3 Material und Methoden
4.3 Degenerative Veränderungen
4.3.1 Quantifizierung der Vakuolisierung Zur Untersuchung der Vakuolisierung im
TNFR2-positive Zellen 3,0
herangezogen. Die Gesamtzahl der Vakuolen aus den bereits vorne beschriebenen angeschnittenen Gehirnareale (Ebene 1, 2 und 3; Abb. 6) wurde in der 100er Vergrößerung bestimmt.
Die Vakuolen waren in der Kontrollgruppe scheinbar zufällig im gesamten Gehirn verteilt. In den BDV-infizierten Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) war neben einer zufälligen Verteilung, wie sie auch in der Gruppe der Nicht infizierten zu sehen war, eine nesterartige Anordnung der Vakuolen zu sehen (Abb. 50). Diese war vor allem in der grauen Substanz wie im Cortex
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
l imtschnittm Gesa
21 dpi
semiquantitative Anzah
ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
nicht infizierte Mäuse BDV-infizierte Mäuse
42 dpi 49 dpi
wie dem Striatum und Thalamus, zu finden. Die Vakuolen kamen allerdings in diesen aus grauer und weißer Substanz bestehenden Gehirnregionen vorrangig in den Faserzügen vor.
den Gehirnregionen
Cortex cer Tha nen, während und Kleinhirn
d V n
Bei den nicht infizierten Tieren aller Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) schwankten die Werte zwischen 0 und 32 Vakuolen (Abb. 13; Tab. 48), wobei über die Zeit ein Anstieg von Tag 7 auf Tag 14 p.i. und Tag 14 auf Tag 21 p.i. zu verzeichnen war (Tab. 22; p=0,0157 bzw.
p<0,0001). In den BDV-infizierten Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) kam es zu einem sign anten A n Ta
p.i. (Tab. 22; p=0,0017, p=0,0124 und p=0,0001). Im Vergleich zwischen der Kontrollgruppe DV-infizierten Mäuse zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen ruppen (ntg, tg+/- und tg+/+).
w. Wilcoxon-U-Tests der Vakuolenanzahl
Generell waren diese Vakuolen nach der BDV-Infektion hauptsächlich in ebri, Striatum und lamus zu erken in Ammonshorn erartige eränderungen selte auftraten.
ifik nstieg vo g 14 auf Tag 21, Tag 21 auf Tag 28 und von Tag 28 auf Tag 35 und der BDV-infizierten Gruppe ergaben sich signifikanten Unterschiede ab Tag 35 p.i. Die B
G
Tab. 22: p-Werte des Kruskal-Wallis- bz
Kruskal-Wallis-Test Wilcoxon U-Test Wilcoxon U-Test
BDV gegen Kontrolle
Tag p.i.
BDV gegen Kontrolle
ntg tg+/- tg+/+ Tag p.i. BDV Kontrolle über alle
Tage 0,0046 Zeitverlauf <0,0001 <0,0001
7 1,0000 - - - 7 - 14 0,2963 0,0157
14 0,0720 - - - 14 - 21 0,0017 <0,0001
21 0,3565 - - - 21 - 28 0,0124 0,2483
28 0,4391 - - - 28 - 35 0,0001 0,0070
35 <0,0001 0,0304 0,0294 0,0282 35 - 42 0,6218 0,3572
42 0,0004 0,1658 0,0347 0,0358 42 - 49 0,1773 0,6620
49 0,0011 0,0304 0,8407 0,0275 p
u
.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, hellgrau nterlegte Felder: signifikante Unterschiede
Abb. 13: Summe der Vakuolenanzahl in den Anschnitten Ebene 1, 2 und 3
ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum, *: p<0,05, *: jeweiliger Vergleich zwischen den nicht infizierten und den entsprechenden BDV-infizierten Tieren
4.3.2 Quantifizierung der Zellen mit Anzeichen von Apoptose
Im HE-gefärbten Schnitt wurde die Gesamtzahl von Zellen bestimmt, die aufgrund der Kerwandhyperchromasie oder Fragmentierung des Zellkerns Stadien der Apoptose zeigten.
Dies wurde in den ber
Vakuolen
200 250
hnitt
7 dpi 14 dpi 21 dpi 28 dpi
Gesamtsc
eits vorne beschriebenen angeschnittenen Ebenen 1, 2 und 3 (Abb. 6) in der 400 fachen Vergrößerung bestimmt.
Apoptotische Zellen wurden im HE-gefärbten Schnitt erst ab dem 21 Tag p.i. und nur bei transgenen BDV-infizierten Tieren beobachtet. Die Anzahl der beobachteten apoptotischen Zellen stieg bei den tg+/- BDV-infizierten Tieren bis zum Tag 49 p.i. auf bis zu 20 an, während die maximale Anzahl derartiger Zellen bei den tg+/+ BDV-inifzierten Mäusen schon am Tag 42 p.i. mit 22 erreicht wurde (Abb. 14; Tab. 49). Diese untergehenden Zellen waren vorwiegend in der Nähe von entzündlichen Infitraten lokalisert (Abb. 46). Nur gelegentlich waren solche Zellen auch ohne erkennbare Nähe zu einem Infiltrat im Gehirngewebe vorhanden. Diese Zellen zeigten aufgrund dieses Sachverhaltes auch eine ähnliche Verteilung, wie die entzündlichen Infiltrate, und waren vorwiegend im Cortex cerebri und Striatum lokalisert. Im Ammonshorn waren derartige zelluläre Veränderungen selten und im Kleinhirn
0 50
ntg tg+/- tg+
100 150
/+ ntg tg+/- tg+/+
Anzahl im
nicht infizierte Mäuse BDV-infizierte Mäuse
35 dpi 42 dpi 49 dpi
Das generelle morphologische Erscheinungsbild dieser untergehenden Zellen bestand aus relativ großen Zellen mit rische lkern und hellem Zytoplasma und ließ auf Astrozyten schließen. Im paarweisen Vergleich zwischen BDV-infizierten und nicht infiz n Mäuse rgaben ttels on-Test signifikant mehr dieser untergehende Zellen bei den BDV-infizierten Tieren sowohl in der Gruppe der tg+/- als auch der tg+/+
Mäuse ab 35 Tage p.i. (Tab. 23). Die Menge der apoptotischen Zellen zeigte im Kruskal-Wall est einen gnifika stieg e Zeit bei hetero- (p=0,0034) und homozygot
ittels Wilcoxontest ein signifikanter Anstieg von Tag 28 p.i. auf Tag 35 p.i. bei omozygoten (p=0,0277) sowie von Tag 35 p.i. auf Tag 42 p.i. bei heterozygoten transgenen
DV-infizierten Tieren (p=0,0481). Außerdem war ein signifikanter Abfall von Tag 42 p.i.
uf Tag 49 p.i. bei homozygoten Mäusen auffällig (p=0,0495).
ab. 23: Wilcoxon-U-Test der untergehenden Zellen im HE-gefärbten Schnitt
Tag p.i. ntg tg+/- tg+/+
exzent m Zel ierte n e sich mi Wilcox
is-T si nten An über di
transgenen (p=0,0053) BDV-infizierten Tieren. Zudem ergab sich im paarweisen Vergleich m
h B a
T
7 1 1 1 14 1 1 1
21 1 0,2733 0,1042
28 1 0,0805 0,2636
35 1 0,0359 0,0032
42 1 0,0039 0,0104
49 1 0,0128 0,0032
.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, p-Werte des ergleichs BDV-infizierte mit nicht infizierte Tiere, hellgrau unterlegte Felder: signifikante Unterschiede p
V
beobachten waren..
Axonen mit mgebener Myelinscheide auch vakuolisierte Myelinscheiden zu erkennen, in denen das Axon exzentrisch zu liegen kam und ein großer zentraler elektronenarmer Raum zu sehen war (Abb. 51). Diese Vakuolen beinhalteten gleichmäßig verteilte kleine elektronendichte
Zellen mit Anzeichen einer Apoptose
25 20
Abb. 14: Anzahl der Zellen mit Anzeichen einer Apoptose nach BDV-Infektion im HE-gefärbten Schnitt p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, *: p<0,05,
**: p<0,01, Signifikanzen im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Tieren, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum
4.3.3 Auswertung der Luxol-Fast-Blue-Färbung
Zur Auswertung der Luxol-Fast-Blue-Färbung wurden alle BDV-infizierten und nicht infizierten Tiere herangezogen. Die deutliche Vakuolisierung bei den BDV-infizierten Tieren zu den späteren Zeitpunkten 42 und 49 p.i. konnte auch in der Luxol-Fast-Blue-Färbung deutlich erkannt werden (Abb. 50). Es ergaben sich aber keine Hinweise auf eine Aufhellung der blauen Färbung, die auf demyelinisierende Prozesse hindeuten würde.
4.3.4 Auswertung der Elektronenmikroskopie
Für die Untersuchung der Transmissions-Elektronenmikroskopie wurden Bereiche aus den Semidünnschnitten ausgewählt, in denen Vakuolen zu identifizieren waren. Dafür wurden Tieren zu einem späten Zeitpunkt der BDV-Infektion (42 Tage p.i.) verwendet, an dem die meisten Vakuolen zu
In der Elektronenmikroskopie waren in den BDV-infizierten Tieren verschiedene Vakuolentypen im Gehirn zu erkennen. So waren neben normal ausgebildeten
u
0 5 10 15
Anzahl Ze
7 14 21 28 35 42 49
llen
Tage p.i.
ntg tg+/-tg+/+
ungefähr 20 nm große Strukturen. In anderen derartigen Vakuolen waren zusätzlich durch
in diesen Myelinscheiden wenige ungeordnete
en als auch bei den BDV-infizierten nicht
g, tg+/- und tg+/+ Mäusen gelegentlich kleine diese Vakuolen spangenartig ziehende Myelinstrukturen zu finden (Abb. 51). Neben den oben beschriebenen Vakuolen waren zusätzlich Myelinscheiden zu erkennen, in denen das Axon nicht mehr festzustellen war. Allerdings waren
Neurodepris zu beobachten (Abb. 51). Solche Veränderungen konnten auch im Längsanschnitt eines Axons in einer bauchartigen Auftreibung des gesamten Axons festgestellt werden.
Sowohl bei den nicht BDV-infizierten transgen
transgenen Mäusen konnten derartige Veränderungen nicht festgestellt werden.
4.3.5 Nachweis von aktivierter Caspase 3
Als Caspase 3-positive Zellen wurden diejenigen Zellen angesehen, die ein braunes feinkörniges, zytoplasmatisches Präzipitat zeigten, welches in der Negativkontrolle nicht zu sehen war.
Bei den nicht infizierten Tieren fanden sich an den Tagen 21, 42 und 49 p.i. scheinbar zufällig über alle Gehirnregionen verteilt, bei den nt
runde positive Zellen, die sowohl Oligodendrozyten als auch Lymphozyten darstellen könnten (Abb. 52).
Am 21. Tag p.i. waren in allen drei BDV-infizierten Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) überwiegend kleine runde Zellen positiv, die ein Durchmesser von ungefähr 7 µm besaßen und wahrscheinlich Oligodendrozyten oder Lymphozyten darstellten (Abb. 52). Vereinzelt fanden sich auch Zellen, die bei einer Größe von ungefähr 15 µm große Ausläufer besaßen und sowohl Astrozyten als auch Neuronen darstellen könnten. Diese Caspase 3-positiven Zellen fanden sich vorrangig in Cortex cerebri, Striatum, Thalamus, während in Ammonshorn, Kleinhirn und Medulla oblongata diese nur vereinzelt vorkamen. Zudem waren diese Caspase 3-positiven Zellen teilweise in der Nähe der entzündlichen Infiltrate des Gehirns zu finden (Abb. 52).
An den späteren Tagen p.i. (42 und 49 Tage p.i.) wurden bei den ntg Tieren nach der BDV-Infektion insgesamt weniger Caspase 3-positive Zellen als bei den transgenen Mäusen nachgewiesen, wobei der Anteil der oligodendrozytenähnlichen Zellen an der Gesamtzahl der positiven Zellen abnahm. In den transgenen Mausgruppen (tg+/-, tg+/+) wurde nach der BDV-Infektion zu den oben schon erwähnten oligodendrozytenähnlichen Zellen größere runde Caspase 3-positive Zellen gefunden, die eine auffällige Nähe zu Infiltraten zeigten und
dementsprechend vor allem in den Gehirnregionen zu finden waren, in denen die Infiltrate vorrangig auftraten, wie dem Cortex cerebri und dem Striatum. Insgesamt fanden sich über den gemessenen Zeitraum in der Gruppe der nicht infizierten Tiere 1 bis 38 Caspase 3-positive Zellen (Abb. 15; Tab. 50). Die BDV-infizierten Tiere zeigten über den Zeitraum eine Gesamtanzahl Caspase 3-positiver Zellen von 5 bis 139 (Abb. 15; Tab. 50).
Bei der statistischen Aufarbeitung der Daten konnte im Kruskal-Wallis-Test im hochsignifikanter Unterschied am Tag 42 (p=0,0019) und 49 (p=0,0010) p.i. festgestellt werden (Tab. 14). Allerdings ergab sich im Vergleich in den einzelnen Gruppe nur ein statis h signi r Unter ied zw den tg V-infizierten und den tg+/- nicht
i. bei den nicht infizierten Tieren sowohl Caspase 3-positive und CNPase- als auch CD3-ositive Zellen (Abb. 53). Das Verhältnis zwischen den Zellen lag ungefähr bei 1:1. An den päteren Tage p.i. lag bei den BDV-infizierten Mäusen insbesondere bei den transgenen
ieren das Verhältnis zwischen den Caspase 3-positiven und den CNPase- bzw. CD3-positive ellen bei ungefähr 1:2.
ab. 24: Vergleich der Anzahl der Caspase 3-positiven Zellen nach BDV-Infektion zu den nicht infizierten Tieren
Tage p.i. alle Gruppen ntg tg+/- tg+/+
Gesamtvergleich der BDV-infizierten Tiere zu den nicht infizierten Tieren ein
tisc fikante sch ischen +/- BD
infizierten Mäusen (p=0,0304) am Tag 49 p.i. (Tab. 24).
Die Doppelmarkierung mit Caspase 3 und CNPase bzw. Caspase 3 und CD3 ergab am Tag 21 p.
p s T Z
T
21 0,0646 0,0518 0,3094 0,3123
42 0,0019 1 0,0591 0,0518
49 0,0010 0,3373 0,0304 0,0518
p-Werte des Kruskal-Wallis- (alle Gruppen) und Wilcoxon-U-Test (ntg, tg+/- und tg+/+), p.i.: post infectionem, tg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, hellgrau unterlegte Felder:
gnifikante Unterschiede n
si
Ammonshorn, Kleinhirn und Medulla oblongata diese nur vereinzelt vorkamen.
tg+/+) wurde nach der BDV-Infektion zu den oben schon
Abb. 15: Anzahl der Caspase 3-positiven Zellen in der Immunhistologie
p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, *: p<0,05, Signifikanz im Vergleich zwischen nicht infizierten tg+/- und BDV-infizierten tg+/- Mäusen, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum
Caspase 3-positive Zellen
0 160
120 140
4.3.6 Nachweis TUNEL-positiver Zellen
Als TUNEL-positive Zellen wurden diejenigen Zellen angesehen, die ein braunes feinkörniges, intranukleäres Präzipitat zeigten, welches in der Negativkontrolle nicht zu sehen war.
Am 21. Tag p.i. waren in allen drei BDV-infizierten Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) überwiegend kleine runde Zellen positiv, die ein Durchmesser von ungefähr 7 µm besaßen und entweder vorwiegend Oligodendrozyten oder Lymphozyten darstellten (Abb. 54).
Vereinzelt fanden sich auch größere Zellen mit einem Durchmesser bis zu 15 µm. Diese TUNEL-positiven Zellen fanden sich voranging in Cortex cerebri, Striatum, Thalamus, während in
An den späteren Tagen p.i. (42 und 49 Tage p.i.) wurden bei den ntg Tieren nach der BDV-Infektion insgesamt geringgradig weniger TUNEL-positive Zellen nachgewiesen, wobei der Anteil der kleinen runden Zellen an der Gesamtzahl der positiven Zellen abnahm. In den transgenen Mausgruppen (tg+/-,
erwähnten kleinen, runden Zellen auch größere, runde TUNEL-positive Zellen gefunden (Abb. 54). Diese Zellen zeigten eine auffällige Nähe zu Infiltraten und waren
20 40 60 80 100
zahesamtschnittl im GAn
ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+
nicht infizierte Mäuse BDV-infizierte Mäuse
21 dpi 42 dpi 49 dpi
dementsprechend vor allem in den Gehirnregionen zu finden, in denen die Infiltrate vorrangig auftraten, wie dem Cortex cerebri und dem Striatum. Insgesamt fanden sich in der Gruppe der nicht infizierten Tiere 3 bis 29 TUNEL-positive Zellen (Abb. 16; Tab. 51). Die BDV-infizierten Tiere zeigten eine Gesamtanzahl TUNEL- positiver Zellen von 0 bis 143 (Abb. 16;
ab. 51).
-Reaktion, vorrangig in transgenen Tieren 42 und 49 Tage nach der BDV-Infektion
TUNEL-po tr tische Reaktionen, die vor ikroglialen
Zelle u finde bb.
ochsignifikanter Unterschied am Tag 42 (p=0,0011) und 49 (p<0,0001) p.i. festgestellt erden (Tab. 25). Allerdings ergab sich im Vergleich in den einzelnen Gruppe nur ein tatistisch signifikanter Unterschied zwischen den tg+/- BDV-infizierten und den tg+/- nicht
fizierten Mäusen am Tag 42 (p=0,0294) und 49 p.i. (p=0,0304).
ab. 25: Vergleich der Anzahl der TUNEL-positiven Zellen nach BDV-Infektion zu der Anzahl bei den nicht infizierten Tieren
Tage p.i. alle Gruppen ntg tg+/- tg+/+
T
Zusätzlich fanden sich, abgesehen der als positiv gewerteten intranukleären TUNEL sitive in azytoplasma allem in astrozytären und m
n z n war (A 54).
Bei der statistischen Aufarbeitung der Daten konnte im Kruskal-Wallis-Test im Gesamtvergleich der BDV-infizierten Tiere zu den nicht infizierten Tiere ein h
w s in
T
21 0,1749 0,2845 0,4705 0,8852
42 0,0011 0,5959 0,0294 0,0518
49 <0,0001 0,0606 0,0304 0,0765
p-Werte des Kruskal-Wallis- (alle Gruppen) und Wilcoxon-U-Test (ntg, tg+/- und tg+/+), p.i.: post infectionem, tg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, hellgrau unterlegte Felder:
gnifikante Unterschiede n
si
Mäusen, arithmetischer Mittelwert,
rten Tieren waren sowohl bei den ntg als auch bei den tg+/- und tg+/+
der BDV-Infektion waren vor allem an den späteren Zeitpunkten p.i. zusätzlich zu den
Abb. 16: Anzahl der TUNEL-positiven Zellen in der Immunhistologie
p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot, *: p<0,05, Signifikanz im Vergleich zwischen nicht infizierten tg+/- und BDV-infizierten tg+/-
Fehlerbalken: Maximum und Minimum
TUNEL-positive Zellen
40 80 100 160
120 140