Protokolle der immunhistologischen Färbungen (ABC-Methode) Der Nachweis der Antigene erfolgte in Anlehnung an die von HSU et al. (1981) beschriebene

und von WÜNSCHMANN et al. (1997) modifizierte Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)- Methode:

3.5.2.1 Protokoll für Formalin-fixierte und in Paraffin-eingebettete Schnitte

1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost^® plus Objektträger, anschließend im Wärmeschrank bei 57°C mindestens 30 Minuten trocknen lassen.

2. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe: Rotihistol^® (2 x 5 Minuten), Isopropylalkohol (5 Minuten) und 96%iger Alkohol (3 Minuten).

3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml Methanol (reinst) + 3 ml frisch zugesetztem 30% H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung 0,5%igem H2O2) für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter langsamen Rühren.

4. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.

5. Demaskierung der Antigene je nach verwendetem Primärantikörper (Vorbehandlung, Tab. 5)

6. Falls eine Demaskierung durchgeführt wurde, dreimaliges Waschen der Schnitte in

PBS für je 5 Minuten.

7. Verbringen der Schnitte in Coverplates^TM und Sequenza^®-Einsätze (Thermo Electron, Dreieich) und Auftragen von 100 µl Blockserum (Tab. 5) zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen.

8. Auftragen von je 100 µl verdünntem (Tab. 5) Primärantikörper bzw.

Kontrollserum und Inkubation der Schnitte bei Raumtemperatur für 2 Stunden.

9. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.

10. Auftragen von je 100 µl 1:200 verdünntem Sekundärantikörper (Tab. 5), Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

11. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten.

12. Inkubation der Schnitte mit je 100 µl Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Elite Standard [PK-6100], Vector Laboratories) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. (Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Minuten vor Gebrauch).

13. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten, anschließend Umsetzen der Schnitte in PBS-gefüllte Glasküvetten.

14. Inkubation der Schnitte mit in 200 ml PBS aufgelöstem 0,1 g 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) unter Zusatz von 200 µl 30% H2O2 für 7 Minuten unter langsamen Rühren bei Raumtemperatur.

15. Waschen der Schnitte zweimal in PBS für je 5 Minuten, einmal 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser.

16. Gegenfärbung der Schnitte in Hämalaun nach Mayer (ROMEIS, 1989) für 15 Sekunden.

17. Bläuen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser für 10 Minuten.

18. Dehydrieren der Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger, 96%iger Alkohol für jeweils 3 Minuten, Isopropylalkohol (5 Minuten), Essigsäure-butylester (EBE, 2 x 5 Minuten).

19. Maschinelles Eindecken der Schnitte mit Hilfe eines Eindeckautomaten (Promounter RCM 2000, Medite Medizintechnik, Burgdorf).

Für den Nachweis des TNFR1 und TNFR2 wurden die Schnitte ab Schritt 7 liegend in feuchten Kammern inkubiert anstatt Coverplates^TM zu verwenden. Dazu wurde das Gewebe mit einem Fettstift (DakoCytomation Pen, DakoCytomation) umrandet.

3.5.3 Kontrollen

Die Spezifität der immunhistologischen Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen überprüft:

Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte wurden mit den jeweiligen Kontroll-seren (3.5.1.6) anstelle des Primärantikörpers inkubiert (Negativkontrolle).

Zur Kontrolle der Immunreaktion der gegen BDV-N gerichteten Antikörper wurden Schnitte von Gewebeblöcken, bei denen der BDV-Antigen Nachweis aus früheren Untersuchungen bekanntermaßen positiv war, mit dem BDV-N-Antikörper inkubiert (Positivkontrolle).

3.5.4 Auswertung und Statistik

Generell wurden braune DAB-Präzipitate, die sich in einer Ebene mit dem Gewebeschnitt befanden und in den Negativkontrollen nicht vorhanden waren, als positiv bewertet. In die Untersuchung wurden die unter 3.3.2 genannten Gehirnareale einbezogen.

Die immunhistologische Untersuchung zum Nachweis von BDNF erfolgte qualitativ, wobei die Art und Lage der BDNF-positiven Zellen näher beschrieben wurde.

Die immunhistologische Untersuchung zum Nachweis von TNFR1, TNFR2, ADNP und p50 wurde semiquantitativ bei 100-facher und 400-facher Gesamtvergrößerung nach folgendem Schema beurteilt:

TNFR1, TNFR2: ADNP, p50:

+ = < 30 positive Zellen/HPF + = < 15 positive Zellen/HPF ++ = 30 - 60 positive Zellen/HPF ++ = 15 - 30 positive Zellen/HPF +++ = > 60 positive Zellen /HPF +++ = > 30 positive Zellen /HPF

In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden als (+), +(+) oder ++(+) angegeben.

Der Antikörper gegen das BDV-spezifische Nukleoproteine (BDV-N) wurden in Hinblick auf die betroffenen Gehirnareale und die Anzahl der positiven Zellen semiquantitiativ nach folgendem Schema bei 100-facher und 400-facher Gesamtvergrößerung ausgewertet:

obb = kein Nachweis von BDV-spezifischem Protein

+ = in Herden < 80 Zellen/Gesichtsfeld bei 400-facher Gesamtvergrößerung (HPF) positive Zellen in einzelnen Gehirngebieten

++ = zahlreiche positive Zellen (< 150 Zellen/HPF) viele bis alle Gehirnregionen betroffen

+++ = zahlreiche positive Zellen (> 150 Zellen/HPF) alle untersuchten Gehirnregionen betroffen

In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden, diese wurden als (+), +(+) oder ++(+) angegeben.

Die Auswertung der p50 Immunhistologie erfolgte in der 100-fachen und 400-fachen Gesamtvergrößerung. Dabei wurden nur Zellen als positiv angesehen, die eine Translokalisation des p50 in den Zellkern durch ein braune Färbung des Zellkerns zeigten.

Die Gesamtzahl wurde für die jeweilige Gehirnregion Cortex cerebri, Striatum, Ammonshorn und Cerebellum bestimmt.

Bei der Auswertung der Caspase 3 Immunhistologie wurde die Gesamtanzahl positiver Zellen, sowie deren Art und Lage der 100-fachen und 400-fachen Vergrößerung bestimmt.

Dazu wurden weiterführend auch Doppelmarkierungen mit Antikörpern gegen CNPase und CD3 durchgeführt.

Bei der Auswertung der GFAP-Immunhistologie wurde der Zellkerndurchmessser GFAP positiver Zellen ermittelt. Dies erfolgte in den Gehirnregionen Cortex cerebri, Striatum, Ammonshorn und Cerebellum unter zur Hilfenahme des Programms AxioVison LE Rel 4.3 von Carl Zeiss Vision GmbH. In die Untersuchung wurden ungefähr 100 GFAP-positive Zellen je untersuchte Gehirnregion aufgenommen.

Die statistische Aufarbeitung der erhobenen Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Ergebnisse der semiquantitativ ausgewerteten (TNF, TNFR1, TNFR2, ADNP, p50 und BDV-N) sowie der quantitativ ausgewerteten immunhistologischen Untersuchungen (Caspase 3 und GFAP) wurden unter Verwendung des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) auf Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen. Anschließend wurde als nicht-parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon Zwei Stichproben-Test zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt, da die Daten nicht normalverteilt waren. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

3.6 Doppelmarkierungen

Zur Darstellungen, ob es sich bei den kleinen Caspase 3-positiven Zellen um Oligodendrozyten oder Lymphozyten handelte, wurde eine Doppelmarkierung mit Caspase 3- und CNPase- bzw. Caspase 3- und CD3-Antikörpern (Tab. 5) durchgeführt. Hierzu wurde initial gemäß dem Protokoll für die Immunhistologie, siehe 3.5.2.1, die Färbung der Caspase 3 bis zum Schritt 15 durchgeführt. Die Schnitte verblieben danach in PBS und wurden sofort einer weiteren immunhistologischen Detektion unterzogen. Die zweite immunhistologische Färbung begann mit Schritt 4 des unter 3.5.2.1 aufgeführten Protokolls und die Visualisierung des zweiten markierten Antikörpers erfolgte mit HistoGreen (Linaris, Wertheim-Bettinmgen, Deutschland). Die farbliche Unterscheidung der markierten Antigene (DAB – braun;

HistGreen – grün) erlaubte die Darstellung einer Kolokalisation von Signalen. Die Auswertung der Doppelmarkierungen erfolgte qualitativ.