Spezifische reverse Transkription

Für die Quantifikation BDV-spezifischer und zellulärer +ssRNA aus den Gehirnanschnitten, Gehirnarealen und definierten Zellpopulationen wurde die isolierte RNA zunächst mittels reverser Transkription (RTr) in cDNA unter Verwendung des Omniskript^® RT Kit (Qiagen) in einem Multicycler^® PTC 200 (Biozym Diagnostik) umgeschrieben. Um eine Quantifizierung viraler genomischer -ssRNA auszuschließen, wurde die RTr mittels des spezifischen antisense (as) Primers durchgeführt. Dazu wurden die in der real time RT-PCR eingesetzten as Primer (Tab. 10, 11) in einer Konzentration von 7,5 pmol/µl verwendet. Für jede in der real time RT-PCR zu untersuchende RNA wurde ein separater RT-Reaktionsansatz hergestellt.

1. RTr mit RNA aus Gehirnanschnitten und Gewebearealen: Es wurden die jeweiligen as Primer verwendet (Tab. 10). Die RNA-Stammlösungen aus den Gehirnanschnitten wurden mit DEPC-Aqua bidest. auf eine Gebrauchslösung von 25 ng/µl eingestellt, so dass pro Reaktion 150 ng RNA umgeschrieben wurden.

2. RTr mit RNA aus Einzelzellen: Aufgrund der minimalen RNA-Ausbeute bei Isolation der Einzelzellen wurde in der RTr nur N-, Intron-I-, Intron II (GP-N,

BDV-MATERIAL UND METHODEN 58

GP-C)- sowie GAPDH-spezifische cDNA mittels der in Tab. 10 genannten Primer synthetisiert. Die RNA-Eluate von 12 µl wurden mit DEPC-Aqua bidest. auf 31 µl aufgefüllt.

3. Kontrollen: Zum Ausschluss einer Kontamination durch die PEN-MembraneSlides oder das OCT-Einbettmedium wurden die Eluate aus 3.1.10.2 mit den Primer p333 (BDV-Nas) und p339 (GAPDHas) in die RTr eingesetzt.

Jeweils 6 µl RNA aus 3.1.10.2 wurden benötigt, um für jede zu quantifizierende RNA je 10 µl spezifische cDNA zu synthetisieren (Tab. 10). Der 10 µl RT-Reaktionsansatz bestand aus 1 x buffer RT, 0,526 mM dNTP-Mix, 5 U RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen), 2 U Omniskript^® Reverse Transkriptase und 7,5 µM as Primern (POROMBKA et al., 2008a, b). Die Arbeitsschritte der spezifischen RTr wurden gemäß 3.1.7.3 auf Eis pipettiert und die cDNA-Proben sofort bei –80 °C asserviert.

Tab. 10: Primer für die spezifische reverse Transkription Name. ID Sequenzen (5’ → 3’ Orientierung) BDV-N as p333 CAA GGC TGG GCG TTA CTG TAT G BDV-Intron I as p351 TTC CGT GAA GTC CCT CCT ACA AA

BDV-GP-N as p340 CAT TGC CTT TCC ACT CTC TAG CTC BDV-GP-C as p342 CCC CAG ACC CTA CTG TCC CTA

BDV-LE as p386 GGG TTC ATA TAA ATC TTG GTC CTC C SDHA as p322 CAA GGT GTG TAA GAG TGA GTG GC HPRT as p324 CCA GCA GGT CAG CAA AGA ACT TAT A GAPDH Taq as p339 GTT GAT GAC CAG CTT CCC ATT CT

ID: Interne Bezeichnung des Primers; s: sense Primer; as: antisense Primer; N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-LE: leader-haltige +ssRNA; SDHA: Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A; HPRT: Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I;

GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase 3.1.10.4 Durchführung der real time RT-PCR

Zur Quantifizierung der BDV +ssRNAs (außer BDV-LE) dienten die Sequenzen der DNA-Inserts von Plasmid III BDV-N, BDV-GP-N, BDV-GP-C und Plasmid I BDV-M als Vorlage für die Suche von Primern und TaqMan^®-Sonden (Tab. 4, 5, 11; Abb. 7).

Der Nachweis von leader-haltiger BDV +ssRNA (BDV-LE) erfolgte auf der Grundlage, dass nur die 3’-leader und 5’-trailer-Region des BDV nicht in subgenomische +ssRNA umgeschrieben werden. Daher können diese zur Unterscheidung von leader-haltiger BDV-RNA (BDV-LE) und BDV-Transkripten verwendet werden. Die Primer zum Nachweis von BDV-LE wurden so gewählt, dass der sense (s) Primer p385 in der 5’-terminalen nicht kodierenden Region stromaufwärts des BDV-N ORFs liegt. Die Länge dieser Region beträgt ca. 33 Nukleotide (He/80, GenBank Acc. No: AJ311522), so dass die Taqman^®-Sonde und der as Primer p386 sich in der S1-Startstelle bzw. im BDV-N ORF befinden. Zur Überprüfung der Sequenzübereinstimmung der ausgewählten Taqman^®-Sonde für die real time RT-PCR (Tab. 12) mit der BDV-Präparation 5/25/92) wurde eine PCR gemäß 3.1.7.4 unter

MATERIAL UND METHODEN 59 Verwendung der Primer p385 BDV-LE und des weiter stromabwärts gelegenen Primers p391 S1 II angefertigt (Tab. 12). Das resultierende PCR-Produkt (Amplifikatgröße 357 bp, Position 11-367, AJ311522) wurde sequenziert und mit der Taqman^®-Sonde verglichen. Als Negativkontrolle zum Ausschluss eines falsch positiven Nachweises von BDV-LE-+ssRNA durch die Bindung der Taqman^®-Sonde an BDV-N–spezifische Transkripte wurde das Plasmid BDV-S1 391 konstruiert (Tab. 5; POROMBKA et al., 2008a), das in der Transkriptionsinitiationsstelle S1 beginnt (Position 36-357, AJ311522). Das Plasmid hat die komplementären Bindungsstellen für die BDV-LE spezifische Taqman^®-Sonde, aber keine Bindungsstelle für den sense Primer. Bei Verwendung des Primerpaares p385/p386 und der entsprechenden Sonde (sense Polarität) können der antisense Primer und die Taqman^® -Sonde binden, der sense Primer jedoch nicht. Somit erfolgt weder eine Amplifikation noch Sonden-Hydrolyse. Weitere Kontrollen finden sich unter 3.1.10.4.2.

Für den Nachweis zellulärer mRNAs dienten Sequenzen aus der GenBank^® zur Suche von Primern und Taqman^®-Sonden. Es wurden dieselben Primerkombinationen wie für die Herstellung der jeweiligen Mengenstandards verwendet (Tab. 4, 5, 11).

Abb. 7: Schematische Darstellung der Lokalisation BDV-spezifischer Amplifikate

BDV-Genom, nach BRIESE et al. (1994) und CUBITT et al. (1994)

A: Amplifikate der äußeren Primer (3.1.7, Tab. 4, 5); 1a: Primerpaar p334/p335; 1b: Primerpaar p348/p349; 1c: Primerpaar p151/p152; 1d = Primerpaar 153/p154

B: Amplifikate der inneren Primer, die anhand der viralen Nukleotidsequenz aus A ermittelt wurden; 2a: Primerpaar p332/p333; 2b: Primerpaar p350/p351; 2c: Primerpaar p340/341; 2d:

Primerpaar 342/343

3.1.10.4.1 Primer und Taqman^®-Sonden

Primer und Taqman^®-Sonden wurden mittels Beacon Designer 2-Software (Primer Biosoft International, vertrieben durch PE Biosystems, Weiterstadt) gesucht (Tab. 11). Bei den TaqMan^®-Sonden handelt es sich um 5’-FAM-3’-TAMRA-markierte Oligonukleotid-Sonden (Eurogentec SA, Seraing, Belgien). Die Sondenlyophilisate wurden mit TE-Puffer (pH 8,0, 10.2.5) auf eine Konzentration von 50 µM und die Primerlyophilisate (MWG Biotech; Tab. 11) mit DEPC-Aqua bidest auf 15 µM eingestellt. Primer und Sonden wurden bei -20 °C gelagert.

N P

MATERIAL UND METHODEN 60

Tab. 11: Primer und Taqman^® Sonden für die real time RT-PCR

Name ID Sequenzen (5’ → 3’ Orientierung) Amplk Acc-No. BDV-Intron I probe AGG TAA TCG TCC CTG GAT GGC CCA

CAC

probe: Taqman^®-Sonde; bp: Basenpaare; Acc-No: GenBank^®-Accession-Nummer; Pos: Position in der veröffentlichten Sequenz; BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-LE:

leader-haltige BDV-+ssRNA; SDHA: Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A; HPRT:

Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I; GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

MATERIAL UND METHODEN 61 3.1.10.4.2 Reaktionsansatz für die real time RT-PCR

Um optimale Reaktionsbedingungen für jede spezifische Standard-Verdünnungsreihe zu erhalten, wurden für jedes Primer- und Sondenpaar die Anlagerungstemperatur und die jeweilige Primer- und TaqMan^®-Sondenkonzentration gemäß Introduction to Quantitative PCR, Methods and Application Guide (Stratagene 2005; Tab. 12) ermittelt. Die Durchführung erfolgte im Thermocycler Mx3005PTM Real-time PCR System (Stratagene). Als Matrize dienten 10⁷ Kopien/µl der entsprechend klonierten und amplifizierten DNA (3.1.10.1).

Tab. 12: Primer- und TaqMan^®-Sondenkonzentrationen und annealing-Temperaturen Bezeichnung ID Konz.

Primer Konz TaqMan^®-Sonde annealing

BDV-N s p332 200 nM

BDV-N as p333 300 nM 200 nM 63 °C

BDV-Intron I s p350 300 nM

BDV-Intron I as p351 300 nM 100 nM 60 °C

BDV-GP-N s p341 200 nM

BDV-GP-N as p340 300 nM 200 nM 60 °C

BDV-GP-C s p343 300 nM

BDV-GP-C as p342 300 nM 200 nM 62 °C

BDV-LE s p385 200 nM

BDV-LE as p386 300 nM 300 nM 60 °C

SDHA s p321 300 nM

SDHA as p322 300 nM 200 nM 61 °C

HPRT s p323 300 nM

HPRTas p324 300 nM 200 nM 61 °C

GAPDH Taq s p338 100 nM

GAPDH Taq as p339 100 nM 100 nM 62 °C

ID: Interne Bezeichnung des Primers; Konz: Konzentration; s: sense Primer; as: antisense Primer;

BDV-N: BDV-Nukleoprotein; BDV-GP: BDV-Glykoprotein; BDV-LE: leader-haltige BDV-+ssRNA;

SDHA: Succinat-Dehydrogenase-Komplex, Untereinheit A; HPRT: Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase I; GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

Die Quantifizierung viraler und zellulärer cDNAs erfolgte mit dem Brilliant^® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene) und TaqMan^®-Sonden (Eurogentec) in einem Thermocycler Mx3005P Real-time PCR System (Stratagene) mit dem Fluophor ROX als passiver Referenz-Farbstoff. Zur Korrektur möglicher intraexperimenteller Variationen wurden die cDNA-Proben aus 3.1.10.3, log₁₀-Mengenstandards (10⁷ bis 10¹ Kopienzahlen/µl, 3.1.10.1), Negativkontrollen (NTC) und Positivkontrollen grundsätzlich als Duplikate in die real time RT-PCR eingesetzt. Als Positivkontrolle und zur Korrektur möglicher interexperimenteller Variationen diente gleichermaßen isolierte und umgeschriebene cDNA aus gepoolten Gehirnanschnitten BDV-infizierter Lewis-Ratten (42 Tage p.i.).

Zum Nachweis von BDV-LE wurden zusätzliche Kontrollen durchgeführt. Um eine mögliche Hydrolyse der TaqMan^®-Sonde nach Binden an BDV-N-spezifische cDNA auszuschließen,

MATERIAL UND METHODEN 62

wurde in jedem PCR-Lauf zum Nachweis von BDV-LE zusätzlich als Negativkontrolle ein Amplifikat des Plasmids BDV-S1 (BDV-S1) als Matrize verwendet. Die Plasmid-DNA wurde in einer PCR gemäß 3.1.10.1 unter Verwendung der Primer M13 forward und M13 reverse vervielfältigt und in einer Konzentration von 10⁹ Kopien/µl sowie den BDV-LE spezifischen Primern (p385/p386) eingesetzt. In einem zweiten Doppelansatz wurde der Primer p385 durch den Primer T7 (Tab. 4, 5) in der real time RT-PCR ersetzt, um die Abhängigkeit des Fluoreszenz-Signals vom Binden des sense Primers zu verdeutlichen. Zum Ausschluss eines falsch negativen Ergebnisses durch Fehlen von BDV-S1-spezifischen Amplifikaten in der 10⁹ Kopien/µl-Verdünnung wurde zusätzlich eine Standard-PCR (3.1.7.4) mit den Primerpaaren M13 forward/M13 reverse, p389/391 und p385/386 sowie den BDV-S1-spezifischen Amplifikaten als Matrize durchgeführt.

Die Amplifikation der jeweiligen cDNA erfolgte mittels des Brilliant^® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene) in einem Reaktionsansatz von 25 µl mit 1 x Core PCR buffer, 5 mM MgCl₂, 800 µM dNTPs, 76 nM ROX Referenzfarbstoff, 0.625 U SureStart^® Taq DNA-Polymerase, Primern und Taqman^®-Sonde (Tab. 12) und 1 µl cDNA als Matrize (POROMBKA et al., 2006, 2008a, b). Die real time RT-PCR wurde als two-step-PCR mit Primeranlagerung und Elongation der DNA-Matrize in einem PCR-Schritt durchgeführt. Während dieser Phase erfolgte die Aufzeichnung der Fluoreszenz. Die Amplifikation fand in 40 Zyklen für jedes Primer- und Sonden-Paar, der spezifischen annealing-Temperatur mit Denaturierung und Aktivierung der SureStart^® Taq Polymerase bei 95 °C für 10 Minuten, Denaturierung bei 95

°C für 15 Sekunden und annealing/Elongation (Tab. 12) für 1 Minute statt.

3.1.10.5 Quantifizierung und Normalisierung der Genexpression

Während der Amplifikation mit dem Thermocycler Mx3005PReal-time PCR System und der Software Mx3005P Version 2.02 (beides Stratagene) wurde die vom Reporter-Farbstoff (FAM) und Referenz-Farbstoff (ROX) emittierte Fluoreszenz von dem Gerät aufgezeichnet und der Quotient beider Farbstoffe (Emission Reporter/Emission Referenzfarbstoff) berechnet und so die Hintergrundfluoreszenz (normalisiertes Reportersignal, Rn-Wert) bestimmt. Durch die Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz (Rn- Wert) der ersten PCR-Zyklen vom relativen Reportersignal (Rn+ Wert) wurde der ∆-Rn-Wert ermittelt. Der PCR-Zyklus, bei dem die Fluoreszenz signifikant über der Hintergrundfluoreszenz lag, wurde als threshold cycle (Ct) definiert. Durch die graphische Darstellung der initialen DNA-Kopienzahlen der jeweiligen log₁₀-Standard-Verdünnungsreihen auf der x-Achse gegen die Werte auf der y-Achse wurde die jeweilige Standardkurve erstellt. Durch Vergleich der Ct-Werte der zu quantifizierenden Proben wurde von diesen die Startkopienzahl errechnet.

Um mögliche Kopienzahlverluste bedingt durch die RNA-Isolation bzw. die RTr auszugleichen, wurde für die Proben aus den Gehirnanschnitten und Gehirnarealen (CPu, AH) aus den housekeeping-Genen GAPDH, HPRT und SDHA ein spezifischer

MATERIAL UND METHODEN 63 Normalisierungsfaktor berechnet. Dazu wurde die von VANDESOMPELE et al. (2002) beschriebene Genorm-Methode und die online erhältliche software geNorme VBA applet for Microsoft Excel (hppt://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) verwendet. Die viralen Kopienzahlen wurden im Folgenden durch diesen Normalisierungsfaktor dividiert. Aufgrund der geringen RNA-Ausbeute bei der Isolation von Einzelzellen erfolgte die Normalisierung nur durch Bildung der Differenz mit GAPDH als housekeeping-Gen. Die statistische Auswertung findet sich unter 3.1.12.

3.1.11 NACHWEIS VON INFEKTIÖSEM BDV

Der Nachweis von infektiösem BDV wurde freundlicherweise von Frau Dr. Herzog, Institut für Virologie, Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen an OCT-GG BDV-infizierter Lewis-Ratten (50 und 75 Tage p.i.) unter Verwendung embryonaler Kaninchen-Gehirnzellen (REB) durchgeführt. Die Ermittlung des Virustiters erfolgte nach HERZOG und ROTT (1980) mittels indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT). Die Titerhöhe wurde nach REB-ID50 (infektiöse Dosis 50 für embryonale Kaninchen-Gehirnzellen) bestimmt und der Virustiter nach REED und MÜNCH (1938) berechnet.

3.1.12 STATISTISCHE AUSWERTUNG

Die statistische Aufarbeitung der histopathologischen Befunde und Nachweise der residenter Gehirnzellen, der semiquantitativen Auswertung der morphologischen Nachweise der BDV-Antigene (3.1.6) und BDV-RNAs (3.1.8) erfolgte mittels des Programms SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., 1999). Mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests wurden die Veränderungen über die Zeit global analysiert. Anschließend wurde als nicht parametrische Ein-Weg-Varianzanalyse der Wilcoxon-Zwei-Stichproben-Test zum paarweisen Gruppenvergleich angewandt. Ergebnisse mit p≤0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Die statistische Analyse der Ergebnisse der quantitativen morphologischen Auswertung der Proteine BDV-N und BDV-GP sowie deren korresondierenden RNAs im Ammonshorn (3.1.6.4, 3.1.8.5) wurde freundlicherweise von Dr. Failing, Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen mit dem Statistikprogrammpaket BMDP/Dynamic, Release 7.0 (DIXON, 1993) durchgeführt.

Die statistische Analyse basierte auf der durchschnittlichen Anzahl positiver Zellen pro mm². Die Beschreibung der Daten aus IH und ISH erfolgte anhand des Programms BMDP1D. Zur statistischen Prüfung des Gruppeneinflusses wurde beim Gruppenvergleich der vier verschiedenen dpi-Gruppen je nach Verteilungstyp der gemessenen Variablen die einfaktorielle Varianzanalyse (Test bei annähernder Normalverteilung; Programm BMDP7D) oder der Kruskal-Wallis-Test (nicht parametrischer Test; Programm BMDP3S) verwendet.

Der zusätzliche Vergleich verschiedener Zellkompartimente wurde mittels einer zweifaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholungen bezüglich des Faktors „Expression

MATERIAL UND METHODEN 64

von BDV-N und BDV-GP und ihrer korrespondierenden RNAs“ mit dem Programm BMDP2V durchgeführt. Wies der globale Vergleich signifikante Unterschiede zwischen den Kompartimenten auf, so wurde zwischen jeweils zwei Variablen bei vergleichsbezogenem Signifikanzniveau paarweise verglichen. Die Signifikanz wurde hier durch eine α-Adjustierung nach Bonferoni angeglichen. Bei der Bewertung der Signifikanzen wurde das Signifikanzniveau α = 0,05 zugrunde gelegt, d.h. Ergebnisse mit p≤ 0,05 galten als statistisch signifikant.

Die Auswertung der Quantifizierungsdaten der BDV-spezifischen +ssRNAs erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Zur Aufarbeitung der erhobenen Messwerte (Gehirnschnitt, Gehirnareale und Einzelzellen) wurde das Programm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., USA) verwendet. Nach einem Kolmogorov-Smirnov-Test zur Prüfung auf Normalverteilung wurde der Einfluss des zeitlichen Verlaufs (Gehirnanschnitte, Gehirnareale und Einzelzellen) bzw. der Effekt der jeweiligen Gehirnregion/Zellpopulation (Gehirnareale und Einzelzellen) auf das quantitative Vorkommen BDV-spezifischer +ssRNAs getestet. Der Einfluss des Zeitpunkts p.i. auf die Menge der im Gehirnschnitt nachgewiesenen BDV- +ssRNAs wurde durch einfaktorielle Varianzanalyse mit dem Ryan-Einot-Gabriel-Welsch-Multiple-Range (REGWQ)-Test für unabhängige Werte bestimmt. Der Einfluss des Zeitpunkts p.i. und der jeweiligen Gehirnregion bzw. des Zelltyps auf die Menge BDV-spezifischer Transkripte wurde mit einer zweifaktoriellen Varianzanalyse für gemischte Modelle mit REGWQ-Test untersucht. Prinzipielle quantitative Unterschiede der einzelnen +ssRNAs zwischen beiden Gehirnregionen wurden mit einem t-Test für abhängige Werte überprüft.

Der Tukey’s post-hoc-Test für multiple paarweise Vergleiche wurde für alle Daten verwendet, um die Kopienzahlen: a) aller BDV +ssRNAs innerhalb eines Zeitpunkts, b) der gleichen BDV +ssRNAs zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. und c) der gleichen BDV +ssRNA eines Zeitpunkts p.i. in verschiedenen Regionen/Zellpopulationen zu untersuchen.

Der Bewertung wurde ein Signifikanzniveau von α=0,05 zugrunde gelegt und Ergebnisse mit einem Wert von p<0,05 wurden als statistisch signifikant bewertet.

MATERIAL UND METHODEN 65 3.2 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON TNF-TRANSGENEN MÄUSEN

3.2.1 VERSUCHSTIERE UND TIERHALTUNG

Die Ausgangszuchtpaare der TNF-transgenen (tg) und nicht transgenen (ntg) Mäuse mit C57Bl/6 x BDF-Hintergrund wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Eisel, Institut für Molekulare Neurobiologie, Rijksuniversiteit Groningen, Niederlande, überlassen. Die weitere Nachzucht erfolgte im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

In den transgenen Tieren wird das murine TNF unter der Kontrolle der NR2B-Untereinheit des NMDA-Glutamatrezeptors exprimiert (Abb. 8), die zu einer selektiven TNF-Überexpression in Ammonshorn, Cortex cerebri, Thalamus und Striatum führt (MARCHETTI et al., 2004). Die ntg Mäuse stammten aus der Verpaarung von heterozygot transgenen (tg+/-) Tieren oder aus Einkreuzung von C57Bl/6-Wildtyp- (wt) Mäusen in tg Mäuse.

Abb. 8: Schema des NR2B-Promotor-TNF-Konstruktes

Die Exons der Promotorregion sind als weiße Boxen 1-3 angegeben. Die translatierten Exons des murinen TNF-cDNA-Fragmentes sind als schwarze Boxen dargestellt. Am 3’- Ende befindet sich zur Stabilisierung die 3’ untranslatierte Region des humanen β-Globulins.

Kontrolltiere, BDV- und mock-infizierte Mäuse wurden unter standardisierten Bedingungen im Tierstall des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in einem individuell belüfteten Käfigsystem (Tecniplast Deutschland, Hohenpeißenberg) gehalten. In jedem Käfig befand sich zusätzlich ein Mouse House (Tecniplast). Die Zuchttiere wurden in einem Zuchtstall im Überdrucksystem gehalten, während BDV- und mock-infizierte Tiere im Infektionsstall im Unterdrucksystem gehalten wurden (10.1). In beiden Räumen erfolgte die Beleuchtung durch Neonröhren in einem Tag-Nachtrhythmus von 12 Stunden.

Die Raumtemperatur betrug 20-24 °C, die relative Luftfeuchte 50-60 %. Als Einstreu wurde Sägemehl (ssniff bedding ¾ Faser, ssniff, Soest) verwendet. Während der ersten 21 Lebenstage wurde energetisch hochwertiges pelletiertes Futter (ssniff M-Z, Ereich, 15 mm energiereich) angeboten, nach dem Absetzten wurde auf energieärmeres Futter umgestellt (ssniff R/M-Haltung, 10 mm). Wasser und Futter standen ad libitum zur Verfügung.

Alle Arbeiten an den Versuchstieren erfolgten mit Einweghandschuhen unter einer Laminar flow (HeraSafe Heraeus, Kendro Laboratory Products, Hanau). Zur Desinfektion der Werkbank und als Zwischendesinfektion aller Materialien, die mit den Tieren in Kontakt kamen, wurde 1%iges Venno Vet 1 super (Menno Chemie) für 2 h bei Raumtemperatur

NR2B TNF ß - ^Globulin

2

500bp

Promoter und 5’UTR 3 ’ UTR

3 1

-

2

500bp 3 ’ UTR

3

1

MATERIAL UND METHODEN 66

verwendet, danach wurde die Werkbank für 2 h mit UV-Licht bestrahlt. Die Käfige wurden wöchentlich bei 123 °C und 1,15 bar für 20 Minuten autoklaviert.

3.2.1.1 Analyse des transgenen Status der Mäuse mittels real time PCR

Die DNA zur Analyse des transgenen Status wurde aus Mäuseschwänzen mittels E.N.Z.A.^® Tissue DNA Mini Kit (Peqlab, Erlangen) isoliert. Zur Ermittlung des transgenen Status der Tiere wurde das Comparative Quantification Protocol des Mx 4000 Multiplex Quantitative PCR Systems (Stratagene) mit SYBR^®-Green (Stratagene) als Farbstoff gewählt. DNA eines im Herkunftsbestand homozygot getesteten Tieres diente als Kalibrator, das housekeeping-Gen Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) fungierte als normalizer. Als weitere Normalisierung diente der passive Referenz-Farbstoff ROX. Je ein definiertes Tier der drei Mausgruppen (homozygot [tg+/+], heterozygot [tg+/-], nicht transgen [ntg]) wurde in jedem Lauf als Kontrolle mitgeführt. Alle Proben wurden in einem Doppelansatz gemessen.

Tiere mit einer relativen Quantität (dRN) von 0,0 wurden als nicht transgen, eine dRN von 0,3 – 0,7 galt als heterozygot und eine dRN größer oder gleich 0,8 als homozygot transgen.

Das Prinzip der comparative quantification basiert darauf, dass die Differenz des Schwellenwertes (threshold Cycle, Ct) des interessierenden Gen (gene of interest, GOI, hier TNF) und des Ct eines normalizer (hier Housekeeping-Gen GAPDH) gebildet wird (∆Ct; Abb.

10). Dies wird für die unbekannten Proben und für den Kalibrator durchgeführt. Danach wird für jede Probe die Differenz des berechneten ∆Ct mit dem ∆Ct des Kalibrators gebildet (∆∆Ct). Unter der Vorraussetzung, dass die Effizienz der PCR für GOI und den normalizer, die Menge des GOI und des normalizers in den Proben annährend gleich sind, und unter der Annahme, dass die Effizienz gegen 2 geht, d.h. dass sich die Amplifikatmenge bei jedem Lauf verdoppelt, berechnet sich die relative Quantität als 2^-∆∆Ct (Abb. 9).

Abb. 9: Berechnung der relativen Quantität eines Genes Ct GOI - Ct norm = ∆Ct

∆Ct Probe - ∆Ct Kalibrator = ∆∆Ct Relative Quantität = 2^-∆∆Ct

Ct: Schwellenwert (threshold cycle); GOI: gene of interest (TNF);

norm: normalizer (GAPDH); Kalibrator: Sicher homozygotes Tier

Die Amplifikation der jeweiligen cDNA erfolgte mittels Brilliant^® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene) und SYBR^®-Green (Stratagene) als Farbstoff in einem Reaktionsansatz von 25 µl mit 1 x Core PCR buffer, 2,5 mM MgCl₂, 800 µM dNTPs, 8% Glycerol, 3% DMSO; 0,5 x SYBR^®-Green I, 30 nM ROX Referenzfarbstoff, 0.65 U SureStart^® Taq DNA Polymerase, je 150 nm Primer (Tab. 13) und 1 µl Maus-DNA. TNF und der Kalibrator wurden unter der gleichen Reaktions- und Temperaturbedingungen inkubiert.

MATERIAL UND METHODEN 67 Tab. 13: Primer zur Analyse des transgenen Status der Mäuse

Gen

Die real time PCR wurde wie folgt durchgeführt: Denaturierung, Aktivierung der SureStart^® Taq bei 95 °C für 10 Minuten, 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, annealing bei 55 °C für 1 Minute, Elongation bei 72°C für 30 Sekunden, danach 41 Zyklen zur Erstellung der Schmelzkurve bei 55 °C ↑ für 30 Sekunden. Dazu wurde mit jedem Zyklus die Temperatur um 0,5 °C erhöht. Anhand der Schmelzkurve konnte die Spezifität der Primerbindung überprüft werden. Eine spezifische Schmelzkurve war Vorraussetzung für die Auswertung der real time PCR-Analyse.

3.2.2 VIRUSPRÄPARATION

Die mausadaptierte BDV-Präparation wurde freundlicherweise von Herrn Prof. Staeheli, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abt. Virologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, überlassen und für weitere Versuche entsprechend vermehrt und passagiert. Die Bestimmung des Virustiter durch Frau Dr. Herzog, Institut für Virologie der Justus-Liebig-Universität Gießen ergab einen Titer von 6 x 10⁵ ID50/ml. Direkt vor der Infektion wurde die Virussuspension in BHK-21 Medium 1:10 verdünnt.

3.2.3 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG

Die Mäuse wurden entsprechend ihrem transgenem Status in die drei Gruppen ntg, tg+/ und tg+/+ eingeordnet. Die Tierversuche wurden gemäß den Bestimmungen für genehmigungspflichtige Tierversuche durchgeführt (AZ 509.6-42502-03/679).

3.2.3.1 Infektion der Versuchstiere und Kontrollen

Transgene und nicht transgene Mäuse der drei Gruppen (n=5 pro Zeitpunkt p.i.) wurden innerhalb des ersten Lebenstages i.c. mit einer Hamilton-Spritze (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) in den linken Cortex cerebri mit ca. 10 µl der 10 %igen BDV-infizierten Gehirnsuspension infiziert. Als Kontrolle wurden Tiere gleichermassen mit einer Suspension aus Gehirnmaterial nicht infizierter adulter Mäuse inokuliert (Mock-Infektion; n=2 pro

Transgene und nicht transgene Mäuse der drei Gruppen (n=5 pro Zeitpunkt p.i.) wurden innerhalb des ersten Lebenstages i.c. mit einer Hamilton-Spritze (Hamilton, Bonaduz, Schweiz) in den linken Cortex cerebri mit ca. 10 µl der 10 %igen BDV-infizierten Gehirnsuspension infiziert. Als Kontrolle wurden Tiere gleichermassen mit einer Suspension aus Gehirnmaterial nicht infizierter adulter Mäuse inokuliert (Mock-Infektion; n=2 pro

Im Dokument Untersuchungen zu Pathogenese, Neurotropismus und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit (Seite 75-0)