L-Protein-spezifische +ssRNA

Zur Detektion L-Protein-spezifischer +ssRNA wurde zum einen eine Intron II überspannenden, BDV-L-spezifischen antisense-Sonde (BDV-L 445) eingesetzt, zum anderen eine weitere antisense-Sonde (BDV-L 459), die einen BDV-L-spezifischen antigenomischen RNA-Abschnitt im Bereich des hypothetischen Terminationssignal (t6) detektiert (3.4). Somit wurden mittels In-situ-Hybridisierung zwei unterschiedliche +ssBDV-L Abschnitte erfasst, die im Folgenden als +ssBDV-L 445 bzw. +ssBDV-L 459 bezeichnet werden.

+ssBDV-L 445-spezifische Reaktionen waren bei 78% (18/23) +ssBDV-L 459-spezifische Reaktionen bei 87% (20/23) der untersuchten Tiere unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit vorwiegend im Gyrus dentatus, aber auch in den CA-Regionen des Ammonshorns und dem angrenzenden Cortex cerebri nachweisbar.

Spezifische Signale lagen hierbei hauptsächlich in den Neuronen, vereinzelt auch in Astrozyten und Oligodendrozyten vor. Bei keinem der Tiere war eine positive Reaktion in Endothel- oder infiltrierten Entzündungszellen zu beobachten.

In Gruppe I lag die Zahl +ssBDV-L 445-positiver Zellen vorwiegend im gering- bis mittelgradigen Wertungsbereich (Nr. 7, 12, 19, 21, 23). Davon abweichend wies Nr. 1 eine mittel- bis hochgradige Anzahl positiver Zellen, Nr. 18 dagegen nur vereinzelt positive Zellen auf. Bei Nr. 9 waren keine +ssBDV-L 445-spezifischen Signale auffindbar.

Auf intrazellulärer Ebene zeichneten sich alle Tiere dieser Gruppe durch eine Dominanz nukleärer +ssBDV-L 445-spezifischer Reaktionen in den Neuronen aus, die mit vereinzelten (Nr. 18, 19, 23), geringgradigen (Nr. 7, 12) oder gar keinen (Nr.

1, 21) zytoplasmatischen Reaktionen im Perikaryon einhergingen. Darüber hinaus waren bei einem Pferd (Nr. 19) geringgradige Reaktionen in den zellulären Fortsätzen zu detektieren. Innerhalb der Neuronen stellten sich die intranukleären Reaktionsprodukte bei allen Tieren fast ausschließlich in granulärer, teils punktförmiger Verteilung dar.

In Astrozyten und Oligodendrozyten dominierten nukleäre +ssBDV-L 445-spezifische Reaktionen. Nukleäre Reaktionen wiesen hierbei überwiegend eine diffuse intranukleäre Verteilung auf.

Die Tiere der Gruppe II wiesen bei der Anzahl +ssBDV-L 445-positiver Zellen eine große Varianz auf. Einige Tiere zeigten lediglich vereinzelt positive Zellen (Nr. 2, 4, 15), während andere Tiere eine gering- bis mittelgradige (Nr. 8, 17), mittelgradige (Nr. 6) oder hochgradige (Nr. 13, 20) Zahl aufwiesen. Bei Pferd Nr. 11 waren dagegen keine +ssBDV-L 445-positive Zellen nachzuweisen. In Bezug auf Tier Nr.

15 und 17 ist zu beachten, dass die Gewebeproben dieser Tiere aufgrund von Artefaktbildung (vgl. 4.1) nur eingeschränkt zu beurteilen waren.

Ähnlich wie bei den Tieren der Gruppe I dominieren bei der intrazellulären Verteilung +ssBDV-L 445-spezifischer Reaktionsprodukte in den Neuronen intranukleäre Signale in Verbindung mit vereinzelten (Nr. 6), geringgradigen (Nr. 8, 13), mittelgradigen (Nr. 20) oder gar keinen (Nr. 2, 4, 15, 17) zytoplasmatischen Reaktionen im Perikaryon. Nr. 20 wies darüber hinaus vereinzelte Signale in den zellulären Fortsätzen auf. Auch in dieser Gruppe lagen in Neuronen hauptsächlich granuläre, teils punktförmige intranukleäre Reaktionsprodukte vor.

Positive Signale in Astrozyten und Oligodendrozyten lagen ausschließlich im Nukleus, vorwiegend diffus verteilt, vor.

Bei Pferd Nr. 22 waren keine +ssBDV-L 445-spezifischen Signale zu detektieren.

In Gruppe III waren +ssBDV-L 445-positive Zellen lediglich bei drei Tieren vereinzelt (Nr. 3) bzw. in gering- bis mittelgradiger (Nr. 5) oder hochgradiger (Nr. 14) Anzahl auffindbar.

Mit Ausnahme von vereinzelten Perikaryon nahen zytoplasmatische Signalen bei Nr.

14 zeigten alle drei Tiere in den Neuronen ausschließlich nukleäre +ssBDV-L 445-spezifische Reaktionen, die ein granuläres, teils punktförmiges Verteilungsmuster aufwiesen.

In Astrozyten und Oligodendrozyten lagen vorwiegend diffus verteilte intranukleäre +ssBDV-L 445-spezifische Reaktionen vor.

+ssBDV-L 459 war mit Ausnahme von Nr. 9 bei allen Tieren der Gruppe I in vereinzelter (Nr. 7, 21), geringgradiger (Nr. 18, 23), mittelgradiger (Nr. 1, 12) oder mittel- bis hochgradiger (Nr. 19) Zahl positiver Zellen nachweisbar.

Auf intrazellulärer Ebene zeigten diese Tiere fast ausschließlich nukleäre +ssBDV-L 459-spezifische Reaktionsprodukte in den Neuronen, die sich größtenteils granulär, teils punktförmig darstellten. Lediglich bei zwei Tieren waren darüber hinaus vereinzelte zytoplasmatische Reaktionen im Perikaryon zu detektieren.

Positive Signale in Astrozyten und Oligodendrozyten lagen ausschließlich im Nukleus, vorwiegend diffus verteilt, vor.

Bei Tieren der Gruppe II variierte die Anzahl +ssBDV-L 459-positiver Zellen von lediglich vereinzelten positiven Zellen (Nr. 2, 11, 15), über eine gering- bis mittelgradige (Nr. 4, 8), mittelgradige (Nr. 13, 17) und mittel- bis hochgradige (Nr. 6) bis zu einer hochgradigen Anzahl (Nr. 20). Hierbei ist zu beachten, dass die Gewebeproben der Pferde Nr. 15 und 17 aufgrund von Artefaktbildung (vgl. 4.1) nur eingeschränkt zu beurteilen waren.

Auch bei diesen Tieren dominierten in den Neuronen nukleäre Reaktionen, die, wenn überhaupt, nur mit vereinzelten (Nr. 6, 13, 20) oder geringgradigen (Nr. 8) zytoplasmatischen Reaktionen im Perikaryon einhergingen. Auf intranukleärer Ebene dominierte in Neuronen eine granuläre, teils punktförmige Verteilung der Reaktionsprodukte. Einige Tiere wiesen darüber hinaus ein vermehrtes diffuses Verteilungsmuster auf (Nr. 8, 17, 20). Bei Nr. 6 bestand sogar ein annährend ausgeglichenes Verhältnis zwischen einer granulären, teils punktförmigen und einer diffusen Anordnung.

In Astrozyten und Oligodendrozyten lagen vorwiegend diffus verteilte intranukleäre +ssBDV-L 459-spezifische Reaktionen vor.

Bei Tier Nr. 22 waren keine +ssBDV-L 459-positiven Zellen nachweisbar.

In Gruppe III lagen +ssBDV-L 459-positive Zellen bei vier Tieren in unterschiedlicher Anzahl vor. Während Nr. 16 nur vereinzelt positive Zellen zeigte, wies Nr. 3 eine geringgradige, Nr. 5 eine mittel- bis hochgradige und Nr. 14 eine hochgradige Zahl positiver Zellen auf. Hierbei waren in den Neuronen +ssBDV-L 459-spezifische Signale ausschließlich im Nukleus nachweisbar. Während bei Nr. 3, 5 und 16

bezüglich der intranukleären Verteilung granuläre, teils punktförmige Reaktionsprodukte dominierten, wies Nr. 14 eine annährend ausgeglichene Verteilung von granulären, teils punktförmigen und diffusen Reaktionen auf.

In Astrozyten und Oligodendrozyten dominierten nukleäre +ssBDV-L 459-spezifische Reaktionen. Nukleäre Reaktionen wiesen hierbei überwiegend eine diffuse intranukleäre Verteilung auf.

Zusammenfassend waren in Neuronen sowohl +ssBDV-L 445 als auch +ssBDV-L 459 unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit mit großer Mehrheit im Nukleus lokalisiert (Abb. 31 B + C). Tiere der Gruppe III wiesen in den Neuronen in Bezug auf +ssBDV-L 459 sogar ausschließlich nukleäre Reaktionen auf. Zytoplasmatische Reaktionsprodukte waren in wesentlich seltener nachweisbar. Hierbei standen zytoplasmatische Reaktionen im Perikaryon im Vordergrund. Spezifische Signale in den zellulären Fortsätzen wurden dagegen ausschließlich beim Nachweis von +ssBDV-L 445 und nur bei jeweils einem Tier der Gruppe I (Nr. 19) und II (Nr. 20) detektiert.

Die Tiere Nr. 11 und 16 wiesen lediglich vereinzelte +ssBDV-L 459-positive Zellen auf, während bei ihnen keine +ssBDV-L 445-spezifischen Reaktionen nachweisbar waren. Insgesamt unterschieden sich +ssBDV-L 445 und +ssBDV-L 459 bezüglich der Anzahl positiver Zellen wenn überhaupt nur geringgradig voneinander.

Gruppenvergleiche hinsichtlich der Anzahl positiver Zellen sowie der intrazellulären Verteilung innerhalb von Neuronen ergaben weder bei +ssBDV-L 445 noch bei +ssBDV-L 459 statistisch signifikante Unterschiede (Abb. 22 und Abb. 23, Tab. 19 und Tab. 20).

In Bezug auf die intranukleäre Verteilung spezifischer Reaktionsprodukte in Neuronen dominierte unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit bei der Mehrheit der Tiere ein granuläres, teils punktförmiges Verteilungsmuster. Einige Tiere der Gruppe II und Nr. 14 der Gruppe III wiesen allerdings bei den +ssBDV-L 459-spezifischen Reaktionen eine vermehrte diffuse intranukleäre Verteilung auf.

In +ssBDV-L 445- und 459-positiven Astrozyten und Oligodendrozyten lagen unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit vorwiegend diffus verteilte intranukleäre Reaktionsprodukte vor.

+ssBDV-L445

Gruppe I Gruppe II Gruppe III

ISH-Reaktion

Nukleus Zytoplasma Fortsätze

Abb. 22: Intrazelluläre Verteilung BDV-L-spezifischer, Intron II überspannender,positiv orientierter RNA in Neuronen

Semiquantitative Auswertung (0: keine spezifische Reaktion; 1: geringgradige, 2: mittelgradige, 3: hochgradige, Reaktion, vgl. 3.4.4), keine statistisch signifikanten Unterschiede, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum, +ssBDV-L445: positiv orientierte, Intron II überspannde L-Protein-spezifische mRNA

Gruppe I Gruppe II Gruppe III

ISH-Reaktion

Nukleus Zytoplasma Fortsätze

Abb. 23: Intrazelluläre Verteilung BDV-L-spezifischer, an t6 liegende, positiv orientierter RNA in Neuronen

Semiquantitative Auswertung (0: keine spezifische Reaktion; 1: geringgradige, 2: mittelgradige, 3: hochgradige Reaktion, vgl. 3.4.4), keine statistisch signifikanten Unterschiede, arithmetischer Mittelwert, Fehlerbalken: Maximum und Minimum, +ssBDV-L459: positiv orientierte, an t6 liegende, L-Protein-spezifische mRNA