und tg+/- Mäusen hierbei signifikant höher. Dabei lagen die Werte zwischen 39 und 247 Kopien in den Gruppen der nicht infizierten Tieren und nach der BDV-Infektion zwischen 125 und 1811 Kopien. Dies lässt auf einen direkten Zusammenhang zwischen der TNFR2-Expression und der BDV-Infektion schließen. Durch die BDV-Infektion kam es zudem bei allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) in fast allen Gehirnregionen zu einer signifikanten Erhöhung der TNFR2 mRNA-Expression verglichen mit den nicht infizierten Tieren. Zudem waren bei den tg Tieren signifikant höhere mRNA-Werte in den Gehirnregionen mit hoher TNFtg-Expression sowohl bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten Mäusen im Vergleich zum Cerebellum festzustellen. Dies bedeutet, dass es durch die TNF Überexpression allein schon zu einer Induktion der TNFR2-Expression in den Gehirnregionen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum kam. Die TNF-Überexpression alleine war aber scheinbar nicht auszureichend, um eine Aktivierung der Endothelzellen und damit eine Infiltration von Entzündungszellen zu erzielen. Dies ist vergleichbar mit einer anderen Studie, in der allein durch die Injektion von TNF ins Gehirn noch keine Infiltration von Entzündungszellen erreicht werden konnte (GLABISNKI et al., 2003). Allerdings wurde in dieser Studie die Rolle des TNFR2 nicht untersucht. In einer weiteren Studie konnte eine Aufregulation von TNFR2 mRNA nach Gabe von LPS im Gehirn beobachtete werden (BETTE et al., 2003).