Degenerative Prozesse

Bei der Untersuchung der Vakuolen waren in allen Gruppen der nicht infizierten Tiere diese scheinbar zufällig im gesamten Gehirn verteilt. Dies deutet auf eine geringgradig durch die Präparation des Gehirn bedingte Vakuolenbildung in den Mäusegehirnen oder auf einen Mausstammeffekt hin. Solche als Artefakt zu bezeichnende Erscheinungen werden auch bei Gehirnen mit einem schlechten Erhaltungszustand beobachtet. Zum einem können sie durch eine Schwellung der Astroyzten verursacht werden, die durch eine Immersion des Gehirngewebes in eine hypotone Lösung entstehen kann (GERSCHENFELD et al., 1959;

ZADONAISKY et al., 1965). Außerdem soll postmortale Autolyse zu einer Schwellung der Astrozyten und auch der Oligodendrozyten führen (ADORNATO und LAMPERT, 1971). Da die Mäusegehirne direkt nach der Euthanasie entnommen und in die Formalinlösung verbracht wurden, ist nicht von einer postmortalen Autolyse auszugehen. In den BDV-infizierten Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) war neben einer zufälligen Verteilung, wie sie auch in der Gruppe der nicht infizierten zu sehen war, eine nesterartige Anordnung der Vakuolen zu sehen. Diese war vor allem in der grauen Substanz wie im Cortex cerebri, als auch in als auch weiße Substanz vorkamen, wie dem Striatum und Thalamus, zu finden. Die Vakuolen kamen allerdings in diesen aus grauer und weißer Gehirnarealen in denen sowohl graue

Substanz bestehenden Gehirnregionen vorrangig in den Faserzügen vor. Generell waren diese Vakuolen nach der BDV-Infektion hauptsächlich in den Gehirnregionen Cortex cerebri, Striatum und Thalamus zu erkennen, während in Ammonshorn und Kleinhirn derartige Veränderungen selten auftraten. Da diese Veränderungen in nicht transgenen und transgenen BDV-infizierten Tieren gleichermaßen auftraten, ist von einem Effekt der Virusinfektion auszugehen, die nicht durch TNF oder der Entzündungsreaktion beeinflusst wurde. Es scheint sich eher um einen Mauslinien-spezifischen Effekt zu handeln, da derartige Veränderungen bisher bei empfänglichen BDV-infizierten Tieren nicht beschrieben wurden. Das Auftreten dieser Vakuolen in der grauen Substanz und den Faserzügen der weißen Substanz legt nahe, dass es sich um Vakuolen in den neuronalen Fortsätzen bzw. Myelinscheiden handelt. Dies konnte durch die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden, in der diese Vakuolen sowohl der Myelinscheiden ohne Veränderung des eigentlichen Axons als auch als axonale Veränderungen mit Aufquellung des eigentlichen Nervenzellfortsatzes zu erkennen waren. Das Auftreten von Vakuolen in der grauen Substanz wird unter anderem bei metabolischen, toxischen und hereditären Enzephalopathien gesehen. Vakuolen im Bereich der Nervenzellfortsätze können bei verschiedenen degenerativen und hypoxischen Prozessen auftreten (ADORNATO und LAMPERT, 1971). Durch die Luxol-Fast-Blue-Färbung wurde

keine demyelinisierende Prozesse erkannt, so dass bei diesen Veränderungen eher von nicht demyelinisierenden Veränderungen ausgegangen werden sollte. Daher kann in der vorliegenden Studien entweder von einer primären Myelinscheidenvakuolisierung oder einer primären Axonopathie ausgegangen werden. Dass in der Elektronenmiskrokopie bei der Myelinscheidenvakuolisierung noch morphologisch intakte Axone festgestellt werden konnte, legt allerdings eine primäre Myelinopathie nahe. Diese können durch verschiedenen Noxen verursacht werden. Darunter befinden sich toxische Substanzen wie zum Beispiel Aniline (OKAZAKI et al., 2001) und Cuprizon (SUZUKI und KIKKAWA, 1969). Weiterhin können auch im Rahmen von metabolischen Krankheiten entstandene endogene Substanzen dafür verantwortlich sein. Eine mögliche Ursache für primäre axonale Veränderungen wäre ein virusbedingte Beeinflussung der neuronalen retro- oder anterograden Transportwege. Die Benutzung derartiger Transportwege ist unter anderem für das Tetanustoxin, Tollwutvirus, Prionprotein und Neurotrophine, wie BDNF, beschrieben (SCHWAB und THOENEN, 1977;

SCOTT und FRASER, 1989; MANNING et al., 1990; KELLY und STRICK, 2000; VON BARTHELD et al., 2001; BARTZ et al., 2003) und wird ebenfalls für das BDV angenommen. Dies führte aber anscheinend zu keiner Beeinflussung der disseminierten Virusausbreitung im Gehirn. Um die ultrastrukturelle Morphologie der Vakuolen und ihre Pathogenese genauer zu charakterisieren, sollte sie an speziell dafür perfundierte Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. in einer weiteren Studien untersucht werden.

Als apoptotische Zellen im HE-gefärbten Schnitt wurden diejenigen Zellen angesehen, die aufgrund einer Kerwandhyperchromasie oder Fragmentierung des Zellkerns Stadien der Apoptose zeigten. Derartige Zellen wurden erst ab dem 21 Tag p.i. und nur bei transgenen BDV-infizierten Tieren beobachtet. Diese untergehenden Zellen waren vorwiegend in der Nähe von entzündlichen Infiltraten lokalisiert. Daraus lässt sich ein direkter oder indirekter Einfluss der BDV-Infektion und der TNF-Überexpression bzw. Entzündungsreaktion schließen. Das generelle morphologische Erscheinungsbild dieser untergehenden Zellen bestand aus relativ großen Zellen mit exzentrischem Zellkern und hellem Zytoplasma. Zudem war ein Großteil dieser Zellen GFAP positiv, so dass es sich am wahrscheinlichsten um Astrozyten handelt. Eine starke Aktivierung der Astrozyten konnte in der vorliegenden Studie bereits durch die starke Vergrößerung des Zellkerndurchmesser GFAP-positiver und damit aktivierter Astrozyten gezeigt werden. Eine zu starke Aktivierung dieser Astroyzten in Kombination mit den inflammatorischen Faktoren könnte diese Zellen an das Limit ihrer Stoffwechselleistung und damit zu diesen degenerativen Prozessen geführt haben. Derartige Vorgänge sind bereits bei Mikroglia beschrieben wurden, wo eine Überaktivierung zu

Apoptosen führt (LIU et al., 2001). Die in dieser Studie mittels HE-Färbung als apoptotisch identifizierten Zellen waren selten Caspase 3-positiv, so dass bei diesen Zellen eventuell von einem Caspase 3-unabhängigen apoptoseähnlichen degenerativen Prozess ausgegangen werden muss (XIANG et al., 1996; KROEMER und MARTIN, 2005; STEFANIS, 2005).

CAUWELS et al. (2003) konnte zeigen, dass eine Inhibierung der Caspase die TNF-vermittelte Toxizität nicht verminderte sondern sogar verstärkte, und verschiedene Formen des Caspase-unabhängigen programmierten Zelltod sind bereits beschrieben (CLARKE, 1990; KING und CIDLOWSKI, 1995; BORNER und MONNEY, 1999; KITANAKA und KUCHINO, 1999; SPERANDIO et al., 2000). Dabei soll sich der sogenannte Apoptose ähnliche, Caspase unabhängige programmierte Zelltod durch Chromatinkondensation, welche nicht so stark wie bei der Apoptose ist, aber eine komplexere, klumpigere Struktur aufweist, auszeichnen. Dieser Vorgang soll durch den apoptosis inducing factor, der Endonuklease G, Cathepsine oder anderen Proteasen verursacht werden (BRÖKER et al., 2005), so dass derartige Faktoren und deren Expression bei BDV-infizierten TNF transgenen Tieren in weiteren Studien untersucht werden sollte.

5.5.1 Caspase 3 und TUNEL

Generell zeigten die Caspase 3- und TUNEL-positiven Zellen eine sehr ähnliche Morphologie und ein ähnliches Verteilungsmuster. Positive Zellen waren kleine runde Zellen, die ein

ich leine runde Caspase 3- bzw. TUNEL-positive Zellen, die sowohl Oligodendrozyten als auch

Lym arkierung der Caspase 3-positiven Zellen mit

CNPase bzw. CD3 konnte bestätigen, dass sowohl Oligodendrozyten als auch Lymphozyten Durchmesser von ungefähr 7 µm besaßen. Vereinzelt fanden sich auch Zellen, die bei einer Größe von ungefähr 15 µm große Ausläufer besaßen und sowohl Astrozyten als auch Neurone darstellen könnten. Da Zellen mit ähnlicher Morphologie sowohl Caspase 3-positiv als auch TUNEL-positiv waren, kann davon ausgegangen werden, dass es sich, abgesehen von den obengenannten astrozytären Zellen, bei den positiven Zellen um Zellen handelte, die eine Caspase-abhängige Apoptose durchführen, welche allerdings im HE-gefärbten Schnitt nicht zu beobachten war. Bei den drei Gruppen der nicht infizierten Tieren fanden sich an den Tagen 21, 42 und 49 p.i. scheinbar zufällig über alle Gehirnregionen verteilt gelegentl k

phozyten darstellen könnten. Die Doppelm

zu diesem Zeitpunkt p.i. Caspase 3-positiv waren. Es bestand kein Unterschied zwischen den drei nicht infizierten Gruppen, so dass man davon ausgehen kann, dass sich die TNF Überexpression per se nicht auf eine vermehrte Apoptoserate dieser Zellen ausgewirkt hat.

Die als positiv angesehenen Zellen, können sowohl im Rahmen eines normalen turnovers des

juvenilen Mäusegehirns aufgetreten sein. Es kann sich allerdings auch um einzelne durch das Gehirn wanderende Lymphoyzten handeln. Normalerweise wird der Eintritt der Lymphoyzten ins ZNS durch die endothelialen tight junctions und durch die relativ geringen Reaktivität der Endothelzellen der Kapillaren der Gehirns verhindert (IRANI und GRIFFIN, 1996).

Allerdings haben einige Studien gezeigt, dass einzelne T-Zellen routinemäßig die Bluthirnschranke im Rahmen der immunologischen Überwachung des Gehirns passieren (WEKERLE et al., 1986; HICKEY et al., 1991; IRANI und GRIFFIN, 1996). Diese eingewanderten Lymphozyten verlassen aber das ZNS wieder oder gehen in diesem zugrunde (GRIFFIN, 2003). Nach der BDV-Infektion war am Tag 21 p.i. in allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) eine leicht vermehrte Anzahl sowohl Caspase 3- als auch TUNEL-positiver Zellen zu ermitteln. Diese Zellen setzten sich überwiegend aus kleinen runden Zellen zusammen, die einen Durchmesser von ungefähr 7 µm besaßen. Diese Zellen wurden bereits bei den nicht infizierten Mäuse nachgewiesen. Generell scheint nach der BDV-Infektion zu diesem Zeitpunkt p.i. deren Anzahl nur etwas erhöht zu sein. Eine Möglichkeit wäre, dass das BDV den zellulären turnover im ZNS erhöht, was zu einer leicht erhöhten Anzahl dieser Zellen führt. Außerdem kann es durch die BDV-Infektion indirekt zu einer Expression von Adhäsionsmolekülen auf den Endothelzellen geführt haben, was in einer erhöhten Anzahl auswandernder Lymphozyten resultierte. Zwar werden Endothelzellen nicht selber BDV infiziert, aber es konnte eine Aufregulation der TNF-Rezeptoren und eine NF-κB-Translokalisation in den Zellkern der Endothelzellen festgestellt werden, so dass von einer indirekten Aktivierung eventuell auch durch Zytokine von residenten Zellen ausgegangen werden muss. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Zellen fanden sich am Tag 21 p.i.

vereinzelt auch Caspase 3- und TUNEL-positive Zellen, die bei einer Größe von ungefähr 15 µm große Ausläufer besaßen und sowohl Astrozyten als auch Neurone darstellen könnten.

Diese positiven Zellen fanden sich vorrangig in Cortex cerebri, Striatum, Thalamus, während in Ammonshorn, Cerebellum und Medulla oblongata diese nur vereinzelt vorkamen. Zudem waren diese positiven Zellen teilweise in der Nähe der entzündlichen Infiltrate des Gehirns zu finden. Allerdings waren die im HE-gefärbten Schnitt als apoptotisch erkannten vermutlichen Astrozyten überwiegend Caspase 3-negativ. Degenerative Prozesse bei der BDV-Infektion sind sowohl bei der adult als auch bei der neonatal infizierten Lewis Ratte beschrieben worden (NARAYAN et al., 1983B; MORALES et al., 1988; DESCHL et al., 1990;

CARBONE et al., 1991; HERDEN et al., 2000; WILLIAMS et al., 2006). Diese Zelluntergänge wurden aber hauptsächlich in Cortex cerebri und Ammonshorn bei adult BDV-infizierten Ratten beobachtet, wobei in dieser Studie überraschenderweise vor allem im

Ammonshorn keine auffälligen Degenerationen vorlagen. Zu den späteren Zeitpunkten nach der Infektion (42 und 49 Tage p.i.) fanden sich bei den ntg BDV-infizierten Mäusen keine Unterschiede zu den entsprechenden Kontrolltieren hinsichtlich der Anzahl Caspase 3- und UNEL-positiver Zellen. Anders verhielt es sich bei den BDV-infizierten transgenen Tieren,

n.

T

bei denen die Anzahl Caspase 3- und TUNEL-positiver Zellen teilweise signifikant höher als bei den entsprechenden nicht infizierten Tieren war. Diese Tatsache ist deshalb auf einen direkten oder indirekten Effekt der TNF-Überexpression bzw. entzündlichen Reaktion zurückzuführen. Bei den Caspase 3- und TUNEL-positiven Zellen zu diesem Zeitpunkt p.i.

handelte es sich zusätzlich zu den oben schon erwähnten 7 µm großen Zellen um größere bis zu 15 µm große runde Zellen, die eine auffällige Nähe zu Infiltraten zeigten und dementsprechend vor allem in den Gehirnregionen zu finden waren, in denen die Infiltrate vorrangig auftraten. Bei diesen Zellen könnte es sich um Astrozyten handeln, die neben den oben beschriebenen Caspase-unabhängigen Apoptosen eine Caspase-abhängige Apopotose ähnlichen programmierten Zelltod durchführen. Die Doppelmarkierung von Caspase 3 mit CNPase bzw. CD3 zeigte, dass gerade bei den transgenen Tieren zu den späteren Zeitpunkten p.i. (42 und 49 Tage p.i.) die Anzahl doppelt positiver Lympozyten im Verhältnis zu den Oligodendrozyten zunahm. Dies mag vor allem darin begründet liegen, dass zu diesen Zeitpunkt auch sehr viele Lymphoyzen in das Gehirngewebe eingewandert sind und dort sowohl perivaskulär als auch parenchymatös lagen und apoptotisch unterginge

Zusätzlich fanden sich, abgesehen der als positiv gewerteten intranukleären TUNEL-Reaktionen, vorrangig in transgenen Tieren 42 und 49 Tage nach der BDV-Infektion TUNEL-positive intrazytoplasmatische Reaktionen, die vor allem in astrozytären und mikroglialen Zellen zu finden waren. Dabei könnte es sich um phagozytierte, fragmentierte DNA benachbarter Zellen handeln. Da es sich bei beiden Zelltypen auch um antigenpräsentierende Zellen handelt liegt diese Vermutung nahe. Die schnelle Phagozytose mag auch erklären, dass im HE-gefärbten Schnitt keine weiteren Spuren Caspase-abhängiger Apoptose, wie apoptotic bodies oder die kleinen untergehenden Zellen, gefunden wurden.