Proteine des Borna Disease Virus (BDV)

2.2.5.1 Nukleoprotein

Die erste Transkriptionseinheit enthält das ORF I, das für das virale Nukleoprotein (BDV-N) kodiert. Die alternative Nutzung von zwei im Leseraster befindlichen Translations-Initiationskodons, die 13 Aminosäuren voneinander entfernt liegen, führt zu einer Expression von zwei Isoformen des Nukleoproteins mit einem Molekular-gewicht von 40 kDa (p40) bzw. 38 kDa (p38) (PYPER u. GARTNER, 1997). Lediglich die p40-Isoform besitzt an ihrem N-terminalen Ende ein Kern-Lokalisierungs-Signal (nuclear localization signal, NLS), das als karyophile Sequenz für die Translokation des Proteins in den Zellkern verantwortlich ist (Abb. 4). Des Weiteren werden zwei N-terminal gelegene hydrophobe Interaktionsdomänen beschrieben, die eine Bindung beider Isoformen mit BDV-P ermöglichen (BERG et al., 1998). Beide Isoformen weisen außerdem ein Leucin-reiches Kern-Export-Signal (nuclear export signal, NES) auf, das mit einer dieser Interaktionsdomänen überlappt und die TELEISSI-Region, welche das immundominante Epitop des BDV-N für CD8+ T-Zellen bei der Maus darstellt, enthält (KOBAYASHI et al., 2001; SCHAMEL et al., 2001).

Generell sind Nukleoproteine der NNS-RNA-Viren essentieller Bestandteil des Nukleokapsids (THOMAS et al., 1985; CALAIN u. ROUX, 1993; BHELLA et al., 2002) und funktioneller Bestandteil des viralen Polymerase-Komplexes. BDV-N stellt

aufgrund des Pendelns zwischen Zytoplasma und Nukleus (nucleocytoplasmatic shuttling) einen wichtigen Faktor beim Transport des viralen RNP aus dem Kern dar (KOBAYASHI et al., 2001).

In vivo ist BDV-N bei experimentell infizierten Lewis-Ratten und TNFα-transgenen Mäusen disseminiert im Gehirn nachweisbar und stellt das am höchsten exprimierte virale Protein dar. Es wurde sowohl in Neuronen, als auch in Astrozyten, Oligoden-drozyten und Ependymzellen detektiert. Im Unterschied zu in vitro-Untersuchungen, in denen BDV-N lediglich im Zellkern infizierter Zellen nachweisbar war (PYPER u.

GARTNER, 1997), lag BDV-N bei diesen Ratten und Mäusen sowohl im Nukleus als auch im Perikaryon und den Fortsätzen infizierter Zellen vor (HERDEN, 1997;

HERDEN et al., 2000; KRAMER, 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008). Natürlich infizierte Pferde weisen in Bezug auf Zelltropismus und intrazelluläre Verteilung des BDV-N eine vergleichbare Expression auf (HERDEN et al., 1999).

2.2.5.2 Phosphoprotein

Das Phosphoprotein (BDV-P) entsteht aus einer bicistronischen mRNA, deren Trans-kription am zweiten Initiationssignal (S2) beginnt, und die neben dem Phosphopro-tein auch das X-ProPhosphopro-tein codiert. Wie beim BDV-N bereits beschrieben, existieren auch von BDV-P zwei Isoformen, die durch alternative Nutzung zweier im Leseraster befindlichen Translations-Initiationskodons entstehen und ein Molekulargewicht von 24 kDa (p24) bzw. 16 kDa (p16) besitzen (KOBAYASHI et al., 2000). Die p24-Isoform weist zwei unabhängige, Prolin-reiche NLS auf, von denen eins am N- und das andere am C-terminalen Ende lokalisiert ist (SHOYA et al., 1998). Im Unter-schied zu der p24-Isoform zeichnet sich die p16-Isoform durch Fehlen der ersten 55 Aminosäurereste und demzufolge auch durch Fehlen des N-terminalen NLS aus, das in diesem Bereich lokalisiert ist (KOBAYASHI et al., 2000). BDV-P verfügt außerdem über fünf weitere Interaktionsdomänen (Abb. 4). Dieses sind eine N- und BDV-L-Interaktionsdomäne, sowie eine Homo-Oligomerisationsdomäne am C-Terminus und eine BDV-X- und BDV-M-bindende Domäne am N-Terminus (SCHWEMMLE et al., 1998; SCHNEIDER et al., 2004; CHASE et al., 2007). Des Weiteren wurde ein

potentielles NES im Bereich der Homo-Oligomerisationsdomäne identifiziert (YANAI et al., 2006).

Phosphoproteine anderer NNS-RNA-Viren stellen essentielle Kofaktoren für die virale Polymerase dar (BANERJEE et al., 1991; HORIKAMI et al., 1992). Im Fall des BDV-P werden aufgrund der möglichen Interaktion mit BDV-N, BDV-L und BDV-X, sowie des potentiellen aktiven nukleozytoplasmatischen Transportes mit Hilfe von NLS bzw. NES ähnliche Funktionen angenommen. Des Weiteren wurde bewiesen, dass die Kofaktoraktivität des BDV-P durch Phosphorylierung negativ beeinflusst wird (SCHMID et al., 2007). BDV-P-Oligomere sollen zudem eine Gerüstfunktion innehaben, welche die RNA-Polymerase in unmittelbare Nähe der viralen RNA führt und somit die RNA-Synthese einleitet (SCHNEIDER et al., 2004). Ein ähnlicher Mechanismus wurde bereits beim Sendai-Virus beschrieben (CURRAN, 1998).

In vitro ist BDV-P vorwiegend im Nukleus, aber auch im Zytoplasma infizierter Zellen nachweisbar (KOBAYASHI et al., 1998, 2003; SCHWEMMLE et al., 1998; SHOYA et al., 1998). Bei experimentell infizierten Lewis-Ratten liegt BDV-P disseminiert im Ge-hirn vor. Es ist hier wie bei natürlich infizierten Pferden auch sowohl in Nukleus, als auch in Zytoplasma, Fortsätzen und Neuropil von Neuronen, Astrozyten, Oligoden-drozyten und Ependymzellen nachweisbar (HERDEN, 1997; HERDEN et al., 1999).

2.2.5.3 X-Protein

Das X-Protein (BDV-X) ist ein Nicht-Strukturprotein, das mit einer Molekularmasse von ca. 10 kDa (p10) das kleinste beschriebene BDV-spezifische Protein darstellt.

Das BDV-X-kodierende ORF x1 startet 49 Nukleotide stromaufwärts des ORF II und überlappt dessen N-terminales Ende in einem unterschiedlichen Leseraster (WEHNER et al., 1997; TOMONAGA et al., 2002). BDV-X verfügt an Aminosäure-position 8-15 über eine Leucin-reiche Interaktionsdomäne, die eine direkte Bindung an BDV-P ermöglicht (Abb. 4). Die BDV-X-Interaktionsdomäne weist darüber hinaus Ähnlichkeit mit einem NES auf (WOLFF et al., 2000) und ermöglicht eine Kolokalisation mit Mitochondrien (mitochondrial targeting) (POENISCH et al., 2009).

In vitro bindet BDV-X über eine karyophile Aminosäuresequenz an seinem N-Terminus an den zellulären NLS-Rezeptor Importin α und gelangt höchstwahrscheinlich auf diesem Weg in den Nukleus (WOLFF et al., 2002).

Einige NNS-Viren kodieren Hilfsproteine, die nicht mittelbar für die virale RNA-Synthese benötigt werden, aber an der Regulation verschiedener Phasen im viralen Vermehrungszyklus beteiligt sind (NAGAI u. KATO, 1999; NEUMANN et al., 2002).

BDV-X fungiert über Interaktion mit BDV-P als Regulationsfaktor des viralen Poly-merase-Komplexes (2.2.6). Aufgrund von in vitro-Untersuchungen werden BDV-X zudem essentielle Funktionen bei der Virusreplikation und der Etablierung der viralen Persistenz zugeschrieben (POENISCH et al., 2007, 2009).

In vitro liegt BDV-X vorwiegend im Nukleus, in Kolokalisation mit der p38-Isoform von BDV-N, vor (SCHWARDT et al., 2005), während die geringere zytoplasmatische Fraktion fast ausschließlich mit Mitochondrien kolokalisiert ist (POENISCH et al., 2009). Bei natürlich und experimentell infizierten Tieren hingegen, ist BDV-X vor allem im Zytoplasma nachweisbar (WEHNER et al., 1997; HERDEN et al., 1999).

2.2.5.4 Matrixprotein

Das BDV zeichnet sich innerhalb der Mononegavirales durch das kleinste Matrix-protein (BDV-M, p16) aus. Bei dem vom ORF III kodierten BDV-M handelt es sich entgegen früheren Berichten, die das BDV-M als an der Virusoberfläche lokalisiertes Glykoprotein darstellten, um ein nicht glykosiliertes Matrixprotein, das mit der inneren Schicht der Hüllmembran des Virions assoziiert ist (KRAUS et al., 2001).

Matrixproteine behüllter RNA-Viren zeichnen sich durch die Interaktion mit dem Ribonukleoprotein einerseits und viruskodierten Proteinen der Hüllmembran andererseits als ein wichtiger Faktor bei der Freisetzung reifer Viruspartikel aus (MARTIN u. HELENIUS, 1991; GAROFF et al., 1998).

Für das BDV-M wird eine ähnliche Beteiligung an Viruszusammensetzung und -freisetzung angenommen (KRAUS et al., 2001, 2005).

In Untersuchungen mit rekombinantem BDV-M (rBDV-M) wurde eine Homo-Oligome-risation von BDV-M unter Ausbildung stabiler Tetramere und Tendenz zur Formation hochmolekularer, zweidimensionaler Gitterstrukturen nachgewiesen. NEUMANN et al. (2009) zeigten des Weiteren, dass BDV-M in der Lage ist, Lipidmembranen und RNA simultan zu binden. Eine nukleäre Kolokalisation des M mit N, BDV-P und BDV-X und dem viralen Genom sowie der Nachweis einer spezifischen

Interaktion mit BDV-P und RNA macht außerdem deutlich, dass es sich bei BDV-M um eine wesentliche Komponente des viralen RNPs handelt. BDV-M könnte folglich, durch Ausbildung einer Gerüststruktur an der inneren Hüllmembran mit gleichzeitiger Bindung viraler RNA, eine zentrale Rolle in der Viruszusammensetzung innehaben (KRAUS et al., 2005).

Die Interaktion des BDV-M mit dem RNP scheint die Polymeraseaktivität nicht zu beeinflussen, was als ein möglicher Regulationsmechanismus für die Freisetzung maturer Viruspartikel angesehen wird (vgl. 2.3) (CHASE et al., 2007).

In vitro-Untersuchungen ergaben, dass BDV-M sowohl im Zytoplasma, als auch im Nukleus infizierter Zellen zu finden ist. In vivo ist BDV-M bei experimentell infizierten Lewis-Ratten in vor allem in Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen nachweisbar und ist in diesen Zellen vorwiegend im Zytoplasma, in Oligodendrozyten und Ependymzellen vereinzelt auch im Nukleus lokalisiert (WERNER-KEIŠS et al., 2002; WERNER-KEIŠS, 2006). Bei experimentell infizierten TNFα-transgenen Mäusen wurde BDV-M disseminiert im Gehirn, sowohl im Zytoplasma und den Fortsätzen von Neuronen, als auch im Zytoplasma von Astrozyten und Oligodendrozyten detektiert (KRAMER, 2006). Über Zelltropismus und intrazelluläre Verteilung des BDV-M bei natürlich infizierten Pferden sind bis dato keine detaillierten Untersuchungen bekannt.

2.2.5.5 Glykoprotein

Der in der Transkriptionseinheit III gelegene ORF IV kodiert für das einzige BDV-spezifische Glykoprotein (BDV-GP). Das BDV-GP besteht aus einer Polypetidkette mit insgesamt 503 AS, die 13 potentielle Glykosilierungsstellen aufweist und im nicht glykosilierten Zustand ein Molekulargewicht von 56 kDa (p56) besitzt. Dieses nicht glykosilierte p56-Vorläuferprotein inseriert als Typ I Membranprotein im endoplasmatischen Retikulum (ER). Hier findet eine N-Glykosilierung statt, wodurch die molekulare Masse des BDV-GP auf 94 kDa (gp94) erhöht wird (SCHNEIDER et al., 1997a). Die N-Glykosilierung des BDV-GP stellt einen wichtigen Faktor für die Stabilität der Proteinstruktur und die Maskierung antigener Epitope dar (GONZALES-DUNIA et al., 1997; RICHT et al., 1998; EICKMANN et al., 2005). Im weiteren Verlauf der Glykoproteinreifung gelangen diese N-glykosilierten Proteine, abgesehen von

einem gewissen Anteil, der im ER und an der Kernmembran verbleibt, im Rahmen der normalen Biosynthese in den Golgiapparat. Bereits im ER bzw. im cis-Golgi-Apparat erfolgt eine proteolytische Spaltung des gp94 durch die zelluläre, Subtilisin-ähnliche Protease Furin an einer multibasischen Konsensussequenzen bei Aminosäure 249 (Arginin) (GONZALES-DUNIA et al., 1997, 1998; RICHT et al., 1998; EICKMANN et al., 2005). Aus dieser proteolytischen Spaltung des gp94 gehen zwei Untereinheiten hervor, die dem C-terminalen Ende (BDV-GP-C) und dem N-terminalen Ende (BDV-GP-N) des gp94 entsprechen. Die C-terminale Untereinheit BDV-GP-C besitzt eine Molekülmasse von 43 kDa (gp43). Die zweite Untereinheit, BDV-GP-N, stellt ein stark glykosiliertes Protein mit einer Molekülmasse von 51 kDa (gp51) dar (KIERMAYER et al., 2002).

Bei Viren mit Lipidhülle stellen Glykoproteine einen wesentlichen Faktor beim Virus-eintritt in die Wirtszelle dar. Sie vermitteln einerseits die Virusadsorption (attachment) durch Interaktion mit zellulären Rezeptoren und sind andererseits an der Penetration durch Fusion der Virusmembran mit der zellulären Membran beteiligt. Im Fall des BDV erwies sich gp51 verantwortlich für die initiale Rezeptorbindung, während gp43 in der Virushülle verankert ist und die pH-abhängige Fusion mit der Wirtsmembran einleitet (SCHNEIDER et al., 1997a; GONZALES-DUNIA et al., 1998; PEREZ et al., 2001; MAKINO et al., 2009). Diese Membranfusion setzt eine vorherige proteolytischen Spaltung des gp94 voraus. Die Spaltung des BDV-GP stellt daher einen essentiellen Vorgang für seine biologische Aktivität dar (RICHT et al., 1998).

Lediglich BDV-GP-C konnte bislang auf der Oberfläche infizierter Zellen nachgewiesen werden (GONZALES-DUNIA et al., 1997; EICKMANN et al., 2005).

Entgegen früheren Berichten sind ausschließlich die Spaltprodukte gp43 und gp51, nicht aber das ungespaltene gp98 in aufgereinigten BDV-Partikeln vorhanden (EICKMANN et al., 2005).

In vivo ist BDV-GP bei experimentell infizierten Lewis-Ratten und TNFα-transgenen Mäusen lediglich vereinzelt, ausschließlich im Zytoplasma und in den Fortsätzen von Neuronen nachweisbar (KRAMER, 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008). Bei natürlich infizierten Pferden ist BDV-GP in weniger als 50% der Fälle detektierbar und liegt ausschließlich im Zytoplasma von Neuronen vor (HERDEN et al., 1999).

NLS NES

Abb. 4: Schematische Darstellung des BDV-Nukleo-, Phospho- und X-Proteins und deren Interaktionsdomänen (vgl. 2.2.5.1 - 2.2.5.3)

A: BDV-N existiert in zwei Isoformen (p40 und p38), die sich durch das Fehlen von 13 N-terminalen Aminosäuren (AS) unterscheiden. Folglich besitzt nur p40 das N-terminale NLS. Die übrigen Inter-aktionsdomänen der p40-Isoform gelten für p38 entsprechend und sind hier nicht extra dargestellt.

B: BDV-P existiert in zwei Isoformen (p24 und p16), die sich durch das Fehlen von 55 N-terminalen AS unterscheiden. Folglich fehlen der p16- gegenüber der p24-Isoform ein N-terminal lokalisiertes NLS sowie die MBS am N-Terminus. Die übrigen Interaktionsdomänen der p24-Isoform gelten für die p16 entsprechend, sind hier jedoch nicht extra dargestellt.

C: BDV-X verfügt an AS-Position 8-15 über eine Leucin-reiche Interaktionsdomäne, die eine direkte Bindung an BDV-P ermöglicht. Diese Interaktionsdomäne weist darüber hinaus Ähnlichkeit mit einem NES auf und ermöglicht mitochondrial targeting. Des Weiteren verfügt BDV-X über ein N-terminales NLS.

NLS: nuclear localization signal; (pot.) NES: (potentielles) nuclear export signal; NBS: BDV-N-binding site; PBS: BDV-P-binding site, XBS: BDV-X-binding site; MBS: BDV-M-binding site; LBS: BDV-L-binding site; self BS: Homo-Oligomerisationsdomäne; BDV-L-binding site: bindende Domäne; schwarze Zahlen: Aminosäurepositionen

2.2.5.6 RNA-abhängige RNA-Polymerase

Das ebenfalls in Transkriptionseinheit III gelegene ORF V kodiert die virale RNA ab-hängige RNA-Polymerase (large protein, BDV-L). Das 190 kDa große BDV-L (p190) besitzt mindestens 40 potentielle Phosphorylierungsstellen, weshalb eine Regulation der BDV-L-Funktion über Phosphorylierung vermutet wird (WALKER et al., 2000).

BDV-L interagiert wahrscheinlich über eine N-terminal lokalisierte Region mit BDV-P.

Wie der Transfer von neu synthetisiertem BDV-L vom Zytoplasma in den Nukleus, den Ort der Virusreplikation, erfolgt, ist nicht abschließend geklärt. Einerseits wird ein nukleärer Transfer über ein potentielles NLS innerhalb des BDV-L diskutiert, anderer-seits ist ein nukleärer Transport über Interaktion mit P nicht auszuschließen (WALKER u. LIPKIN, 2002; SCHNEIDER et al., 2003). Die katalytische Domäne des BDV-L ist stark konserviert und mit denen von Polymerasen anderer Vertreter der Mononegavirales vergleichbar (BRIESE et al., 1994; TOMONAGA et al., 2002).

WALKER et al. (2000) identifizierten BDV-L in vitro vorrangig im Nukleus infizierter und transfizierter Zellen. Die regionale, zelluläre und intrazelluläre Verteilung des BDV-L in vivo ist derzeit nicht bekannt.