Die Immunhistologie diente dem Nachweis BDV-spezifischer Proteine sowie der Beurteilung der Astrogliose im Gehirn infizierter Tiere und der Kontrolltiere.
3.3.1 Antikörper und Seren
Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Verdünnung der Primärantikörper in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS; 9.4.1) mit einem Zusatz von 1%igem bovinem Serumalbumin (BSA). In Einzelfällen wurde PBS mit 20%igem Schweinenormalserum (SNS; 9.4.1) zur Verdünnung eingesetzt (Tab. 3).
3.3.1.1 BDV-Antikörper
Für den immunhistologischen Nachweis BDV-spezifischer Proteine standen spezifische Antikörper für das Nukleoprotein (BDV-N), Phosphoprotein (BDV-P), X-Protein (BDV-X), Matrixprotein (BDV-M) und Glykoprotein (BDV-GP) zur Verfügung.
Der gegen das BDV-N gerichtete monoklonale Antikörper (Bo18) und die polyklonalen Antikörper gegen das BDV-P, BDV-X, BDV-M und BDV-GP wurden bei allen Tieren verwendet. Da bei natürlich BDV-infizierten Pferden das Vorkommen einer BDV-Variante beschrieben ist (HERDEN et al., 1999), die aufgrund einer Epitopvarianz durch Bo 18 nicht detektiert wird, wurde bei BDV-infizierten Tieren, die unter Verwendung des monoklonalen Bo18 keine spezifische immunhistologische Reaktion aufwiesen, ein weiterer polyklonaler BDV-N-spezifischer Antikörper (p38) eingesetzt. Von den Tieren in dieser Studie, auf die dieses Kriterium zutraf (vgl.
4.3.1.1) lagen bereits aus früheren Untersuchungen immunhistologische p38-gefärbte Gewebeschnitte vor, die freundlicherweise von Frau Prof. Christiane Herden zur Verfügung gestellt wurden.
Bo 18 wurde freundlicherweise von Frau Dr. Sibylle Herzog, Institut für Virologie der Justus-Liebig-Universität, Gießen, zur Verfügung gestellt.
Die polyklonalen Antikörper gegen das BDV-N, BDV-P, BDV-X, BDV-M und BDV-GP wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Jürgen A. Richt, Kansas State University, Manhattan, USA, zur Verfügung gestellt.
3.3.1.2 Saures Gliafaserprotein (GFAP)-Antiserum
Der Nachweis des zytoplasmatischen Gliafaserproteins (glial fibrillary acidic protein, GFAP) in Astrozyten erfolgte mit Hilfe eines polyklonalen Rinder-Gliafaserprotein-Antiserums aus dem Kaninchen (DakoCytomation GmbH, Hamburg).
Eine Übersicht über die Antikörper aus 3.3.1.1 und 3.3.1.2 sowie Angaben zu den verwendeten Verdünnungsstufen sind in Tab. 3 zusammengestellt.
3.3.1.3 Kontrollseren
Als Kontrolle für den monoklonalen Antikörper gegen das BDV-N wurde Aszites nicht immunisierter Balb/cJ-Mäuse (Biologo, Kronshagen) eingesetzt. Für die polykonalen Antikörper wurde das Serum gesunder Kaninchen (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) als Negativkontrolle verwendet, das nach dreistündiger Sedimentation durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 1500 x g gewonnen wurde.
3.3.1.4 Sekundäre Antiseren
Bei der Verwendung des monoklonalen Antikörpers Bo18 stand ein biotinilierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratories Inc., Burlingame) als Zweitantikörper zur Verfügung. Bei Verwendung der polyklonalen Primärantikörper wurde ein biotinilierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Vector Laboratories Inc., Burlingame) als Zweitantikörper verwendet (Tab. 3). Sowohl der Ziege-anti-Maus-, als auch der Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Die Verdünnung erfolgte hierbei mit PBS.
3.3.1.5 Blockseren
Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen im Gewebe wurde standardmäßig Ziegennormalserum (ZS) in einer Verdünnung von 1:5 verwendet. Das Serum wurde von gesunden Tieren der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gewonnen (9.4.1).
Tab. 3: Spezifität, Klon, Vorbehandlung und Verdünnung der verwendeten
des Primärantikörpers Verdünnung Puffer Blocking-Serum
Kaninchen-anti-Rind 1:1000 PBS mit
20% SNS ZS Ziege-anti-Kaninchen
ZS: Ziegennormalserum; PBS: phosphate buffered saline; BSA: bovines Serumalbumin; GFAP:
saures Gliafaserprotein; BDV-N: Nukleoprotein; BDV-X: X-Protein; BDV-P: Phosphoprotein; BDV- M:
Matrixprotein; BDV-GP: Glykoprotein; in Klammern ( ): Name des Antikörpers;
3.3.2 Durchführung der Immunhistologie (ABC-Methode)
Der Nachweis der Antigene erfolgte an Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Gehirnschnitten von natürlich BDV-infizierten Pferden (vgl. 3.1). Hierfür wurden Paraffinschnitte mit einer Dicke von 4 µm angefertigt und auf SuperFrost® Plus Objektträger aufgezogen. Soweit nicht anders aufgeführt, erfolgten die einzelnen Arbeitsschritte bei Raumtemperatur. Eine Vorbehandlung zur Demaskierung der Antigene war bei keinem der verwendeten Antikörper erforderlich. Die immunhistologischen Färbungen wurden in Anlehnung an die von (HSU et al., 1981;
HERDEN et al., 2000; WERNER-KEIŠS et al., 2008) beschriebene Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Methode wie folgt durchgeführt:
1. Entparaffinierung der Schnitte:
2 x 5 Minuten in Roti®Clear, danach 5 Minuten in Isopropanol und 3 Minuten in 96%igem Ethanol
2. Hemmung der endogenen Peroxidase mit 197 ml Methanol + 3 ml 30%igem H2O2 für 30 Minuten
3. Waschen der Schnitte in PBS (9.4.1), 3 x 5 Minuten
4. Auftragen des Blockserums (Tab. 3) zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen, Verdünnung 1:5. Die Schnitte werden in feuchte Kammern verbracht und das Gewebe mit dem DAKO-Pen® umrahmt.
Anschließend werden jeweils 200 µl Blockserum pro Objektträger (OT) aufgetragen und für 20 Minuten inkubiert
5. Auftragen von jeweils 200 µl des entsprechenden verdünnten Primärantikörpers (Tab. 3) bzw. des Kontrollserums pro OT und Inkubation über Nacht bei 4°C im Kühlschrank
6. Schnitte für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur erwärmen.
7. Waschen der Schnitte in PBS, 3x 5 Minuten
8. Auftragen von jeweils 200 µl des entsprechenden Sekundärantikörpers (Tab. 3) und Inkubation der Schnitte für 30 Minuten
9. Waschen der Schnitte in PBS, 3x 5 Minuten
10. Auftragen von jeweils 200 µl Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Elite Standard (PK-6100), Vector Laboratories Inc.) und Inkubation der Schnitte für 30 Minuten
(Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Minuten vor Gebrauch!) 11. Waschen der Schnitte in PBS, 3 x 5 Minuten
12. Umsetzen der Schnitte in Glasküvette und Inkubation in 3,3´-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Lösung (9.4.1) für 5 Minuten auf dem Magnetrührer
13. Waschen der Schnitte 2 x 5 Minuten in PBS, anschließend 5 Minuten in Leitungswasser
14. Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer, 20 – 40 Sekunden, je nach gewünschter Farbintensität
15. Bläuen der Schnitte für 10 Minuten unter fließendem Leitungswasser
16. Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe: jeweils 1 x 3 Minuten in 50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol, anschließend 1 x 5 Minuten in Isopropanol und 2 x 5 Minuten in Essigsäurebutylester (EBE)
17. Maschinelles Eindecken der Schnitte mit Hilfe eines Eindeckautomaten (Promounter RCM 2000)
3.3.3 Kontrollen der Immunhistologie
Die Spezifität der immunhistologischen Reaktionen wurde bei sämtlichen Untersuchungen anhand mitgeführter Negativ- und Positivkontrollen überprüft. Als Negativkontrolle dienten Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte, die mit den jeweiligen Kontrollseren (3.3.1.3) anstelle des Primärantikörpers inkubiert wurden. Zur positiven Kontrolle der Immunreaktion der gegen die BDV-spezifischen Proteine gerichteten Antikörper wurden Schnitte mit dem Gewebe experimentell BDV-infizierter Lewis-Ratten, bei denen der BDV-Antigennachweis aus früheren Untersuchungen bekanntermaßen positiv war, mit dem entsprechenden BDV-Antikörper inkubiert.
3.3.4 Auswertung der Immunhistologie
Generell wurden braune DAB-Präzipitate, die sich in einer Ebene mit dem Gewebeschnitt befanden und in den Negativkontrollen nicht vorhanden waren, als positiv gewertet. Die Bewertung der immunhistologischen Reaktionsstärke erfolgte nach semiquantitativen Kriterien mittels Dokumentation der positiven Zellen pro Gesichtsfeld. Hierbei wurden Reaktionen im Gyrus dentatus und in den CA-Regionen des Ammonshorns sowie im angrenzenden Cortex cerebri separat erfasst. Im Fall der BDV-spezifischen Antikörper wurde zusätzlich zwischen spezifischen Reaktionen in Neuronen, Glia- und Entzündungszellen sowie deren intranukleärer und zytoplasmatischer Lokalisation unterschieden. In Neuronen wurden zytoplasmatische Reaktionen zudem weiterführend nach ihrer Lokalisation im Perikaryon bzw. in den zellulären Fortsätzen unterteilt und in Bezug auf intranukleäre Reaktionen zwischen einer diffusen Verteilung und einem granulären, teils punktförmigen Erscheinungsbild unterschieden.
Die semiquantitative Auswertung des Nachweises der BDV-spezifischen Proteine erfolgte bei 200-facher Gesamtvergrößerung nach folgendem Schema:
- = kein Nachweis von BDV-spezifischem Protein + = geringgradige Anzahl positiver Zellen:
1-30 positive Zellen/Gesichtsfeld, ++ = mittelgradige Anzahl positiver Zellen:
31-60 positive Zellen/Gesichtsfeld, +++ = hochgradige Anzahl positiver Zellen
> 60 positive Zellen/Gesichtsfeld,
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden. Diese wurden (+), +(+) oder ++(+) bezeichnet.
Die semiquantitative Auswertung der intrazellulären Verteilung BDV-spezifischer Proteine in Neuronen wurde bei 200-facher Gesamtvergrößerung nach folgendem Schema durchgeführt:
- = keine der positiven Neuronen zeigen eine BDV-spezifische Reaktion im Nukleus
+ = geringgradige nukleäre Reaktion:
ca. 1-33% der positiven Neuronen zeigen eine BDV-spezifische Reaktion im Nukleus
++ = mittelgradige nukleäre Reaktion:
ca. 34-66% der positiven Neuronen zeigen eine BDV-spezifische Reaktion im Nukleus
+++ = hochgradige nukleäre Reaktion:
ca. 67-100% der positiven Neuronen zeigen eine BDV-spezifische Reaktion im Nukleus
Für die Erfassung der BDV-spezifischen zytoplasmatischen Reaktion im Perikaryon und in den zellulären Fortsätzen von Neuronen gilt das genannte Schema entsprechend.
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden. Diese wurden (+), +(+) oder ++(+) bezeichnet.
Die immunhistologische Untersuchung zum Nachweis von GFAP erfolgte ebenfalls nach semiquantitativen Kriterien bei 200-facher Gesamtvergrößerung nach folgendem Schema:
+ = < 110 positive Zellen/Gesichtsfeld
++ = 110-180 positive Zellen/Gesichtsfeld, einige Astrozyten mit deutlich vergrößertem Zellkern
+++ = >180 positive Zellen/Gesichtsfeld, einige Astrozyten mit deutlich vergrößertem Zellkern
In einigen Fällen waren Übergänge zwischen dieser Einteilung vorhanden. Diese wurden (+), +(+) oder ++(+) bezeichnet.
3.3.5 Statistische Datenanalyse der Immunhistologie
Die statistische Aufarbeitung der bei den immunhistologischen Untersuchungen erhobenen Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die nach semiquantitativen Kriterien ausgewerteten Untersuchungsergebnisse wurden unter Verwendung des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999) auf Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-Wallis-Test verglichen. Anschließend wurde als nicht-parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon Zwei Stichproben-Test zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.