Schlussbetrachtung

Die in der vorliegenden Habilitationsschrift anhand der experimentellen BDV-Infektion von Lewis-Ratten und TNF-transgenen Mäusen gewonnenen Erkenntnisse haben ergeben, dass die virale Ausbreitung und Persistenz des BDV selektiven Regulationsmechanismen unterliegt, was wesentlich zum Verständnis des Neurotropismus beiträgt. Neben zeitlichen Effekten in der akuten und chronischen Phase der Infektion wurden zelltypabhängige und regionenspezifische Strategien der Virusreplikation, viralen Transkription und Translation beobachtet. Diese Mechanismen dürften wesentlich für die gezielte Expression der viralen Proteine, insbesondere der Strukturproteine, sein und so die disseminierte Virusausbreitung und Persistenz trotz dem Vorhandensein entzündlicher Veränderungen im Gehirn in beiden Tiermodellen ermöglichen. Beispielhaft wurden Virus-Wirtsbeziehungen durch Korrelationen mit der Expression zellulärer, neuroprotektiver Faktoren und der Reaktion residenter Gehirnzellen gezeigt. Dabei scheinen ebenfalls regionenspezifische und zelltypspezifische Faktoren das Reaktionsmuster zu beeinflussen, das in der akuten und chronischen Infektionsphase variieren kann. Diese Untersuchungen verdeutlichen die Komplexität der viralen Pathogenititätsmechanismen, die aufgrund der vielfältigen Regulationsmöglichkeiten dem BDV eine hohe Adaptation an modulierte Ausgangsbedingungen und die Etablierung einer persistierenden Infektion mittels eines nicht zytolytischen Vermehrungszyklus erlauben.

Daher stellen experimentelle BDV-Infektionen hervorragende Modelle zur Erforschung molekularer Aspekte von persistierenden Virusinfektionen des ZNS und deren virusinduzierter immunvermittelter Neuropathogenese dar.

ZUSAMMENFASSUNG 173 6 ZUSAMMENFASSUNG

In der vorliegenden Habilitationsschrift wurden anhand der experimentellen BDV-Infektion von Lewis-Ratten und TNF-transgenen Mäusen In-vivo-Strategien des Virus zur Ausbreitung und Persistenz im ZNS sowie Grundlagen des Neurotropismus näher charakterisiert. Dazu wurden Replikations- und Transkriptionsmechanismen sowie zelluläre Virus-Wirts-Beziehungen untersucht und durch eine Überexpression des proinflammatorischen Zytokins Tumor-Nekrose-Faktors-α (TNF) moduliert. Da viralen Strukturproteinen wichtige Funktionen bei der Virusausbreitung, Determination des Zelltropismus und Induktion der antiviralen Abwehr zukommen und sie auch in die Regulation von Replikation und Transkription eingreifen können, wurden die bislang nicht bekannten Expressionsstrategien des viralen Glykoproteins (BDV-GP) und Matrixproteins (BDV-M) detailliert untersucht.

Erwartungsgemäß wurde der typische klinische biphasische Krankheitsverlauf bei der Lewis-Ratte bestätigt. Die TNF-transgenen Mäuse zeigten unerwartete, im Verlauf der Infektion zunehmende epileptiforme Krämpfe, die bei den nicht transgenen Tieren nicht auftraten.

Initiale Untersuchungen ergaben erhöhte Prodynorphin-mRNA-Spiegel im Gehirn der nicht infizierten TNF-transgenen Mäuse, möglicherweise als Hinweis auf ein moduliertes Dynorphinsystem. Nach BDV-Infektion fielen die Prodynorphin-mRNA-Werte nur bei den transgenen Tieren signifikant ab. Daher scheinen Dysregulationen neuromodulatorischer Neuropeptide sowie die entzündlichen und reaktiven Veränderungen im Gehirn an der Entstehung der Krämpfe beteiligt zu sein.

Histologisch lag sowohl nach BDV-Infektion der Lewis-Ratten als auch der TNF-transgenen Mäuse die erwartete, nicht eitrige Meningoenzephalitis mit lang anhaltender Astrogliose und Mikrogliaaktivierung vor, während die nicht transgenen Tiere lediglich dezente entzündliche Veränderungen aufwiesen. Bei den Lewis-Ratten wurde der typische Rückgang der entzündlichen Läsionen in der chronischen Phase der Infektion bestätigt. Die transgenen Mäuse zeigten hingegen einen signifikanten Anstieg der Meningoenzephalitis mit Läsionen vorwiegend in den TNF-exprimierenden Gehirnarealen sowie einer ungewöhnlichen Hypertrophie und Degeneration der Astrozyten, was die TNF-Wirkung belegt.

Nach BDV-Infektion der Lewis-Ratten und TNF-transgenen Mäuse war eine Aufregulierung neuroprotektiver Faktoren wie BDNF, ADNP, HO-1 und des Transkriptionsfaktors NFкB im Gehirn zu beobachten. HO-1 war bereits sehr früh nach Infektion der Lewis-Ratten exprimiert und nahm mit Anstieg der entzündlichen Veränderungen wieder ab, während ADNP und BDNF in beiden Modellen auch zu Zeitpunkten maximaler Entzündung bis in die chronische Phase hinein verstärkt nachweisbar waren. Beide Faktoren wurden auch in Entzündungszellen nachgewiesen, so dass erstmals neuroimmunmodulatorische Effekte bei der BDV-Infektion gezeigt werden konnten. Dies belegt, dass bei der BDV-Infektion in

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verschiedenen Phasen der Infektion unterschiedliche protektive und schadensbegrenzende Effekte wirksam sind. Die Aktivierung des NFкB nach BDV-Infektion ergab im Mausmodell eine vermehrte Kerntranslokalisation in Immunzellen, aber auch in Endothelzellen, Astrozyten und Mikroglia, nicht jedoch in Neuronen.

Als eindeutige Effekte der TNF-Überexpression sind die nicht eitrige Meningoenzephalitis mit Mikrogliaaktivierung, astrozytärer Hypertrophie und das Auftreten der epileptiformen Krämpfe anzusehen. Die mRNA-Mengen des TNFtg und TNFto waren bei den tg+/+ Tieren ungefähr doppelt so hoch wie bei den tg+/- Mäusen und bei allen transgenen Tieren signifikant höher als bei nicht transgenen Mäusen. Die tg+/+ Tiere zeigten vermehrt und früher Krämpfe und häufig stärkere entzündliche und degenerative Läsionen. Zudem wurde endogene TNF-mRNA durch transgenes TNF induziert. Nach BDV-Infektion nahmen die Werte der TNFto-mRNA bei den transgenen Mäusen nicht signifikant zu, sondern es kam es zu einem signifikanten Anstieg von TNFR1- und TNFR2-mRNA in allen Gruppen. Dies deutet darauf hin, dass die TNF-Wirkung nicht durch eine TNF-Aufregulation an sich sondern durch eine erhöhte Rezeptorverfügbarkeit erreicht wird.

Für die viralen Strukturproteine wurden selektive und signifikant unterschiedliche Expressionsstrategien im Vergleich zur Expression des viralen Nukleoproteins BDV-N beobachtet. Das bereits bekannte disseminierte Expressionsmuster des BDV-N wurde bestätigt. Nach BDV-Infektion der Lewis-Ratten und Mäuse waren BDV-N und BDV-N +ssRNA im gesamten Gehirn in Zytoplasma und Zellkern verschiedener Zelltypen nachweisbar. Dies zeigt, dass die Bereitstellung adäquater Mengen BDV-N essentiell für eine angemessene Replikation und Transkription in der akuten und chronisch persistierenden Phase der Infektion in beiden Modellen ist. Die BDV-M- und BDV-GP-Expression im Gehirn unterlag zeitlichen, regionalen und zelltypspezifischen Variablen, wobei signifikante Unterschiede aber auch Gemeinsamkeiten im Expressionsprofil der viralen Strukturproteine ersichtlich waren. Übereinstimmend war eine geringere Expression beider Hüllproteine im chronischen Stadium der Infektion. BDV-GP war in beiden Modellen signifikant niedriger exprimiert und auf das Zytoplasma einzelner Neuronen in definierten Gehirnregionen beschränkt. BDV-M war im Gehirn der Lewis-Ratten und der Mäuse vor allem zytoplasmatisch in allen Gehirnzellen und disseminiert im Gehirn zu finden. Die Expression des BDV-M wurde im Rattengehirn frühzeitig durch die Produktion in Neuronen, Aufregulation der Transkription und nukleären Export der BDV-Intron I +ssRNA gefördert, während in der chronischen Phase der Infektion BDV-M verstärkt in Astrozyten und kleinen Neuronen zu finden war und BDV-Intron I +ssRNA vermehrt im Kern zurückgehalten wurde.

Dies korrelierte mit der Abnahme der BDV-M-Expression. Generell war der Kernexport der BDV-Intron I +ssRNA zeitlich differierend, regionen- und zellspezifisch und nur in hippocampalen Neuronen konstant vorhanden. Bei den BDV-infizierten Mäusen war eine

ZUSAMMENFASSUNG 175 ähnliche Exportstrategie Intron I-haltiger +ssRNA zu erkennen, die die effiziente Translation von BDV-M mit disseminiertem Auftreten im Gehirn ermöglichte. Nach BDV-Infektion der Lewis-Ratten wurde die restriktive BDV-GP-Expression durch eine regional unterschiedliche Transkriptionseffizienz und Beschränkung des nukleären Exports, zeitliche Regulation der neuronalen Transkriptexpression sowie Limitierung der Translation vor allem in der chronischen Phase erzielt. Die eingeschränkte Bereitstellung kodierender +ssRNAs wird vermutlich durch eine geringe Spleißeffizienz von Intron I und die Kernretention Intron II-haltiger +ssRNAs erzielt. Letzteres dürfte einen essentiellen Mechanismus darstellen, um die virale Transkriptions- und Translationsleistung von BDV-GP aber auch BDV-M zu regulieren.

Diese Strategien variierten zusätzlich noch in verschiedenen Zelltypen und im Verlauf der Infektion. Die geringe, lediglich neuronale BDV-GP-Expression weist weiterhin auf eine Rolle des GP vor allem bei der transneuronalen Ausbreitung des BDV hin. In den BDV-infizierten Mausgruppen war noch weniger BDV-GP nachweisbar, trotz häufigerer zytoplasmatischer Lokalisation der BDV-Intron II +ssRNA, Reduktion der BDV-Intron II-Transkriptmengen über die Zeit bzw. vermehrtes Spleißen dieses Introns sowie stabilen Mengen des BDV-Intron I.

Die virale Transkriptionseffizienz bei den BDV-infizierten Lewis-Ratten und allen Mausgruppen bestätigte den 3’-5’-Transkriptionsgradienten des BDV. So waren zu allen Zeitpunkten p.i. die Kopienzahlen der BDV-N-spezifischen Transkripte am höchsten, während BDV-Intron II und BDV-Intron I +ssRNAs bis zu zehnmal niedriger exprimiert waren.

In den Rattengehirnen waren die Mengen der BDV-Intron II und BDV-Intron I +ssRNAs fast immer vergleichbar, als Hinweis auf eine geringe Spleißeffizienz. Nur einmalig war in Neuronen am 24. Tag p.i. signifikant mehr BDV-Intron I +ssRNA als BDV-Intron II +ssRNA nachweisbar, während dies bei allen Mausgruppen zutraf. Die virale Transkriptexpression wurde generell im zeitlichen Verlauf in Ammonshorn und N. caudatus/Putamen sowie Neuronen und Astrozyten unterschiedlich reguliert. Astrozyten scheinen dabei insbesondere in der persistierenden Phase eine besondere Rolle zu spielen. Die RNA-Nachweise nach BDV-Infektion aller Mausgruppen weisen auf eine regulierte Transkription mit limitierendem TNF-Effekt hin, da eine signifikante Zunahme der Anzahl RNA-haltiger Zellen bei den ntg Tieren im Vergleich zu einer nahezu konstanten Menge RNA-positiver Zellen bei beiden tg Gruppen vorlag. Durch die TNF-Überexpression kam es jedoch nicht zu einer Elimination des BDV. Weiterhin konnten bei der Maus gespleißte und ungespleißte subgenomische RNA aus dem Zellkern transportiert werden, was den Exportstrategien bei der Ratte entspricht.

Die Nachweise der BDV-LE +ssRNA und genomischen viralen RNA in den Ratten- und Mausgehirnen deuten auf eine balancierte und regionenspezifische Replikationsstrategie des BDV hin. Insgesamt scheinen die sehr geringen Mengen BDV-LE +ssRNA jedoch auszureichen, um adäquate Mengen Virusgenom für eine disseminierte Virusinfektion

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bereitzustellen und die Persistenz zu gewährleisten. Trotz der geringen BDV-LE +ssRNA-Mengen lagen in beiden Modellen in der chronischen Phase hohe Infektiositätstiter vor.

Im Ratten- und Mausgehirn konnte die Präferenz des BDV für spezifische Gehirnregionen und Zelltypen eindeutig für das Ammonshorn und Pyramidenzellen anhand selektiver neuroprotektiver Expressionsprofile und Transkriptionseffizienzen belegt werden.

Ammonshorn und Pyramidenzellen scheinen dem BDV besonders geeignete Replikations- und Transkriptionsbedingungen zu bieten. So fanden sich im Ammonshorn der Lewis-Ratten hohe, konstante Transkriptionseffizienzen, während im N. caudatus/Putamen die Transkription weniger effizient war und nur verzögert zu einem vergleichbar hohen Expressionsniveau führte. Weiterhin war im N. caudatus/Putamen die Translationseffizienz, zumindest für BDV-GP, deutlich verringert.

Zusammenfassend konnten nach experimenteller BDV-Infektion der Lewis-Ratten und TNF-transgener Mäuse neue Regulationsmechanismen der viralen Transkription, Translation und Replikation im Gehirn gezeigt werden. So unterliegt die Expression der viralen Proteine und subgenomischen RNAs zeitlichen, regionalen und zellspezifischen Effekten, wobei insbesondere die Restriktion des nukleären Exports viraler Transkripte und/oder Reifung und Spleißen subgenomischer RNAs sowie die Beschränkung der Translation essentiell sind. Die ebenfalls zeitlich differierende, regionenspezifische und zelltypabhängige quantitative Bereitstellung der viralen Transkripte und replikativer Intermediärstränge ergänzt diese Strategien. Beide Viruspräparationen waren in der Lage, sich disseminiert im Gehirn zu verbreiten und zu persistieren, auch unter den modulierten Bedingungen der TNF-Überexpression. Dabei wurde die virale Proteinexpression nicht signifikant beeinflusst, aber es waren limitierende Einflüsse auf die Zahl BDV-RNA-haltiger Zellen und steigende Mengen an BDV-LE +ssRNA erkennbar. Bei den Mäusen scheinen daher ähnliche, modifizierte virale Strategien wie bei der Ratte vorzuliegen. Für die Expression neuroprotektiver Faktoren und dem Reaktionsmuster residenter Gehirnzellen lagen ebenfalls spatio-temporale und zellspezifische Effekte vor. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht die Komplexität der zugrunde liegenden Pathogenitätsmechanismen, so dass sich experimentelle BDV-Infektionen hervorragend zur Erforschung molekularer Aspekte von persistierenden Virusinfektionen des ZNS und deren korrespondierender Neuropathogenese eignen.

SUMMARY 177

7 SUMMARY

In the present study, experimental BDV-infection of Lewis rats and TNF-transgenic mice was used for the characterization of in vivo strategies of BDV to spread and persist within the CNS and to analyze basic principles of viral neurotropism. Thus, mechanisms of viral replication and transcription as well as virus-host interactions were investigated and modulated by overexpression of the proinflammatory cytokine tumor necrosis factor α (TNF).

Viral structural proteins provide essential functions for viral spread, determination of cell tropism and induction of antiviral defense. Moreover, they are also capable to interfere with viral replication and transcription so that the less well-known expression strategies of the BDV-glycoprotein (BDV-GP) and BDV-matrixprotein (BDV-M) were analyzed in detail.

The typical clinical biphasic course of Borna disease (BD) in Lewis rats was confirmed as expected. The TNF-transgenic presented unexpected epileptic seizures with an increasing incidence during the course of the infection. In initial studies, elevated levels of prodynorphin mRNA were recorded in non infected, TNF-transgenic mice brains, possibly indicating a modulated dynorphin system. The amount of prodynorphin mRNA decreased significantly after BDV-infection only in the transgenic animals. Therefore, dysregulations of neuromodulatory neuropeptides in combination with the inflammatory and reactive alterations seem to be involved in the occurrence of epileptic seizures.

Histologically, the anticipated non purulent meningoencephalitis with long lasting astrogliosis and microglia activation was detected after BDV-infection of Lewis rats and TNF-transgenic mice. The non transgenic mice developed only mild inflammatory lesions. In the brains of Lewis rats, the typical decrease of inflammatory alterations was noted in the chronic phase of infection. The transgenic mice showed a significant progression of the meningoencephalitis with inflammatory infiltrates mainly in TNF-overexpressing brain areas which was accompanied by an unusual hypertrophy and degeneration of astrocytes.

After BDV-infection of Lewis rats and TNF-transgenic mice, an upregulation of neuroprotective factors such as BDNF, ADNP, HO-1 and the transcription factor NFкB was found in the brain. HO-1 was already induced very early after infection and its expression decreased simultaneously with the increase of the inflammatory reaction, whereas ADNP and BDNF were still upregulated at time points of maximal inflammation until the chronic phase. For the first time, both factors were also detected in inflammatory cells so that neuroimmunemodulatory effects can be assumed after BDV-infection. This also indicates that various protective and insult-limiting factors are acting during the different phases of BDV-infection. In the mouse model, NFкB activation was detected as nuclear translocation in immune cells, but also in endothelial cells, astrocytes and microglia, but not in neurons.

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The non purulent meningoencephalitis with astrocytic hypertrophy and microglial activation as well as the epileptic seizures are unequivocally due to the TNF-overexpression. The basic levels of TNFto and TNFtg mRNA were approximately 2-fold higher in tg+/+ than in tg+/- animals and significantly increased compared to ntg mice. Homozygous mice showed seizures more frequently and earlier after infection and developed more severe inflammatory and degenerative lesions in the brain. Interestingly, TNFtg induced an upregulation of host-derived TNF mRNA. After BDV-infection, no significant increase of TNFto mRNA values in transgenic mice was detected. However, TNFR1 and TNFR2 mRNA levels were significantly up-regulated in all infected mice groups. These findings indicate that TNF-effects were mediated by increased receptor availability and not by further upregulation of TNF itself.

Selective expression strategies were observed for the viral structural proteins which differed significantly from the expression pattern of the viral nucleoprotein BDV-N. The well-known disseminated expression profile of BDV-N was confirmed. After BDV-infection of Lewis rats and mice, BDV-N and BDV-N +ssRNA were present in the entire brain in cytoplasm and nucleus of various brain cells. Therefore, supply of adequate amounts of BDV-N is essential for an appropriate replication and transcription during the acute and chronic persistent phase in both models. BDV-M and BDV-GP expression in the brain was dominated by spatio-temporal, regional and cell specific effects. The expression profile of both structural proteins exhibited significant differences but also common features when compared to each other.

Consistently, BDV-M and BDV-GP were less expressed in the chronic phase of infection.

BDV-GP expression was significantly lower in both models and only detected in the cytoplasm of single neurons in defined brain areas. In the brain of Lewis rats and mice, BDV-M was found mainly in the cytoplasm of various brain cells in the entire brain. Early after infection of Lewis rats, BDV-M expression was enhanced by upregulation of transcription, nuclear export of BDV-intron I +ssRNA and BDV-M synthesis in neurons, whereas BDV-M was found more often in astrocytes and BDV-intron I +ssRNA was more frequently retained in the nucleus in the chronic phase. This correlated well with the decrease of BDV-M expression. In general, nuclear export of BDV-intron I +ssRNA differed between time points p.i., showed regional and cellular preferences and was constantly present only in hippocampal neurones. In BDV-infected mice, a comparable expression strategy of intron I-containing transcripts was noted which allowed efficient translation of BDV-M with occurrence of BDV-M in the entire brain. After BDV-infection of Lewis rats, the restricted BDV-GP expression was achieved by a regionally different efficiency of transcription, restriction of nuclear export, temporal regulation of neuronal transcription and limitation of translation predominantly in the chronic phase of infection. The controlled supply of BDV-GP coding transcripts is most likely due to low splicing efficiency of intron I and nuclear retention of Intron II-containing +ssRNAs. Presumably, the latter represents an essential mechanism

SUMMARY 179 to regulate viral transcription and translation capacity not only of BDV-GP but also of BDV-M.

In addition, all these viral strategies varied depending on the infected cell type and time point after infection. The limited, neuronal expression of BDV-GP points to a role of BDV-GP mainly for the transneuronal spread of BDV. In the BDV-infected mice brains, even less GP positive cells were detected despite more frequent cytoplasmic localization of BDV-intron II +ssRNA, stable amounts of BDV-BDV-intron I +ssRNA, decrease of BDV-BDV-intron II containing transcripts in the chronic phase or more frequent splicing of intron II, respectively.

The viral transcription efficiency in BDV-infected rat and mice brains of all groups confirmed the 3’-5’-transcription gradient of BDV. Copy numbers of BDV-N specific transcripts were significantly the highest at all time points investigated, whereas BDV-intron I and BDV-intron II +ssRNAs were expressed up to 10-fold less. In the rat brain, amounts of BDV-intron I and BDV-intron II +ssRNAs were almost comparable, most likely indicating a low splicing efficiency. Only at day 24 pi., significantly more BDV-intron I +ssRNA was measured in neurones compared to BDV-intron II +ssRNA, while this constellation was found constantly in all mice groups. In general, viral transcription was differently regulated in the acute and chronic phase of the disease in hippocampus and N.caudatus/putamen and in neurons and astrocytes, respectively. Astrocytes seem to play a particular role in the persistent stage of infection. The RNA expression profile after BDV-infection of all mice groups likewise points to a regulated transcription. The significant increase of RNA containing cells in the ntg animals in comparison to a nearly constant number of RNA positive cells in both tg groups could indicate a limiting effect of TNF. However, the TNF-overexpression did not eliminate BDV from the brain. In the mice brain, similar as in the rat, spliced and unspliced subgenomic RNAs were exported from the nucleus.

The demonstration of BDV-LE +ssRNA and genomic viral RNA in the rat and mice brains

The demonstration of BDV-LE +ssRNA and genomic viral RNA in the rat and mice brains