TNFR2 mRNA - Quantifizierung zellulärer Gene mittels real-time RT-PCR

ADNP-positive Zellen

4.5 Quantifizierung zellulärer Gene mittels real-time RT-PCR

4.5.4 TNFR2 mRNA

Die Menge der TNFR2 mRNA wurde sowohl im Vorderhirn als auch in den Gehirnregionen bestimmt. In allen gemessenen Proben konnte eine konstitutive Expression der TNFR2 mRNA ermittelt werden, die zwischen 39 und 247 Kopien lag. Im Gegensatz dazu bestand die Spannweite der Kopienzahlen nach der BDV-Infektion zwischen 125 und 1811 (Abb. 25;

Abb. 26; Tab. 54; Tab. 55; Tab. 56). Bei der dreifaktoriellen Varianzanalyse der TNFR2-Kopienzahlen ergaben sich eine Reihe verschiedener Einflüsse auf die Expressionsrate (Tab.

32). So beeinflusste sowohl der Infektionstag, der Transgenstatus, die Gehirnregion als auch der Infektionsstatus (nicht bzw. BDV-infiziert) die TNFR2 mRNA-Werte. Zudem übten der Infektionstag mit dem Transgenstatus, die Gehirnregion mit dem Transgenstatus als auch der Infektionstag mit dem Infektionsstatus sich gegenseitig verstärkende Effekte aus. Diese Effekte wurden durch den nachgeschalteten paarweisen Vergleich näher untersucht.

Tab. 32: Dreifaktorielle Varianzanalyse der TNFR2 mRNA-Werte

Vorderhirn p-Werte Gehirnregionen p-Werte

Tag 0,0105 Region <0,0001

Transgen 0,0014 Transgen 0,0031

BDV <0,0001 BDV <0,0001

Tag x Transgen 0,0235 Region x Transgen 0,0018

Tag x BDV 0,0401 Region x BDV 0,4420

BDV x Transgen 0,3937 BDV x Transgen 0,1595

Tag x Transgen x BDV 0,5157 Region x Transgen x BDV 0,2507

Tag: Vergleich zwischen den Infektionstagen 21 und 42 post infectionem, BDV: Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten Mäusen, Transgen: Vergleich der 3 verschiedenen Transgenstatus (nicht transgen, heterozygot- oder homozygot transgen), Region: Vergleich zwischen den Gehirnregionen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum, Cerebellum, hellgrau unterlegte Felder: signifikante Unterschiede

Im paarweisen Vergleich der TNFR2 mRNA-Expression im Vorderhirn ergaben sich signifikant höhere Werte bei den BDV-infizierten im Vergleich zu den nicht infizierten Tieren am Tag 21 p.i. für ntg (p=0,0175) und tg+/+ (p=0,0374) und am Tag 42 p.i. für ntg (p=0,0025), tg+/- (p=0,0054) und tg+/+ (p<0,0001) Mäuse (Tab.57). Im Vergleich der BDV-infizierten Tiergruppen am Tag 42 p.i. ergaben sich zudem signifikant höhere Werte bei den tg+/+ im Vergleich zu den ntg (p=0,0001) und den tg+/- (p=0,0052) Mäusen. Zudem wurde für die tg+/+ Tiere ein signifikanter Anstieg nach der BDV-Infektion vom 21. zum 42.Tag p.i.

festgestellt (p=0,0002).

Durch die BDV-Infektion kam es bei allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) in allen Gehirnregionen (außer bei den ntg Tieren im Ammonshorn, p=0,0515) zu einer signifikanten Erhöhung der TNFR2 mRNA-Werte im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Tieren (Tab. 58). Bei den tg Mäusen ergaben sich signifikant höhere TNFR2 mRNA Mengen sowohl

bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten in den Gehirnarealen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum im Vergleich zum Cerebellum. Zudem lagen signifikant höhere Werte bei den tg BDV-infizierten Tieren im Vergleich zu den ntg BDV-infizierten Mäusen im Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum vor.

Durch die BDV-Infektion kam es zusammenfassend betrachtet im Vorderhirn in der Gruppe der ntg und tg+/+ Tiere am Tag 21 und am Tag 42 p.i. in allen Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) zu einem signifikanten Anstieg der TNFR2 Kopienzahlen mit signifikant höheren TNFR2 mRNA-Werten am Tag 42 p.i. bei tg+/+ im Vergleich zu den entsprechenden ntg und tg+/- Mäusen. Durch die BDV-Infektion kam es zudem bei allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) in fast allen Gehirnregionen zu einer signifikanten Erhöhung der TNFR2 mRNA-Expression verglichen mit nicht infizierten Tieren. Zudem waren bei den tg Tieren signifikant höhere mRNA-Werte in den Gehirnregionen mit hoher TNFtg Expression sowohl bei den nicht- infizierten als auch bei den BDV-infizierten Mäusen im Vergleich zum Cerebellum festzustellen. Die TNFR2 mRNA-Werte im Cerebellum waren zwischen den ntg und den tg Mäusen mit und ohne BDV-Infektion vergleichbar.

TNFR2

0 400 800 1200 1600 2000

ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

21 Tage p.i. 42 Tage p.i.

Kopienzahl (normalisiert)

Abb. 25: Quantifizierung der TNFR2 mRNA-Werte aus dem Vorderhirn

Kopienzahl mittels housekeeping Genen auf 25 ng eingesetzte RNA-Menge normalisiert, TNFR2: Tumor-Nekrose-Faktor α-Rezeptor 2, p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+:

homozygot transgen, geometrischer Mittelwert, Fehlerbalken: Streufaktor, *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001,

*: Vergleich zwischen ntg nicht infizierten und ntg BDV-infizierten Tieren am Tag 21 p.i., *: Vergleich zwischen tg+/+ nicht infizierten und tg+/+ BDV-infizierten Tieren am Tag 21 p.i., **: jeweiliger Vergleich zwischen ntg bzw. tg+/- nicht infizierter mit entsprechenden ntg bzw. tg+/- BDV-infizierten Tieren am Tag 42 p.i., ***: Vergleich zwischen tg+/+ nicht infizierten und tg+/+ BDV-infizierten Tieren am Tag 42 p.i.

TNFR2

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

ntg tg +/- tg +/+ ntg tg +/- tg +/+

nicht infizierte Mäuse BDV-infizierte Mäuse

Kopienzahl (normalisiert)

Cortex cerebri Ammonshorn Striatum Cerebellum

Abb. 26: Quantifizierung der TNFR2 mRNA-Werte aus den Gehirnregionen 42 Tage p.i.

homozygot transgen, geometrischer Mittelwert, Fehlerbalken: Streufaktor, *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001,

*: Vergleich zwischen Cortex cerebri bei ntg nicht infizierten und jeweiligen ntg BDV-infizierten Tieren, *:

Vergleich zwischen Striatum bei ntg nicht infizierten und jeweiligen ntg BDV-infizierten Tieren, ***:

Vergleich zwischen Cerebellum bei ntg nicht infizierten und jeweiligen ntg BDV-infizierten Tieren, *^-***:

jeweiliger Vergleich zwischen den einzelnen Gehirnregionen bei tg+/- nicht infizierten und entsprechenden tg+/- BDV-infizierten Tieren, **^-***: jeweiliger Vergleich zwischen den einzelnen Gehirnregionen bei tg+/+

nicht infizierten und entsprechenden tg+/+ BDV-infizierten Tieren

4.5.5 IL-1α mRNA

Die Menge der IL-1α mRNA wurde sowohl im Vorderhirn als auch in den Gehirnregionen bestimmt. In allen Proben konnte eine, wenn auch teilweise geringe, konstitutive IL-1α mRNA-Expression im Gehirn gemessen werden. So waren im Vorderhirn zwischen 121 und 1136 Kopien (Abb. 27; Tab. 54; Tab. 55) und in den einzelnen weiteren Gehirnarealen zwischen 5 und 180 Kopien (Abb. 28; Tab. 56) zu messen. Die Anwendung der dreifaktoriellen Varianzanalyse auf die Expression in den einzelnen Gruppen ergaben eine Beeinflussung der Expression durch den Transgenstatus, den Infektionsstatus und der Gehirnregion, sowie sich einander verstärkende Faktoren (Tab. 33). Dieses waren der Infektionstag mit dem Transgenstatus bzw. dem Infektionsstatus und die Gehirnregion mit dem Transgenstatus bzw. dem Infektionsstatus. Die Effekte wurden mittels des paarweisen Vergleich näher untersucht.

Tab. 33: Dreifaktorielle Varianzanalyse der IL-1α mRNA-Werte

Vorderhirn p-Werte Gehirnregionen p-Werte

Tag 0,1201 Region <0,0001

Transgen <0,0001 Transgen 0,0002

BDV <0,0001 BDV <0,0001

Tag x Transgen 0,0224 Region x Transgen 0,0061

Tag x BDV 0,0424 Region x BDV 0,0019

BDV x Transgen 0,0797 BDV x Transgen 0,3410

Tag x Transgen x BDV 0,8298 Region x Transgen x BDV 0,4653

Bei der Untersuchung der IL-1α mRNA-Expression im Vorderhirn ergaben sich signifikant höhere Kopienzahlen bei den tg+/- bzw- tg+/+ nicht infizierten Tiere am Tag 21 p.i. im Vergleich zu den ntg Mäusen (p=0,0042 bzw. p=0,0045; Tab. 57). Zudem wurden signifikant höhere Werte in der Gruppe der BDV-infizierten vergleichend zu den nicht infizierten Tieren am Tag 21 p.i. bei den ntg (p=0,0292), tg+/- (p=0,0247) und tg+/+ (p=0,0007) sowie auch am Tag 42 p.i. bei den ntg (p=0,0009), tg+/- (p=0,0010) und tg+/+ (p<0,0001) festgestellt. Zudem ergaben sich signifikant höhere Kopienzahlen in der Gruppe der BDV-infizierten Tiere am Tag 21 p.i. für tg+/- verglichen mit ntg (p=0,0035) und für tg+/+ verglichen mit ntg (p<0,0001) sowie am Tag 42 p.i. für tg+/- verglichen mit ntg (p=0,0005) und für tg+/+

verglichen mit ntg (p=0,0043). Außerdem konnte ein signifikanter Anstieg der IL-1α mRNA Kopien für die tg+/- Tiere nach BDV-Infektion vom 21. zum 42. Tag p.i. festgestellt werden (p=0,0161).

Auf Ebene der Gehirnareale kam es generell in allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) in allen gemessenen Gehirnregionen zu signifikant höheren Werten bei den BDV-Inifzierten Tieren im Vergleich zu den entsprechenden nicht infizierten Mäusen. Es ergaben sich signifikant höhere Werte bei tg Mäusen im Vergleich zu den ntg Tieren sowohl bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten Tieren in den Gehirnregionen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum (p-Werte siehe Anhang). Bei den tg Mäusen ergaben sich zudem signifikant geringere Kopienzahlen sowohl bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten zwischen den IL1α mRNA Mengen im Cerebellum vergleichend zu den anderen Gehirnregionen (Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum; p-Werte: Tab. 58).

Zusammenfassend fanden sich in der Gruppe der nicht infizierten Tiere im Vorderhirn signifikant höhere IL-1α mRNA Kopienzahlen bei tg Tieren im Vergleich zu ntg Mäusen.

Durch die BDV-Infektion kam es in allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) am Tag 21 und am Tag 42 p.i. zu einer signifikanten Erhöhung der IL-1α mRNA-Werte im jeweiligen

Vergleich zu den nicht infizierten Tieren. Durch die BDV-Infektion kam es zudem bei allen drei Gruppen (ntg, tg+/- und tg+/+) in allen Gehirnregionen zu signifikant höheren Kopienzahlen im Vergleich zu den nicht infizierten Tieren. Zudem waren bei den tg Tieren signifikant höhere IL-1α mRNA-Werte in den Gehirnregionen mit hoher TNFtg Expression sowohl bei den nicht infizierten als auch bei den BDV-infizierten Mäusen im Vergleich zu dem Cerebellum festzustellen. Die IL1α mRNA-Werte im Cerebellum waren zwischen den ntg und den tg Mäusen mit und ohne BDV-Infektion vergleichbar.

IL-1 alpha

0 400 800 1200 1600

ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

21 Tage p.i. 42 Tage p.i.

Kopienzahl (normalisiert)

Abb. 27: Quantifizierung der IL-1α mRNA-Werte aus dem Vorderhirn

Kopienzahl mittels housekeeping Genen auf 25 ng eingesetzte RNA-Menge normalisiert, IL-1: Interleukin-1, p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, geometrischer Mittelwert, Fehlerbalken: Streufaktor, *: p<0,05, ***: p<0,001, *^-***: jeweiliger Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten Tieren am Tag 21 p.i., ***: jeweiliger Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten Tieren am Tag 42 p.i.

IL-1 alpha

0 50 100 150 200 250 300 350 400

ntg tg +/- tg +/+ ntg tg +/- tg +/+

nicht infizierte Mäuse BDV-infizierte Mäuse

Kopienzahl (normalisiert)

Cortex cerebri Ammonshorn Striatum Cerebellum

Abb. 28: Quantifizierung der IL-1α mRNA-Werte aus den Gehirnregionen 42 Tage p.i.

Kopienzahl mittels housekeeping Genen auf 25 ng eingesetzte RNA-Menge normalisiert, IL-1: Interleukin-1, p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, geometrischer Mittelwert, Fehlerbalken: Streufaktor, *: p < 0,05, ***: p < 0,001, *^-***: jeweiliger Vergleich zwischen den Gehirnregionen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum nicht infizierter ntg und entsprechender tg+/- bzw. tg+/+ Tiere, *^-***: jeweiliger Vergleich zwischen den Gehirnregionen Cortex cerebri, Ammonshorn und Striatum BDV-infizierter ntg und entsprechender tg+/- bzw. tg+/+ Tiere, *^-***:

jeweiliger Vergleich zwischen den Gehirnregionen Cortex cerebri, Ammonshorn, Striatum und Cerebellum bei nicht infizierten und BDV-infizierten Tieren der jeweiligen Gruppe (ntg, tg+/- bzw. tg+/+)

4.5.6 IL-2 mRNA

Die Expression von IL-2 mRNA wurde nur im Vorderhirn ermittelt. Dabei war nur bei zwei Tieren eine Amplifikation messbar. Bei einem Tier handelte es sich um ein heterozygotes transgenes, BDV-infiziertes Tier am Tag 42 p.i. (4,66 Kopien), bei dem anderen um ein nicht transgenes, BDV-infiziertes Tier am Tag 42 p.i. (12,44 Kopien; Abb. 29; Tab. 54; Tab. 55).

Da es sich bei den gemessenen Werte um nicht normalverteilte Zahlen handelte, wurde der Kruskal-Wallis-Test als Globaltest angewandt. Dabei konnte weder ein Einfluss des Tags nach der Infektion (p=0,1515), des Transgenstatus (p=0,5972) noch der BDV-Infektion (p=0,1515) ermittelt werden (Tab. 56).

IL-2

0 2 4 6 8 10 12 14

ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

21 Tage p.i. 42 Tage p.i.

Kopienzahl (normalisiert)

Abb. 29: Quantifizierung der IL-2 mRNA-Werte aus dem Vorderhirn

Kopienzahl mittels housekeeping Genen auf 25 ng eingesetzte RNA-Menge normalisiert, IL-2: Interleukin-2, p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum

4.5.7 IL-6 mRNA

Die Expression von IL-6 mRNA wurde nur im Vorderhirn ermittelt. In allen Proben konnte eine, wenn auch sehr geringe, konstitutive IL-6 mRNA-Expression im Gehirn gemessen werden, wobei die Werte zwischen 14 und 366 Kopien lagen (Abb. 30; Tab. 54; Tab. 55). Die dreifaktorielle Varianzanalyse der mRNA-Werte ergab eine Beeinflussung des Transgenstatus und der BDV-Infektion auf die IL-6 Expression, welche durch den nachgeschalteten paarweisen Vergleich näher untersucht wurden (Tab. 34; Tab. 57). Dabei ergaben sich bereits signifikant höhere Werte bei den tg+/+ nicht infizierten Mäusen im Vergleich zu den ntg Tieren am Tag 21 p.i. (p=0,0160). Durch die BDV-Infektion kam es in der Gruppe der tg+/+

Tiere am Tag 21 p.i. (p=0,0126) und am Tag 42 p.i. (p=0,0016) zu einer signifikanten Erhöhung im Vergleich zu den jeweiligen nicht infizierten Mäusen. In der Gruppe der BDV-infizierten Tiere waren signifikant höhere Werte am Tag 21 p.i. bei den tg+/+ im Vergleich zu den ntg (p=0,0006) und tg+/- (p=0,0287) Mäusen sowie am Tag 42 p.i. bei den tg+/- (p=0,0112) und den tg+/+ (p=0,0008) vergleichend zu den ntg Mäusen zu messen.

Zusammenfassend betrachten kam es durch die BDV-Infektion nur bei den tg+/+ Tieren zu einer signifikanten Erhöhung im Vergleich zu den entsprechenden nicht infizierten Tieren.

Tab. 34: Dreifaktorielle Varianzanalyse der IL-6 mRNA-Werte

Tag: Vergleich zwischen den Infektionstagen 21 und 42 post infectionem, BDV: Vergleich zwischen nicht infizierten und BDV-infizierten Mäusen, Transgen: Vergleich der 3 verschiedenen Transgenstatus (nicht transgen, heterozygot- oder homozygot transgen), hellgrau unterlegte Felder: signifikante Unterschiede

IL-6

Abb. 30: Quantifizierung der IL-6 mRNA-Werte aus dem Vorderhirn

Kopienzahl mittels housekeeping Genen auf 25 ng eingesetzte RNA-Menge normalisiert, IL-6: Interleukin-6, p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, geometrischer Mittelwert, Fehlerbalken: Streufaktor, *: p<0,05, **: p<0,01, *: Vergleich zwischen tg+/+ nicht infizierten und tg+/+ BDV-infizierten Tieren am Tag 21 p.i., **: Vergleich zwischen tg+/+ nicht infizierten und tg+/+ BDV-infizierten Tieren am Tag 42 p.i.

4.5.8 IL-12 mRNA

Die Expression von IL-12 wurde nur im Vorderhirn ermittelt. Dabei konnte nur bei drei Tieren eine Amplifikation gemessen werden. Hierbei handelte es sich um ein homozygotes transgenes, BDV-infiziertes Tier am Tag 21 p.i. (49,83 Kopien), ein homozygotes transgenes, infiziertes Tier am Tag 42 p.i. (21,38 Kopien) und ein homozygotes transgenes, BDV-infiziertes Tier am Tag 42 p.i. (72,39 Kopien; Abb. 31; Tab. 54; Tab. 55). Bei der Untersuchung der IL-12 mRNA-Expression konnte nur im Globaltest (Kruskal-Wallis-Test) ein signifikanter Einfluss des transgenen Status im Sinne einer Erhöhung festgestellt werden

(p=0,0418; Abb. 57). Der paarweise Vergleich zwischen nicht transgen und heterozygot bzw.

homozygot sowie zwischen heterozygot und homozygot blieb ohne weitere Signifikanzen.

IL-12

0 10 20 30 40 50 60 70 80

ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+ ntg tg+/- tg+/+

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

nicht infizierte Mäuse

BDV-infizierte Mäuse

21 Tage p.i. 42 Tage p.i.

Kopienzahl (normalisiert)

Abb. 31: Quantifizierung der IL-12 mRNA-Werte aus den rostralen Gehirnanteilen

Kopienzahl mittels housekeeping Genen auf 25 ng eingesetzte RNA-Menge normalisiert, IL-12: Interleukin-12, p.i.: post infectionem, ntg: nicht transgen, tg+/-: heterozygot transgen, tg+/+: homozygot transgen, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum

Im Dokument Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Seite 107-115)