Auswertung

Die Auswertung der histopathologischen Veränderungen im Gehirn erfolgte semiquantitativ nach folgenden Kriterien in verschiedenen Vergrößerungsstufen:

1. Entzündliche Veränderungen:

Infiltrate: - perivaskulär - meningeal - parenchymal Mikrogliaaktivierung Astrogliose

Satellitose

2. Degenerative Veränderungen:

Hydrocephalus internus Neuronennekrosen

0 = keine Veränderungen

1 = bei den meisten Infiltrate bis 15 Zellen/Herd, perivaskulär meist ein bis zwei Schichten von Entzündungszellen, leicht erhöhte Zellularität (Leptomeninx, Parenchym), vereinzelte Herde, einzelne Gehirngebiete betroffen, kaum-geringgradige Satellitose, kein Hydrocephalus internus, vereinzelte Neuronennekrosen

2 = bei der Mehrzahl der Infiltrate 15-30 Zellen/Herd, perivaskulär ein bis zwei oder mehr als zwei Schichten von Entzündungszellen, deutlich erhöhte Zellularität, zahlreiche Herde, mehrere Gehirngebiete betroffen, mittelgradige Satellitose, kein bis beginnender Hydrocephalus internus, vermehrt Neuronennekrosen

3 = bei der Mehrzahl der Infiltrate über 30 Zellen/Herd, perivaskulär immer mehr als zwei bis viele Schichten von Entzündungszellen, sehr hohe Zellularität, viele große, evtl.

konfluierende Herde, gesamtes Gehirn betroffen, hochgradige Satellitose, ausgeprägter Hydrocephalus internus, zahlreiche Neuronennekrosen

Die Auswertungskriterien des Astroglianachweises finden sich unter der Bewertung der GFAP-Expression (3.1.6.6).

Die Anzahl reaktiver Mikroglia wurde nach Anzahl von Stäbchenzellen und perineuronaler Lokalisation bei 400facher Vergrößerung bewertet:

0 = keine reaktiven Mikroglia pro Gesichtsfeld

1 = wenige (bis zu 10) reaktive Mikroglia pro Gesichtsfeld 2 = einige (bis zu 20) reaktive Mikroglia pro Gesichtsfeld Die statistische Auswertung findet sich unter 3.1.12.

MATERIAL UND METHODEN 41 3.1.6 IMMUNHISTOLOGIE (IH)

Die Immunhistologie wurde zum Nachweis der BDV-spezifischen Proteine sowie der Beurteilung der Astrogliose, Mikrogliaaktivierung und neuroprotektiver Vorgänge eingesetzt.

1. Blockseren

1.1 Pferdeserum (PS, PAA Laboratories, Linz, Österreich) 1.2 Schweineserum (SS, PAA Laboratories)

1.3 Ziegenserum (ZS). Das Serum wurde von gesunden Tieren der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gewonnen (10.2.1).

2. Primärantikörper

Die verwendeten Primärantikörper finden sich in Tabelle 3.

3. Kontrollseren

Als Kontrollserum für monoklonale Antikörper diente ein monoklonaler Antikörper von der Maus gegen Hühner T-Zellen (CTL 1), für die monospezifischen, polyklonalen Antikörper wurde Serum gesunder Kaninchen (Sigma-Aldrich, Heidelberg) verwendet.

4. Sekundäre Antikörper

Für die Detektion monoklonaler Antikörper wurde ein biotinilierter Pferd-anti-Maus-Antikörper verwendet (IgG, Vector Laboratories, Burlingame, USA) und für die polyklonalen Antiseren ein biotinilierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (IgG, Vector Laboratories). Zur Detektion des Anti-CNPase Antikörpers wurde ein biotinilierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (IgG (H+L), Vector Laboratories), zum Nachweis der Anti-AIF-1- und Anti-HO-1-Antikörper ein biotinilierter Ratten-anti-Maus-Antikörper (Dako Cytomation) eingesetzt.

5. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)

Es wurde das ABC-Kit Peroxidase Standard PK-4000 von Vector Laboratories verwendet.

6. Streptavidin-Avidin-Biotin (AB)-Komplex

Als Streptavidin-AB-Komplex diente das kommerziell erhältliche Kit von Dako Cytomation.

7. Avidin-Biotin-Alkalische Phosphatase-Komplex (ABC-AP)

Verwendet wurde das Kit Alkaline Phosphatase Standard AK-5000 (Vector Laboratories).

MATERIAL UND METHODEN 42

Tab. 3: Verwendetes Gewebe, Spezifität und Verdünnungen der primären Antikörper

Maus-anti-AIF-1 Monoklonal 1:2 in TBS 0,1% BSA

Mikrowelle/Citratpuffer SS FFPE TBS: tris buffered saline; PBS: phosphate buffered saline; SS: Schweineserum; PS: Pferdeserum; ZS:

Ziegenserum; BSA: Bovines Serumalbumin; BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein,

*: Zur Herstellung diente ein 16 AS-großen Peptid, das im C-terminalen BDV-GP-Bereich in unmittelbarer Nähe zur Spaltstelle liegt (AS 287 bis 302); BDV-M: BDV-Matrixprotein; GFAP: glial fibrillary acidic protein; CNPase: 2’,3’-cyclic nucleotide-3’-Phosphodiesterase; AIF-1: allograft inflammatory factor 1; ED1: Rattenhomolog zu CD68; HO-1: Häm-Oxygenase-1; ADNP: activity-dependent neuroprotective protein; BDNF: brain derived neurotrophic factor; FFPE: Formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe; DMa: Doppelmarkierung zum Nachweis der BDV-RNAs in Astrozyten bzw. Oligodendrozyten (3.1.8.3); DMb: Nachweis von BDV-M in Astrozyten (3.1.6.2)

3.1.6.1 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Methode

Der Nachweis der BDV-spezifischen Antigene sowie der residenten Zellen im Gehirn erfolgte mit der von HSU et al. (1981) beschriebenen und von HERDEN et al. (2000b, 2005) und WERNER-KEIŠS et al. (2008) modifizierten ABC-Methode. Die Antikörperkomplexe wurden mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Kit Peroxidase Standard, Vector Laboratories) und 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB, Sigma Aldrich) als Chromogen dargestellt.

3.1.6.2 Doppelmarkierung

Die Doppelmarkierung diente dem Nachweis von M in Astrozyten. Dazu wurden BDV-infizierte Gehirnschnitte mit dem polyklonalen Anti-BDV-M-Antikörper nach der ABC-Methode inkubiert (3.1.6.1). Anschließend wurden die Schnitte mit dem monoklonalen Anti-GFAP–Antikörper nach der ABC-Alkalische Phosphatase(AP)-Methode mit dem ABC-AP-Kit

Primärantikörper Klonalität und

MATERIAL UND METHODEN 43

Alkaline Phosphatase (Vector Laboratories) und dem Neufuchsin-Substratsystem, wie von MIAO et al. (2003) und GENNET et al. (2008) beschrieben, inkubiert.

3.1.6.3 Immunhistologische Kontrollen

Die Spezifität der immunhistologischen Reaktionen wurde wie folgt überprüft:

1. Folgeschnitte der zu untersuchenden Gewebeschnitte wurden mit den jeweiligen Kontrollseren anstelle des Primärantikörpers inkubiert.

2. Zusätzlich wurden Gehirnschnitte von mock-infizierten Tieren und nicht infizierten Kontrolltieren sowohl mit den primären Antikörpern als auch mit den Kontrollseren inkubiert.

3.1.6.4 Auswertung der Immunhistologie

Die Bewertung der immunhistologischen Nachweise erfolgte semiquantitativ durch die Bestimmung der geschätzten Zahl positiver Zellen/Gesichtsfeld für die unter 3.1.4.1 genannten Gehirnlokalisationen unter Berücksichtigung der topographisch-anatomischen Gegebenheiten.

Der Nachweis der BDV-Antigene wurde bei 200facher Vergrößerung wie folgt bewertet:

0 = keine Reaktion

1 = einzelne positive Zellen bzw. bis zu 15 positive Zellen pro Gesichtsfeld, nur einzelne Gehirngebiete betroffen

2 = 15-30 positive Zellen pro Gesichtsfeld, mehrere Gehirngebiete betroffen Reaktion 3 = über 30 positive Zellen pro Gesichtsfeld, viele Gehirngebiete bzw. gesamtes Gehirn

betroffen

Das Vorhandensein einer Astrogliose wurde anhand der typischen Morphologie aktivierter Astrozyten (VINTERS und KLEINSCHMIDT-DEMASTERS, 2008) sowie der Anzahl GFAP-positiver Astrozyten bei 200facher Vergrößerung nach folgendem Schema bewertet (HERDEN et al., 2005):

0 = keine GFAP-positiven Astrozyten

1 = bis zu 15 GFAP-positive Zellen pro Gesichtsfeld 2 = bis zu 30 GFAP-positive Zellen pro Gesichtsfeld 3 = ≥30 GFAP-positive Zellen pro Gesichtsfeld

Zum Nachweis von Mikroglia/Makrophagen diente die Bewertung der AIF-1-Expression bei 400facher Vergrößerung unter Verwendung des folgenden Schemas (HERDEN et al., 2005):

0 = keine AIF-1-positiven Zellen

1 = bis zu 15 AIF-1-positive Zellen pro Gesichtsfeld 2 = ≥15 AIF-1-positive Zellen pro Gesichtsfeld 3 = ≥35 AIF-1-positive Zellen pro Gesichtsfeld

Zusätzlich wurde vergleichend das Vorhandensein einer ED1-Expression überprüft.

MATERIAL UND METHODEN 44

Die HO-1-Expression wurde bei 400facher Vergrößerung wie folgt bewertet (HERDEN et al., 2005):

0 = keine HO-1-positiven Zellen

1 = bis zu 10 HO-1-positive Zellen pro Gesichtsfeld 2 = bis zu 20 HO-1-positive Zellen pro Gesichtsfeld 3 = ≥20 HO-1-positive Zellen pro Gesichtsfeld

Die Bewertung der ADNP- und BDNF-Nachweise erfolgte qualitativ in Hinblick auf exprimierende Zelltypen und intrazelluläre Lokalisation in den jeweiligen Gehirnarealen (3.1.4.1). Falls nicht anders erwähnt, wurden die Reaktionen einer Gehirnregion für die Tiere eines Untersuchungstages gemittelt. Die statistische Aufarbeitung findet sich unter 3.1.12.

An Gehirnschnitten BDV-infizierter Tiere 14, 24, 42, 90 Tage p.i. wurde zusätzlich eine quantitative Auswertung vorgenommen, indem die immunhistologisch BDV-N- und BDV-GP-positiven Zellen im Ammonshorn ausgezählt wurden. Das Ammonshorn erwies sich als am geeignetsten, da es abgrenzbar und somit vermessbar war und in diesem Gebiet sowohl BDV-N als auch BDV-GP exprimiert wurde. Die Größe der Hippocampusformation wurde an jedem Gewebeschnitt mit Hilfe des Programms analySIS 2.02 der Firma SIS Enterprises (Soft Imaging Software, Münster) und Kamera und Adapter der Firma Kappa Messtechnik, Gleichen, am Olympus Photo-Mikroskop MTV-3 BH-2 ausgemessen. Es wurden alle BDV-N- und BDV-GP-positiven Zellen innerhalb des vermessenen Gebietes gezählt. Zellen am Rand des Messgrids wurden nur an zwei Seiten gezählt. Dabei wurde zwischen Zellen mit positiven Reaktionen im Kern, im Zytoplasma oder in beiden Zellkompartimenten unterschieden und die Gesamtzahl positiver Zellen ermittelt. Eine gleichartige Auszählung fand auch nach der ISH statt (3.1.8.5). Zur weiteren statistischen Auswertung siehe 3.1.12.

3.1.7 HERSTELLUNG VON cDNA-KLONEN

Zur Herstellung von Digoxigenin (DIG)-markierten RNA Sonden (3.1.8.1) und des Mengenstandards für die real time RT-PCR (3.1.10.1) wurden cDNA Klone der BDV +ssRNAs und zellulärer mRNA sowie Plasmide für den während der Virusreplikation entstehenden komplementären +ssRNA-Strang (BDV-LE) verwendet (Tab. 4). Dazu wurden entweder Plasmide, die das komplette BDV-N- oder BDV-GP-Gen enthielten und freundlicherweise von Herrn Prof. Garten, Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg zur Verfügung gestellt wurden, oder Gesamt-RNA aus Gefriermaterial eines BDV-infizierten Rattengehirnes (50 Tage p.i.) und eines Kontrolltieres benutzt. Aus dem nativen Gehirngewebe wurde Gesamt-RNA isoliert, aufgereinigt und cDNA durch reverse Transkription (RTr) hergestellt. Die Klonierung erfolgte in einen pCR.4-TOPO^® -Sequenzierungsvektor (Invitrogen, Karlsruhe) mit Vermehrung in One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli-Bakterien (Invitrogen).

MATERIAL UND METHODEN 45 3.1.7.1 RNA-Isolation

Die RNA wurde aus OCT-eingebettetem Gehirngewebe (OCT-GG) der BDV-infizierten Ratte (50 Tage p.i.) und des Kontrolltieres nach der single-step-Methode (CHOMCZYNSKI und SACCHI, 1987) mit Trizol^®-Reagenz (Invitrogen) isoliert. Die RNA wurde aufgereinigt oder mit 200 µl 75%igem Ethanol überschichtet und bei -80 °C asserviert.

3.1.7.2 Aufreinigung der RNA

Zur Reinigung der RNA wurde das RNeasy Minikit^® (Qiagen, Hilden) mit zusätzlicher Behandlung mit RNAse-Free DNase I (Qiagen, 10 µl pro Ansatz für 15 Minuten) verwendet.

Die Elution der RNA erfolgte mit 30 µl RNase freiem Wasser (Qiagen). Die RNA wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C asserviert.

3.1.7.3 Reverse Transkription

Die reverse Transkription (RTr) erfolgte mit dem Omniskript RT^® Kit (Qiagen) in einem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik, Hessisch Oldendorf; POROMBKA et al., 2006;

SCHAUDIEN et al. 2007a). Aus der RNA-Stammlösung wurde durch Zugabe von DEPC-Aqua bidest. eine RNA-Gebrauchslösung (100 ng/µl) hergestellt. Davon wurden 12 µl RNA (1200 ng) eingesetzt, um einen 19 µl RT-Reaktionsansatz mit 2 nm dNTP, 0,5 µl random primer (Promega, Mannheim), 10 U RNaseOut Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen) und 4 U Omniskript^® Enzym zu erhalten. Der RTr-Reaktionsansatz wurde in dem Thermocycler 25 °C für 10 Minuten, 37 °C für 1 Stunde, 93 °C für 5 Minuten und bei 4 °C bis zur Entnahme der Proben inkubiert. Die cDNA-Proben wurden sofort bei –80 °C asserviert.

3.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Primer zur initialen Amplifikation von BDV +ssRNA und zellulärer +ssRNA wurden mit dem Programm Primer3 input (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) ermittelt (Tab. 4). Die Primerlyophilisate (MWG Biotech, Ebersberg) wurden mit DEPC-Aqua bidest.

auf eine Konzentration von 15 µM eingestellt und bei -20 °C gelagert. Die Amplifikation der in 3.1.7.3 hergestellten cDNA oder der bereits vorhandenen Plasmid-DNA erfolgte in einem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik) unter Verwendung des GeneAmp^® PCR Core Kit (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Weiterstadt). Je 3 µl cDNA-Matrize wurden in einem 50 µl-PCR-Ansatz mit 1,25 mM MgCl2, 200 µM dNTP-Mix (Invitrogen), je 300 nM Primer und 1,25 U AmpliTaq^® DNA Polymerase eingesetzt. Bei Verwendung des Plasmides BDV-GP wurden 1 µl der Verdünnungen 1:10², 1:10³ und 1:10⁴ eingesetzt.

Als Matrize für BDV-N diente das Plasmid „BDV-N", als Matrizen für BDV-Intron II (BDV-GP-N, BDV-GP-C) das Plasmid „BDV-GP“ sowie die cDNA der BDV-infizierten Lewis-Ratte.

Da die BDV-GP-spezifische Sequenz des für den zur Infektion verwendeten Virusstock noch nicht bekannt war, wurden beide Ansätze gewählt. Als Matrize für BDV-Intron I (BDV-M, Intron I NEU), BDV-LE und BDV-S1 wurde cDNA der BDV-infizierten Lewis-Ratte, für Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A (SDHA),

Hypoxanthin-Phosphoribosyl-MATERIAL UND METHODEN 46

Transferase I (HPRT) und Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) die cDNA des Kontrolltieres verwendet. Als Negativkontrollen (no template control, NTC) diente ein PCR-Ansatz, der nur DEPC-Aqua bidest. enthielt.

Der PCR-Ansatz wurde bei folgendem Temperaturprogramm mit einem annealing bei 59,9

°C, außer für die Primerpaare p151/152 und 153/154 (annealing 55 °C) inkubiert: Initiale Denaturierung bei 94 °C für 1 Minute, 40 Zyklen; Denaturierung: 94 °C für 1 Minute; Primer-Anlagerung: 59,5 °C/55 °C für 1 Minute; Elongation: 72 °C für 1 Minute; Finale Elongation: 72

°C für 20 Minuten; Kühlung: 4 °C bis zur Entnahme der Proben. Zur Überprüfung der korrekten Amplifikation wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch aufgetrennt (10.2.5).

DNA-Banden der Amplifikate mit korrekter Größe wurden mit dem NucleoSpin^® Extract II-Kit (Macherey-Nagel, Düren) aufgereinigt.

Tab. 4: Verwendete Primer zur Herstellung von cDNA-Klonen

Name ID Sequenzen (5’ → 3’ Orientierung) Amplk Acc-No.

Basenpaare; Acc-No: GenBank^®-Accession-Nummer; Pos.: Position in der veröffentlichten Sequenz;

BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-M: BDV-Matrixprotein; BDV-LE:

leader-haltige +ssRNA; SDHA: Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A; HPRT:

Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I; GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

MATERIAL UND METHODEN 47 3.1.7.5 Klonierungsreaktion

Die Klonierung spezifischer PCR-Produkte erfolgte mittels des TOPO TA Cloning^® Kit for Sequencing mit dem pCR.4^®-TOPO-Sequenzierungsvektor (Invitrogen; GRÖTERS, et al.

2005; WERNER-KEIŠS, et al., 2008) und Plasmidvermehrung in One Shot TOP10 Chemically Competent-E.coli-Bakterien (Invitrogen). Pro PCR-Produkt wurden Ligationsansätze mit 1-4 µl des PCR-Produktes, 1 µl Salzlösung, 1 µl pCR.4^®-TOPO-Vektor (Invitrogen) und bis zu 3 µl sterilem Aqua dest. angesetzt. Die chemische Transformation der One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli (Invitrogen) erfolgte mit 2 µl des ligierten Plasmides. Pro Ansatz wurden je 30 µl und 100 µl der Bakteriensuspension auf Lauria-Bertani-Agarböden (10.2.2) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C im Wärmeschrank inkubiert. Von deutlich erkennbaren Einzelkolonien wurden insgesamt sechs Flüssigkulturen in 4 ml-Lauria-Bertani-Medium (10.2.2) angeimpft und über Nacht bei 37 °C im Schüttler (200 rpm) inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde mit dem das NucleoBond^® PC 20-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gewonnen. Nach Bakterienlyse und Aufreinigung der Plasmid-DNA erfolgte eine DNA-Präzipitation mit 0,8 Volumen eisgekühltem Isopropanol und Waschen des Plasmid-Pellets mit 70%igem Ethanol. Das Plasmid-Pellet wurde mit 25 bis 35 µl DEPC-Aqua bidest. resuspendiert und bei -80 °C asserviert. Von jeder angesetzten Flüssigkultur wurde ein Glycerolstock angelegt.

3.1.7.6 Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA

Der Einbau des PCR-Produktes in das Plasmid wurde durch eine Restriktionsspaltung mit EcoR I (Roche Diagnostics, Mannheim) überprüft. 0,2–0,5 µg Plasmid-DNA wurden mit 20 U EcoR I und 2 µl spezifischem Puffer vermischt, ad 20 µl mit DEPC-Aqua bidest. aufgefüllt und 90 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wurde durch 3 µl loading dye (ABgene^®) abgestoppt und das Gemisch wurde zur Überprüfung der korrekten DNA-Größe (Amplifikatgröße [Tab. 4] + 17 bp Vektoranteil) gelelektrophoretisch aufgetrennt.

3.1.7.7 Sequenzierung und weitere Verwendung der cDNA-Klone

Die Plasmidinserts wurden bei Sequence Laboratories, Göttingen sequenziert. Die Sequenzen der cDNA Klone spezifisch für BDV-N, BDV-Intron II (BDV-GP-N, BDV-GP-C), BDV-M und Intron I wurden mit dem BDV-Stamm H24 (BDV-rat-4p), ehemals als RW98 bezeichnet (GenBank^® Acc.-No. AF158629-AF158633, PLANZ et al., 2003b; DÜRRWALD et al., 2006) mittels GenBank^®: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ verglichen und die Orientierung im Vektor bestimmt (Tab. 5, 6). Die Sequenzierungen der cDNA Klone spezifisch für BDV-LE (BDV-LE, BDV-S1 391) wurden mit dem BDV-Stamm He80 (GenBank^® Acc.-No. AJ311522, PLESCHKA et al., 2001) verglichen. Die Homologien lagen zwischen 99-100%, nur für den cDNA Klon BDV-S1 391 bei 97% und für den Klon BDV-N bei 95% (Tab. 5).

Die Plasmide III von BDV-N, BDV-GP-N und BDV-GP-C, Plasmid V Intron I-NEU sowie BDV-GP-N* und BDV-GP-C* dienten zur Herstellung von DIG-markierten RNA Sonden

MATERIAL UND METHODEN 48

(3.1.8.1). Die Plasmide BDV-GP-N* und BDV-GP-C* bezeichnen die aus dem Plasmid „BDV-GP“ subklonierten cDNA Klone. Das Plasmid I BDV-M diente als Matrize für die Suche des Primerpaares p382/384 zur Konstruktion des cDNA Klons Intron I NEU (Tab. 4, 5). Alle cDNA Klone bis auf Intron I-NEU dienten als Grundlage für den jeweiligen Mengenstandard in der real time RT-PCR (3.1.10.1). Darüberhinaus wurden die Sequenzen der DNA-Inserts von Plasmid III BDV-N, BDV-GP-N, BDV-GP-C und Plasmid I BDV-M als Vorlage für die Suche von Primern und Taqman^®-Sonden für die real time RT-PCR benutzt (Tab. 11, 12).

Tab. 5: Verwendung der BDV- und zellspezifischen Plasmide Plasmid-ID Größe

M13R-M13F

Mengen-standard ISH Homologie Acc-No.

BDV-N 507 bp Plasmid III Plasmid III 95 % AF158629

BDV-M 438 bp Plasmid I 99 % AF158632

Intron I NEU 253 bp

Plasmid V-Intron

I-NEU

100 % AF158632 BDV-GP-N 480 bp Plasmid III Plasmid III 99 % AF158633 BDV-GP-C 648 bp Plasmid III Plasmid III 100 % AF158633

BDV-GP-N* 480 bp gp9/I 100 % AF158633

BDV-GP-C* 648 bp gp4/I 99 % AF158633

BDV-LE 275 bp Plasmid 385

I-B 99 % AJ311522

BDV-S1 391 500 bp Plasmid V 97 % AJ 311522

SDHA 260 bp Plasmid II 100 % AB072907

HPRT 251 bp Plasmid III 100 % X62085

GAPDH 247 bp Plasmid II 98 % NM_017008

Plasmid-ID: Bezeichnung des Plasmids; Größe M13R- M13F: Amplifikatgröße (Tab. 4 + 165bp Vektoranteil); M13R: M13 reverse Primer; M13F: M13 forward Primer; ISH: In-situ-Hybridisierung;

bp: Basenpaare; Plasmide BDV-GP-N*, BDV-GP-C* subkloniert aus Plasmid „BDV-GP“; BDV-N:

BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-LE: leader-haltige +ssRNA; SDHA:

Succinat-Dehydrogenase-Komplex Untereinheit A; HPRT: Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I; GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

MATERIAL UND METHODEN 49 3.1.8 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (ISH)

In der ISH wurden mittels Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden BDV-spezifische positiv orientierte (+ss) RNAs, vorwiegend mRNA, nachgewiesen, die für die Virusproteine, BDV-GP, BDV-M und BDV-N kodieren. Der Nachweis der BDV-Intron I bzw. BDV-Intron II +ssRNA diente der Detektion von BDV-M-mRNA bzw. von BDV-GP-mRNA. Die Detektion der N +ssRNA diente als Referenz für die virale Transkriptionseffizienz. Aus dem BDV-Intron II-Bereich wurden der für den N-terminalen Abschnitt des BDV-GP kodierende Teil sowie der für den C-terminalen Abschnitt kodierende Bereich verwendet. Der C-terminale BDV-GP-Genanteil entsprach dabei dem translatierten Peptidabschnitt der für die Herstellung des Anti-BDV-GP-Antikörpers (3.1.6.) verwendet wurde. Weiterhin wurde die jeweils komplementäre genomische negativ orientierte (-ss) RNA dargestellt.

3.1.8.1 Sondenherstellung und In-vitro-Transkription

Als Ausgangsmaterial dienten die unter 3.1.7 hergestellten cDNA Klone (Tab. 5). Die für die In-vitro-Transkription benötigten cDNA Klone (3.1.7.7) wurden vorab mit dem GeneAmp^® PCR Core Kit (Applied Biosystems) und dem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik) amplifiziert. Um PCR-Produkte herzustellen, die das spezifische Insert und Bindungsstellen für die T3- bzw. T7-RNA-Polymerase besitzen, wurden die BDV-Primer mit den Primern M13 forward (M13F) und M13 reverse (M13R, MWG Biotech) kombiniert (Tab. 6). Dies ergab eine Sondengröße von Insert-Länge + 36 Nukleotide (nt). Für einen 50 µl Reaktionsansatz wurden 0,1 ng/µl der nicht linearisierten Plasmide, 1,25 mM MgCl2, 200 µM dNTP-Mix (Invitrogen), je 150 nM Primer und 1,25 U AmpliTaq^® DNA Polymerase eingesetzt.

Tab. 6: Verwendete Plasmide für die Sondensynthese Sonde Plasmid Sonden- reverse; M13F: M13 forward; T3: T3-RNA-Polymerase; T7: T7-RNA-Polymerase; as: antisense; s:

sense; +ssRNA = positiv orientierte RNA (sense Polarität); -ssRNA: negativ orientierte RNA (antisense Polarität); *: siehe Tab. 5; BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein

MATERIAL UND METHODEN 50

Die Amplifikation wurde bei einer annealing-Temperatur von 55 °C durchgeführt (3.1.7.4).

Nach 40 PCR-Zyklen folgte eine finale Elongation bei 72 °C für 10 Minuten mit Kühlung der Amplifikate bei 4 °C. Je 10 µl des PCR-Reaktionsansatzes wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Sofern die Primerkombinationen einzelne, klar umschriebene Banden ergaben, diente der restliche Reaktionsansatz der DIG-RNA-Sondenherstellung. Die Amplifikate für wurden mit dem NucleoSpin^® Extract II-Kit (Macherey-Nagel) aufgereinigt.

Die DIG-RNA-Sonden wurden mit dem DIG-RNA Labeling Mix, 10 x conc. (Roche Diagnostics) und den DNA-abhängigen T3- bzw. T7-RNA-Polymerasen (Roche Diagnostics) synthetisiert. Für die In-vitro-Transkription wurde pro Reaktionsansatz ca. 200 ng aufgereinigte DNA aus 3.1.8.1. eingesetzt, wobei nach der Transkription ein DNase I- (20 U/Reaktion, Roche Diagnostics) Verdau für 15 Minuten bei 37 °C erfolgte. Nach RNA-Präzipitation über Nacht bei -20 °C und Waschen des RNA-Pellets mit 70%igem Ethanol wurde das Pellet mit 100 µl DEPC-Aqua bidest. resuspendiert, 40 U Ribonuklease-Inhibitor (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) zugesetzt und bei -80 °C asserviert.

3.1.8.2 Durchführung der ISH

Die ISH wurde mit den in Tabelle 7 aufgelisteten DIG-markierten RNA-Sonden durchgeführt (ZURBRIGGEN et al., 1993; GAEDKE et al., 1997; WERNER-KEIŠS et al. 2008). Nach proteolytischem Verdau, Postfixation, Acetylierung und Prähybridisierung erfolgte die Hybridisierung in einer feuchten Kammer bei 52 °C. Zur Detektion wurde ein AP-konjugierter Anti-DIG-Antikörper (Roche Diagnostics), das Substrat Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (Sigma Aldrich) und 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat, Sigma Aldrich) verwendet.

Tab. 7: Konzentrationen der einzelnen BDV-Sonden

Sonde Konzentration/100 µl HB-Mix

BDV-N s 3 µl

BDV-N as 3 µl

BDV Intron I (BDV-M) as 5 µl

BDV Intron I (BDV-M) s 5 µl, DM 7 µl BDV-Intron II (BDV-GP-N)* as 5 µl

BDV-Intron II (BDV-GP-N)* s 1 µl BDV-Intron II (BDV-GP-C)* as 5 µl**

BDV-Intron II (BDV-GP-C) as DM 4 µl BDV-Intron II (BDV-GP-C)* s 5 µl/**

BDV-GP-N*as/s, BDV-GP-C*as/s: DIG-markierte RNA Sonden subkloniert aus Plasmid „BDV-GP“, HB-Mix: Hybridisierungs-Mix; DM: Doppelmarkierung (3.1.8.3); **: BDV-GP-C-Sonden wurden 1: 2 mit DEPC-Wasser vorverdünnt

3.1.8.3 Doppelmarkierungen

Eine ISH/IH-Doppelmarkierung zum Nachweis von BDV +ssRNAs in Astrozyten und Oligodendrozyten wurde 24 und 42 Tage p.i. (n=2 pro Zeitpunkt) durchgeführt (ULRICH et

MATERIAL UND METHODEN 51 al., 2006; WERNER-KEIŠS et al., 2008). In diesen Zelltypen wurde +ssRNA spezifisch für BDV-N, BDV-GP (Intron II) und BDV-M (Intron I) detektiert. Genomische RNA wurde 42 Tage p.i. nachgewiesen. Zuerst wurde die ISH mittels der BDV-N as-, BDV-N s-, BDV-Intron II (BDV-GP-C) as- und BDV-Intron I (BDV-M) as-Sonde gemäß 3.1.8.2 durchgeführt. Danach erfolgte die IH zum Nachweis von GFAP in Astrozyten und CNPase in Oligodendrozyten (3.1.6.2).

Die Immunhistologie wurde wie folgt modifiziert:

1. Kontrollseren

Als Kontrollserum für die monoklonalen Antikörper wurde Aszites nicht immunisierter Balb/cJ-Mäuse (ABgene^®) verwendet (3.1.6).

2. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)

Es wurde das ABC-Kit Peroxidase Elite Standard PK-6100 (Vector Laboratories) verwendet.

3. Die Durchführung erfolgte gemäß WERNER-KEIŠS et al. (2008) anhand des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vector Laboratories) und DAB (Sigma Aldrich) als Chromogen.

3.1.8.4 Kontrollen

Die Spezifität der Reaktionen wurde anhand folgender Kontrollen überprüft:

1. Als Negativkontrolle wurden Folgeschnitte der BDV-infizierten Rattengehirne mit reinem Hybridisierungs-Puffer (HB-Mix) ohne Zusatz einer Sonde inkubiert.

2. Mock-infizierte und nicht infizierte Kontrollgehirne wurden mit den BDV-Sonden versetzt.

3. Um unspezifische Reaktionen durch Bindung der den insertanhängenden Sequenzen bis zur T3/T7-Bindungsstelle auszuschließen, wurden einige Schnitte mit einer staupevirusspezifischen Sonde, die den entsprechenden Plasmidanteil enthielt, inkubiert.

4. Die Gehirnschnitte der BDV-infizierten Ratten dienten in der ISH selbst als Positivkontrollen, da immunhistologisch bereits BDV-N und BDV-GP nachgewiesen wurde.

4. Die Gehirnschnitte der BDV-infizierten Ratten dienten in der ISH selbst als Positivkontrollen, da immunhistologisch bereits BDV-N und BDV-GP nachgewiesen wurde.

Im Dokument Untersuchungen zu Pathogenese, Neurotropismus und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit (Seite 58-0)