3 Material und Methoden
3.9 Real-time RT-Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR)
3.9.3 Reverse Transkription (RT)
Die cDNA Synthese mittels RT erfolgte unter Verwendung des Omniskript® RT Kit (Qiagen) und Random Primers (Promega) in dem Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research, Waltham, USA). Der entsprechende Reaktionsansatz ist in Tab. 6 zu finden.
Die einzelnen Arbeitsschritte der RT wurden auf Eis wie folgt durchgeführt:
1. Von jeder RNA-Probe wurde je bis zu 12 µl RNA in jeweils ein 0,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert und die Menge ad 12 µl mit DEPC-Aqua bidest. aufgefüllt, so dass sich eine eingesetzte Menge der RNA von höchstens 1000 ng pro Ansatz ergab.
2. Zugabe von je 7 µl Mastermix (Tab. 8).
3. Reaktionsansatz vorsichtig mischen und anzentrifugieren.
4. RT-Reaktionsansatz im Thermocycler unter folgenden Temperaturbedingungen inkubieren:
25 °C für 10 Minuten 37 °C für 1 Stunde 93 °C für 5 Minuten
4 °C bis zur Entnahme der Proben
Nach Beendigung der spezifischen RT wurden die cDNA-Proben sofort bei –80°C bis zur weiteren Verwendung asserviert.
Tab. 6: Ansatz zur Herstellung eines 19µl cDNA-Reaktionsansatzes (RT-Mastermix)
Reagenz Konz.
Stamm-Lsg. Volumen Konz.
19 µl-Ansatz Hersteller A) RNA-Verdünnung auf bis zu 1000 ng pro Reaktionsansatz
RNA 1,0 - 12,0 µl
RNAse free water ad 12,0 µl Qiagen
B) RNaseOUT-Mix, 10 µl-Ansatz (für 10 RT-Reaktionen)
DEPC-Aqua bidest. 6,5 µl
buffer RT 10 x 1,0 µl 1,1 x Qiagen
RNaseOUTTM Recombinant
Ribonuclease Inhibitor 40 U/µl 2,5 µl 10 U/19 µl Invitrogen
C) RT-Mastermix
buffer RT 10 x 2,0 µl 1,1 x Qiagen
dNTP-Mix 5 mM 2,0 µl 0,526 mM Qiagen
RNAse free water 0,5 µl Qiagen
Random Primers 0,5µg/µl 0,5 µl 0,013 µg/µl Promega
RNaseOUT-Mix aus B 10 U/µl 1,0 µl 10 U/19 µl
Omniskript®
Reverse Transkriptase 4 U/µl 1,0 µl 4 U/19 µl Qiagen
D) 19 µl RT-PCR-Reaktionsansatz
RNA aus A 12,0 µl
RT-Mastermix aus C 7,0 µl
Gesamt 19,0 µl
Konz. Stamm-Lsg: Konzentration der Stammlösung, Konz. 10 µl RT-PCR-Mix: Konzentration im RT-PCR-Mastermix, dNTP-Mix, Desoxynukleotid-Mix
3.9.4 Primer
Primer zur Herstellung von spezifischen Amplifikaten für die Klonierungsreaktion (3.9.5) sowie die real-time RT-PCR wurden mit Hilfe des Suchprogramms Primer3 input (HTTP://FRODO.WI.MIT.EDU/CGI-BIN/PRIMER3/PRIMER3_WWW.CGI) ermittelt.
Dabei wurden jeweils die gleichen Primer für die Klonierungsreaktion (3.9.5) und die real-time RT-PCR (3.9.6) benutzt. Alle verwendeten Primer wurden als Lyophilisat von der Firma MWG Biotech AG, Ebersberg bezogen. Durch Zugabe von DEPC-Aqua bidest. wurde die Primerkonzentration der Gebrauchslösung auf 15 µM eingestellt und bei -20°C gelagert. Eine Auflistung aller verwendeten Primerkombinationen findet sich in Tab. 7.
Tab. 7: Bezeichnung, Sequenz, Amplikongröße, Acc.-No. und Position der verwendeten Primer
Bezeichnung ID Sequenzen (5’ → 3’ Orientierung) Amplk. Acc.-No.
Position IL-1α s p408 AAG CAA CGG GAA GAT TCT GA
IL-1α as p409 TGA CAA ACT TCT GCC TGA CG 179bp NM010554 294-472 IL-2 s p441 GCA GGA TGG AGA ATT ACA GGA
IL-2 as p442 TGA AAT TCT CAG CAT CTT CCA A 183bp NM008366 226-408 IL-4 s p439 CCT CAC AGC AAC GAA GAA CAC C
IL-4 as p440 CAT CGA AAA GCC CGA AAG AGT C 156bp NM021283252-407 IL-5 s p414 ATG GAG ATT CCC ATG AGC AC
IL-5 as p415 CCC ACG GAC AGT TTG ATT CT 180bp NM010558 104-283 IL-6 s p416 GTT CTC TGG GAA ATC GTG GA
IL-6 as p417 CCA GAG GAA ATT TTC AAT AGG C 176bp NM031168 203-378 IL-10 s p418 CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA
IL-10 as p419 TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG 162 bp NM010548 315-466 IL-12 s p432 AGG TGC GTT CCT CGT AGA GA
IL-12 as p433 AAA GCC AAC CAA GCA GAA GA 241bp NM008352 1035-1275 IFNγ s p227 CAC GGC ACA GTC ATT GAA AG
IFNγ as p241 AAT CTG GCT CTG CAG GAT TT 144 bp NM008337 175-319 TGFβ1 s p420 TTG CTT CAG CTC CAC AGA GA
TGFβ1 as p421 TGG TTG TAG AGG GCA AGG AC 183bp NM011577 1719-1901 TNF s p186 GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT
TNF as p187 CAC TTG GTG GTT TGC TAC GA 203bp NM013693 257-459 TNFtg s p155 CTG GAT ATT CCC AAC ATG CG
TNFtg as p156 CCC CGA AGT TCA GTA GAC AG 251bp Keine
Nummer TNFR1 s p422 CAG TCT GCA GGG AGT GTG AA
TNFR1 as p423 CAC GCA CTG GAA GTG TGT CT 197bp NM011609 508-704 TNFR2 s p424 TAC CAA GGG TGG CAT CTC TC
TNFR2 as p425 TCC TGG GAT TTC TCA TCA GG 171bp NM011610 869-1039
NR2B-R s p434 TCC GAA GCT GGT GAT AAT CC
NR2B-R as p435 GAG AGG GTC CAC ACT TTC CA 199bp NM008171 1077-1275 Kainat1-R s p354 CAG AGG GCT CCA TGA GGA GTT AT
Kainat1-R as p438 GGT CAT CCA AGA TAG CAG CAA TC 128bp NM175481 174-301 BDNF s p436 GCC CAA CGA AGA AAA CCA TA
BDNF as p437 GCT GTG ACC CAC TCG CTA AT 217bp NM007540 901-1116 GAPDH s p113 GAG GCC GGT GCT GAG TAT GT
GAPDH as p114 GGT GGC AGT GAT GGC ATG GA 288bp BC085275 326-613 βAktin s p115 GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC
βAktin as p116 ATG CCA CAG GAT TCC ATA CC 233bp NM007393 669-901 HPRT s p168 GGA CCT CTC GAA GTG TTG GA
HPRT as p169 TTG CGC TCA TCT TAG GCT TT 169bp BC083145 532-700 Acc.-No: GenBanK®-Accession-Nummer, s: sense Primer, as: antisense Primer, bp: Basenpaare, IL:
Interleukin, IFN: Interferon, TGF: transforming growth factor, TNF: Nekrose-Faktor, TNFR: Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor, TNFtg: transgenes TNF, R: Rezeptor, BDNF: brain-derived neurotrophic factor, GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, HPRT: Hypoxanthin Phosphoribosyl Transferase I
3.9.5 Standardreihen
Zur Quantifizierung der mRNA in der qRT-PCR war der Einsatz spezifischer Standardverdünnungsreihen notwendig. Für die Herstellung dieser Reihen (Tab. 10) wurde zuvor klonierte Plasmid-DNA verwendet. Dazu wurde vorab Gesamt-RNA aus Gefriermaterial eines BDV-inizierten TNF transgenen Tieres 42 Tage p.i. mit der Trizol® -Methode isoliert, die RNA aufgereinigt (3.9.2) und die cDNA durch reverse Transkription (3.9.3) hergestellt. Die cDNA wurde in einer Polymerase-Kettenreaktion (Tab. 8) zur Erzeugung spezifischer Amplifikate mit folgenden Bedingungen eingesetzt:
Denaturierung: 94°C für 5 Minuten Denaturierung: 94°C für 30 Sekunden Primeranlagerung: 60°C für 30 Sekunden Elongation: 72°C für 30 Sekunden
Zyklenanzahl: 35 x
Elongation: 72°C für 10 Minuten
und in einen pCR.4®-TOPO-Sequenzierungsvektor kloniert (Invitrogen, Karlsruhe).
Tab. 8: Ansatz zur Herstellung eines 50 µl PCR-Reaktionsansatzes (PCR-Mastermix) zur Herstellung von spezifischen Amplifikaten für die Klonierungsreaktion
Konz.
Reagenz Konz.
Stamm-Lsg. Volumen
50 µl PCR-MM
DEPC-Aqua bidest. 36,75 µl
PCR Puffer, ohne MgCl2 10 x 5 µl 1 x
MgCl2 50 mM 4 µl 4 mM
dNTP-Mix (Invitrogen) 10 mM 1 µl 200 µM
Taq DNA Polymerase 5 U/µl 0,25 µl 1,25 U/50 µl sense Primer (siehe Tab. 7) 15 µM 1 µl 300 nM antisense Primer (siehe Tab. 7) 15 µM 1 µl 300 nM 50 µl PCR-Reaktionsansatz
DNA (1 ng/µl) 1,00 µl 1 ng/50 µl
Gesamt 50,00 µl
Konz. Stamm-Lsg.: Konzentration der Stammlösung, Konz. 50 µl MM: Konzentration im PCR-Mastermix, dNTP-Mix: Desoxynukleotid-Mix
Vor der Klonierungsreaktion wurde zur Überprüfung der korrekten Amplifikation eine gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte zusammen mit einem entsprechenden DNA-Größenmarker durchgeführt. Dazu wurde ein ethidiumbromidgefärbtes, 104,3 cm3 großes Agarosegel in eine mit TBE-Puffer gefüllte Laufkammer gegeben. Von allen zu klonierenden PCR-Produkten wurde der gesamte PCR-Reaktionsansatz aufgetragen (50 µl Reaktionsansatz + 10 µl loading dye [ABgene®]) und mittels Elektrophoresis Power Supply E425 (Consort, Belgien) aufgetrennt. Die Visualisierung und Dokumentation der DNA-Banden erfolgte mit dem BioDoc Analyse System (Biometra GmbH, Göttingen) unter Verwendung von UV-Licht bei 312 nm.
Tab. 9: Zusammenfassung der Bedingungen für ein 2%iges Agarosegel
2%iges Agarosegel
DNA-Leiter 100 bp-Leiter
Volt 90 V
Watt 150 W
Dauer 60 Minuten
bp: Basenpaar, V: Volt, W: Watt
Die DNA-Banden der Amplifikate mit korrekter Größe wurden mit einem sterilen Skalpell (Aesculap, Tuttlingen) auf einer mit 10%iger Natrium-Hypochlorid-Lösung gereinigten Unterfläche bündig ausgeschnitten und in ein autoklaviertes 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben
(Macherey-Nagel, Düren) nach Angaben des Herstellers aus dem Gel aufgereinigt und durch Zugabe von 20 µl Elutionspuffer (buffer NE) gewonnen.
Die Klonierung spezifischer PCR-Produkte erfolgte unter Verwendung des TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers wie ausführlich bei GRÖTERS (2004) beschrieben.
Zur Klonierung wurde der pCR.4®-TOPO-Sequenzierungsvektor verwendet (Abb. 7). Die Vermehrung der Plasmide fand in One Shot TOP10 Chemically Competent-E.coli-Bakterien statt. Standardmäßig wurden pro PCR-Produkt ein Ligationsansätze (1 µl bis 4 µl aufgereinigtes Amplifikat) für die Herstellung eines Plasmid-Insert-Konstruktes angesetzt, von denen je 30 µl und 100 µl Bakteriensuspension auf Luria-Bertani-Agarböden ausplattiert und bis zu sechs Flüssigkulturen in 4 ml Luria-Bertani-Medium angeimpft wurden.
Die Gewinnung der Plasmid-DNA aus den transformierten One Shot TOP10 E.coli-Bakterien erfolgte unter Verwendung des NucleoBond® PC 20-Kit (Macherey-Nagel) nach Protokoll des Herstellers. Von jeder angesetzten Flüssigkultur wurde ein 1 ml Bakterienstock mit 13%
Glycerol (VWRTM International GmbH, Darmstadt) angelegt und bei -80°C asserviert.
Abb. 7: Schematische Darstellung des pCR.4®-TOPO-Sequenzierungsvektors, Invitrogen
In dem Vektor sind Primerbindungsstellen für die Primer M13 reverse (M13R) und M13 forward (M13F) enthalten, die die multiple cloning site umgeben. Stromabwärts davon befinden sich Promotorsequenzen für die DNA-abhängigen RNA Polymerasen T3 und T7 für die in vitro-Transkription. Die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung an. Selektionsgene für Resistenzen gegen Kanamycin und Ampicillin erlauben ein Bakterienwachstum auf antibiotikahaltigen Nährböden, wodurch eine Diskriminierung von nicht plasmidhaltigen Bakterien ermöglicht wird.
In dem Vektor sind Primerbindungsstellen für die Primer M13 reverse (M13R) und M13 forward (M13F) enthalten, die die multiple cloning site umgeben. Stromabwärts davon befinden sich Promotorsequenzen für die DNA-abhängigen RNA Polymerasen T3 und T7 für die in vitro-Transkription. Die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung an. Selektionsgene für Resistenzen gegen Kanamycin und Ampicillin erlauben ein Bakterienwachstum auf antibiotikahaltigen Nährböden, wodurch eine Diskriminierung von nicht plasmidhaltigen Bakterien ermöglicht wird.
Das Plasmid-Pellet wurde mit 35 µl DEPC-Aqua bidest. resuspendiert und die OD260
spektralphotometrisch bestimmt. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Plasmid-DNA bei -80°C asserviert.
Das Plasmid-Pellet wurde mit 35 µl DEPC-Aqua bidest. resuspendiert und die OD260
spektralphotometrisch bestimmt. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Plasmid-DNA bei -80°C asserviert.
Nach korrektem Einbau des PCR-Produktes in das Plasmid wurde eine PCR gemäß Tab. 11 durchgeführt, das PCR-Produkt aus dem Reaktionsansatz aufgereinigt und zur Sequenzierung versandt (Sequence Laboratories GmbH, Göttingen). Die Sequenzierungsergebnisse der Plasmide wurden mittels Align-Funktion der Gendatenbank (GenBank®: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mit bereits veröffentlichten Sequenzen verglichen (Tab. 10).
Nach korrektem Einbau des PCR-Produktes in das Plasmid wurde eine PCR gemäß Tab. 11 durchgeführt, das PCR-Produkt aus dem Reaktionsansatz aufgereinigt und zur Sequenzierung versandt (Sequence Laboratories GmbH, Göttingen). Die Sequenzierungsergebnisse der Plasmide wurden mittels Align-Funktion der Gendatenbank (GenBank®: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mit bereits veröffentlichten Sequenzen verglichen (Tab. 10).
Tab. 10: Auflistung der sequenzierten Plasmide zur Herstellung von Standardverdünnungsreihen Plasmid-ID Größe M13R-M13F Homologie Referenz Acc.-Nr.
IL-1α I 344 bp 100 % NM010554
IL-2 K5 348 bp 100 % NM008366
IL-4 K5 321 bp 98 % NM021283
IL-5 K5 345 bp 99 % NM010558
IL-6 I 341 bp 99 % NM031168
IL-10 I 327 bp 100 % NM010548
IL-12 K5 406 bp 99 % NM008352
IFNγ IV 309 bp 100 % NM008337
TGFβ1 I 348 bp 100 % NM011577
TNF IV 368 bp 100 % NM013693
TNFtg V 416 bp - keine Acc. Nr.
TNFR1 I 362 bp 100 % NM011609
TNFR2 I 336 bp 100 % NM011610
NR2B K6 364 bp 99 % NM008171
Kai-1 K5 293 bp 99 % NM175481
BDNF K5 382 bp 99 % NM007540
GAPDH I 453 bp 99 % BC085275
βAktin I 398 bp 100 % NM007393
HPRT I 334 bp 99 % BC083145
Plasmid-ID: interne Bezeichnung des Plasmids, M13R: M13 reverse Primer, M13F: M13 forward Primer, Referenz Acc.-Nr.: GenBank® Accession-Nummer der Referenzsequenz, bp: Basenpaare, IL: Interleukin, IFN:
Interferon, TGF: transforming growth factor, TNF: Tumor-Nekrose-Faktor, TNFR: Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor, TNFtg: transgenes TNF, Kai-1: Kainat-1 Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor, BDNF: brain-derived neurotrophic factor, GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, HPRT: Hypoxanthin Phosphoribosyl Transferase I
Zur Herstellung einer Standardverdünnungsreihe wurde eine PCR zur Vervielfältigung des Plasmid-Inserts mit der rekombinanten Taq DNA Polymerase (Invitrogen) und dem beigefügten Puffer in einem Multicycler® PTC 200 (Biozym Diagnostik GmbH) wie bei ULRICH (2006) beschrieben durchgeführt. Dafür wurden die nicht-linearisierten Plasmide (Tab. 10) dem Reaktionsansatz aus Tab. 11 in einer Konzentration von 0,1 ng/µl zugegeben und M13 forward und M13 reverse Primer verwendet.
Tab. 11:Ansatz zur Herstellung eines 50 µl PCR-Reaktionsansatzes (PCR-Mastermix) zur Herstellung von Standardverdünnungsreihen
Reagenz Konz. Stamm-Lsg. Volumen Konz. 50 µl PCR-MM
DEPC-Aqua bidest. 40,50 µl
PCR Puffer, ohne MgCl2 10 x 5,00 µl 1 x
MgCl2 50 mM 1,25 µl 1,25 mM
dNTP-Mix (Invitrogen) 10 mM 1,00 µl 200 µM
Taq DNA Polymerase 5 U/µl 0,25 µl 1,25 U/50 µl
M13 reverse Primer 15 µM 0,50 µl 150 nM
M13 forward Primer 15 µM 0,50 µl 150 nM
50 µl PCR-Reaktionsansatz Plasmid-DNA (0,1 ng/µl) aus Tab.
10 1,00 µl 0,1 ng/50 µl
Gesamt 50,00 µl
Konz. Stamm-Lsg.: Konzentration der Stammlösung, Konz. 50 µl MM: Konzentration im PCR-Mastermix, dNTP-Mix: Desoxynukleotid-Mix
Die Amplifikation erfolgte unter folgenden Bedingungen:
Denaturierung: 94°C für 5 Minuten Denaturierung: 94°C für 30 Sekunden Primeranlagerung: 55°C für 1 Minute Elongation: 72°C für 1 Minute
Zyklenanzahl: 40 x
Elongation: 72°C für 10 Minuten
Die korrekte Amplifikatgröße (spezifisches DNA-Insert + 165 bp Plasmid-DNA) wurde in einer Gelektrophorese gemäß Tab. 9 überprüft, die im Gel enthaltene DNA aufgereinigt und die DNA-Konzentration mittels OD260-Messung bestimmt.
Anhand der DNA-Konzentration und der genauen Amplifikatgröße wurde die Kopienzahl/µl aufgereinigtes PCR-Produkt nach folgender Formel bestimmt (aus: Roche, Molecular Biochemicals, Technical Note No. LC 11/2000):
6,02 x 1023[Kopien/mol] x DNA-Konzentration* [ng/µl]
MW [g/mol]**
Kopienzahl/µl = 6,02 x 1023[Kopien/mol] x DNA-Konzentration* [ng/µl]
MW [g/mol]**
6,02 x 1023[Kopien/mol] x DNA-Konzentration* [ng/µl]
MW [g/mol]**
Kopienzahl/µl =
* = Konzentration der aufgereinigten DNA
** = Molekulargewicht der DNA aus Tab. 10 multipliziert mit 660 D/bp
Für die Kalkulation des Molekulargewichtes (MW) der DNA wurde ein generelles MW von 660 D pro Basenpaar (D/bp) vorausgesetzt. Das MW der DNA-Amplifikate errechnete sich
damit aus der Basenpaargröße des Amplifikats (Größe des DNA-Amplifikats siehe Tab. 7) + 165 bp Vektoranteil) multipliziert mit 660 D/bp.
Die DNA wurde mit Aqua bidest. auf eine Konzentration von 109 DNA-Kopien/µl eingestellt.
Die weitere Verdünnung erfolgte logarithmisch (log10 Verdünnung) unter Verwendung von 50% Glycerol nach SCHAUDIEN et al. (2007). Bis zur weiteren Verwendung wurden die Mengenstandards bei -20°C gelagert.
Für die absolute Quantifizierung mittels real-time RT-PCR wurde für jede zu untersuchende cDNA ein entsprechender, logarithmisch verdünnter DNA-Mengenstandard in den Verdünnungsstufen 107 bis 101 DNA-Kopien/µl simultan mit den Proben in der real-time RT-PCR amplifiziert.