Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Romifidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Romifidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Thea Irene Hammer

aus Siegen

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Privatdozent Dr. B. Ohnesorge

Tag der mündlichen Prüfung: 26.Mai 2004

Meinen Eltern, Geschwistern, Paten und Freunden in Dankbarkeit für die stetige Unterstützung

INHALTSVERZEICHNIS

VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN

I. EINLEITUNG 1

1 Zielsetzung der Arbeit 2

II. LITERATURÜBERSICHT 4

1 Definition des Dopingbegriffs und Dopingbestimmungen im Pferdesport 4 1.1 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen

mit Vorschriften für die Leistungsprüfungen der Vollblutzucht

mit Änderungen bis Januar 2002 4

1.2 Satzung und Ordnungen des Hauptverband für Traber-Zucht

und –Rennen e.V. (HVT) mit Inkraftsetzung zum 01.02.2003 5 1.3 Deutsche Reiterliche Vereinigung e.V. (FN) 6

2 Aspekte des Tierschutzes 10

3 Formen des Dopings 11

4 Allgemeine pharmakokinetische Grundprinzipien 16

5 2-Adrenozeptor-Agonisten 24

5.1 Pharmakodynamische Daten von Romifidin und anderen 2-Agonisten 25

5.2 Pharmakokinetische Daten von Romifidin 35

5.3 Möglicher Einsatz von Romifidin im Doping 36

6 Statistische Daten zum Vorkommen von Romifidin bei Dopingkontrollen 37

7 Analytik 38

III. MATERIAL UND METHODE 42

1 Aufbau des Experiments und Versuchsplanung 42

1.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 43

1.2 Testsubstanz 44

1.3 Vorversuch 44

1.4 Versuchsablauf 44

1.5 Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung 47

2 Methodenentwicklung 47

2.1 Herstellung der Eichlösungen 47

2.2 Chromatographie 48

2.3 Erstellung der mit Romifidin und internem Standard versetzten Proben 48 2.4 Extraktionsversuch über Cartridges (Festphasenextraktion) 49

2.5 Hydrolyseversuch für Urin 52

2.6 Ergebnisse der Vorarbeiten zur Methodenentwicklung 52

2.7 Ausrüstung und Geräte 53

2.8 Chemikalien 54

3 Validierung der Methode 54

3.1 Selektivität 55

3.2 Linearität 55

3.3 Nachweis- und Quantifizierungsgrenze 56

3.4 Richtigkeit 57

3.5 Präzision 58

3.6 Stabilität 59

3.7 Wiederfindung 60

4 Erstellung der Kalibrationskurven im Plasma des Ausscheidungsversuches 61 4.1 Aufarbeitung der Plasmaproben des Ausscheidungsversuches 61 5 Erstellung der Kalibrationskurven im Urin des Ausscheidungsversuches 62

5.1 Aufbereitung der Urinproben 63

6 Statistische Auswertung 64

IV. ERGEBNISTEIL 66

1 Validierung der Analysenmethode 66

1.1 Selektivität 68

1.2 Linearität 70

1.3 Nachweis- und Quantifizierungsgrenze 72

1.4 Richtigkeit 72

1.5 Präzision 73

1.6 Stabilität 74

1.7 Wiederfindung 75

2 Plasma- und Urinkonzentration von Romifidin beim Pferd 76

2.1 Plasma 76

2.2 Hydrolyse von Romifidin im Pferdeurin 81

2.3 Urin 82

3 Pharmakodynamik von Romifidin 85

3.1 Herzfrequenz 85

3.2 Atemfrequenz 86

3.3 Körperinnentemperatur 87

3.4 Ausschaltung des Schmerzempfinden 88

3.5 Reaktion auf akustische Reize 89

3.6 Reaktion auf visuelle Reize 89

3.7 Zeichen der Sedationstiefe 90

4 Berechnung der effektiven und irrelevanten Plasma- und Urinkonzentration 92

V. DISKUSSION 98

1 Eignung der erstellten Analysemethode (HPLC-MS/MS) für den Nachweis

von Romifidin in Plasma und Urin 98

2 Pharmakokinetik von Romifidin 101

2.1 Plasma 101

2.2 Urin 105

3 Berechnungen zur irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von

Romifidin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) 107

4 Pharmakokinetische Erkenntnisse im Vergleich mit pharmakodynamischen

Parametern 110

5 Bewertung der Ergebnisse 112

VI. ZUSAMMENFASSUNG 116

VII. SUMMARY 118

VIII. LITERATURVERZEICHNIS 120

IX. ANHANG 135

Verzeichnis der Abkürzungen

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

Abb. Abbildung

AUC Area under the curve

CL Clearance

Cmax maximale Plasmakonzentration

CPlasmaØ durchschnittlichePlasmakonzentration bzw. beziehungsweise

DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee EPC effektive Plasmakonzentration

fda Food and drug administration center for veterinary medicine FEI Federation Equestre International

FN Reiterliche Vereinigung e.V., Warendorf GC Gaschromatographie

°C Grad Celsius

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.

HWZ Halbwertszeit

IPC irrelevante Plasmakonzentration IUC irrelevante Urinkonzentration i.v. intravenös

K_el Geschwindigkeitskonstante der Elimination

kg Kilogramm

KM Körpermasse

l Liter

LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantification

LPO Leistungsprüfungsordnung der FN

mg Milligramm

mmol Millimol

min Minute

MM Molmasse

MS Massenspektrometrie

ng Nanogramm

n.g. nicht genommen n.n. nicht nachweisbar

NSAID nichtsteroidales Antiphlogistikum NSAIDs nichtsteroidale Antiphlogistika p.a. post applikationem

Pfd. Pferd

RO Rennordnung des DIR SF Sicherheitsfaktor

SOP Standard Operation Procedure

R_ss Verhältnis von Harn- zu Plasmakonzentration im Steady State t₅₀(b₁) Halbwertszeit für die Verteilungsphase

t50(b2) terminale Halbwertszeit

tA Ausscheidungsgeschwindigkeit tA(IPC) Zeit, bis zum Erreichen der IPC Tab. Tabelle

TBME tertiär-Butylmethylether u.a. und andere

U.S. United States of America

Vc Verteilungsvolumen des zentralen Kompartiments Vss Verteilungsvolumen im Steady State

Vd Verteilungsvolumen in der Eliminationsphase

I. Einleitung

Der Einsatz von Arzneimitteln, wie er im Rahmen der tierärztlichen Therapie erfolgt, kann zu einem positiven Dopingbefund bei Sportpferden führen, wenn zwischen dem Zeitpunkt der Behandlung und der Kontrolle nicht genügend Zeit verstrichen ist. Dies gilt auch, wenn keine bewusste Leistungsbeeinflussung vorliegt, da allein der Nachweis von Wirkstoffen beanstandet wird (unabsichtliches Doping). Um derartige Befunde bei notwendigem Arzneimitteleinsatz zu vermeiden, ist eine Verbesserung des Wissenstandes über die Pharmakokinetik, insbesondere über die Nachweisdauer in Blut und Harn des Pferdes notwendig.

Grundsätzlich besteht im deutschen Tierschutzgesetz ein Doping-Verbot (siehe Seite 14).

Tierärzte, die Sportpferde behandeln, können oftmals im Einzelfall nicht mit ausreichender Sicherheit abschätzen, wann welches Medikament eingesetzt werden kann, ohne gegen bestehende Dopingreglementierungen der Sportverbände zu verstoßen. Gemäß der Richtlinien der Internationalen Reiterlichen Vereinigung (FEI) ist beispielsweise das Vorhandensein von Substanzen, die auf das Herz-Kreislauf-, Atmungs-, Verdauungs- oder Muskelsystem wirken, zum Zeitpunkt eines Wettkampfes verboten und gilt als Doping. Dieser Grundsatz wird ebenfalls vom Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V. (HVT) in seinen Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping vertreten. Die Deutsche Reiterliche Vereinigung (FN) differenziert in der Leistungsprüfungsordnung zwischen „Doping-Substanzen“ wie Sedativa, Narkotika sowie anabole Wirkstoffe u.a. und

„verbotenen Substanzen“. Zu letzteren zählen beispielsweise Substanzen, die auf das Nervensystem, das Herz-Kreislauf- oder das Atmungssystem wirken. Auch die Rennordnung des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (DIR) führt in der Liste IV der Rennordnung

„unerlaubte Mittel“ auf. Hierzu gehören verschiedene Substanzen, die als Dopingmittel gelten (beispielsweise Sedativa, Stimulantien und andere).

Im Zusammenhang mit einer möglichen Dopinguntersuchung bei einem Turnier wird von Pferdebesitzern oder Trainern sowie den behandelnden Tierärzten immer wieder die Frage gestellt, wie lange ein therapeutisch eingesetztes Medikament vor einem Wettkampf abgesetzt sein muss, damit bei einer Kontrolle kein positives Ergebnis resultiert. Befriedigende

Aussagen können diesbezüglich häufig nicht getroffen werden, da das Fehlen entsprechender pharmakokinetischer Daten und eine Streuung der bislang vorhandenen Werte für therapeutisch eingesetzte Substanzen validen Aussagen über Wirkungsdauer und Eliminationszeiten enge Grenzen setzt.

Ein Ansatz zur Lösung des Problems wird vom European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) bearbeitet. Das EHSLC ist eine Vereinigung von Pferdesportverbänden aus fünf der europäischen Gemeinschaft angehörenden Staaten, nämlich Großbritannien, Frankreich, Italien, Irland und Deutschland. Unter standardisierten Bedingungen sollen pharmakokinetische Untersuchungen mit in den Dopinglisten aufgeführten Substanzen durchgeführt werden. Die ermittelten pharmakokinetischen und klinischen Daten sollen schließlich in ein von TOUTAIN und LASSOURD (2002) entwickeltes PK/PD-Modell eingebracht werden. Ziel der darin aufgeführten Berechnungen ist es, für therapeutisch eingesetzte Wirkstoffe Urin- und Plasmakonzentrationen zu ermitteln, in denen die einzelne Substanz keinerlei Wirkung auf den Organismus aufweisen, so dass eine Beeinflussung des Pferdes durch das Medikament ausgeschlossen werden kann.

1 Zielsetzung der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, pharmakokinetische Untersuchungen mit Romifidin, einem alpha2-Adrenozeptor-Agonisten, an Pferden durchzuführen, wobei vorab eine geeignete Analysemethode auf einem High Pressure Liquid Chromatographen (HPLC) zu erarbeiten war. Grundlage für die Entwicklung einer praktikablen Methode waren etablierte Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln. Neben der Entnahme von Plasma- und Urinproben zur Untersuchung des Ausscheidungsverhaltens der Substanz wurden gleichzeitig pharmakodynamische Wirkungen wie Herz- und Atemfrequenz sowie die Sedationstiefe erfasst. Die erhaltenen Daten sollen mit Hilfe von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Modellen (TOUTAIN u. LASSOURD, 2002) quantitativ verknüpft werden. Die daraus ermittelten Daten sollen Plasma- und Urinkonzentrationen darstellen, bei denen eine relevante pharmakologische Wirkung von

Romifidin auf den Organismus ausgeschlossen werden kann. Die ebenfalls ermittelten Ausscheidungszeiten geben an, wie lange die Substanz im Körper verweilt. Sie sollen allerdings nicht als Anhaltspunkt für einen Einsatz von Romifidin vor einem Wettkampf angesehen werden.

II. Literaturübersicht

1 Definition des Dopingbegriffs und Dopingbestimmungen im Pferdesport

Laut UNGEMACH (1985) ist Doping im Pferdesport definiert als „unerlaubte Verabreichung eines jeden Mittels, außer normaler Ernährung, das geeignet sein kann, die natürliche und aktuelle Leistungsfähigkeit eines Pferdes zum Zeitpunkt des Rennens zu beeinflussen“.

Die in den letzten zwei Jahren veröffentlichten Veränderungen der Dopingreglementierungen der verschiedenen Pferdesportorganisationen beinhalten einige Aktualisierungen der Dopingbestimmungen. Trotz dieser Änderungen bleiben Unterschiede zwischen einzelnen Reglements bestehen. Jede Pferdesportorganisation behält somit ihre eigenen Vorschriften und Definitionen für die von ihr repräsentierten Disziplinen. Auffallend ist, dass die Pferdesportorganisationen den Begriff „Doping“ nach den jeweiligen Vorstellungen eigen- ständig darstellen und keine die Organisationen übergreifende Definition existiert. Mit welchen Begriffen dabei gearbeitet wird, ist bei der Übersicht der einzelnen Verbände gesondert aufgeführt. Zur Verdeutlichung dieser Differenzen werden im Nachfolgenden Ausschnitte aus den Dopingbestimmungen der einzelnen Organisationen dargelegt.

1.1 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen mit Vorschriften für die Leistungsprüfungen der Vollblutzucht mit Änderungen bis Januar 2002

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt XIV der Rennordnung (2002).

Hier sind die „Unerlaubten Mittel“ - „Doping“ aufgeführt. Der erste Unterpunkt

„Allgemeines“ beinhaltet unter den Nummern 529 und 530 folgende Bestimmungen:

„529. Kein Pferd darf zum Zeitpunkt des Rennens in seinem Gewebe, seinen Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen ein unerlaubtes Mittel aufweisen.

530. Einen Verstoß begeht, wer diese Mittel anwendet, deren Anwendung versucht, bei ihr mitwirkt oder sie pflichtwidrig ermöglicht. Einen Verstoß begeht ein Trainer, bei dessen von ihm trainierten Pferden Substanzen solcher Mittel nachgewiesen werden.“

(RENNORDNUNG, 2002, S. 127)

Die Ausführungen der Nummer 530 limitieren den Begriff des Dopings nicht nur auf die verbotene Anwendung der unerlaubten Substanzen, sondern weiten den Begriff auf den Versuch der Anwendung, auf das Mitwirken bei einer Anwendung und auf die Ermöglichung der Anwendung unerlaubter Mittel aus (SCHOENE, 1996). Daneben bezieht sich der Verstoß auch gegen im Training angewandte unerlaubte Mittel, die zum Zeitpunkt des Rennens unter Umständen nicht mehr nachzuweisen sind.

„532. Das Direktorium ist befugt, durch Beauftragte von allen im Training befindlichen Pferden jederzeit Dopingproben entnehmen zu lassen….“ (RENNORDNUNG, 2002, S. 127)

Mit diesen Trainingskontrollen versucht das Direktorium über die Rennordnung eine Anwendung jeglicher Arzneimittel bei einem in den Vorbereitungen zum Wettkampf stehenden Pferd zu unterbinden. Einerseits soll dies die Pferde vor unerlaubten Medikamenten schützen, andererseits können unter Einhaltung dieser Regel nur absolut gesunde Tiere am Training oder an einem Wettkampf teilnehmen. Es wird also versucht, kranke Pferde auch im Training vor einer Überlastung zu schützen.

1.2 Satzung und Ordnungen des Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.

(HVT) mit Inkraftsetzung zum 01.02.2003

In den Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping sind in

§93 der Satzung entsprechende Bestimmungen zum „Doping“ aufgeführt:

„§93 Doping

1. Ein Pferd darf in seinen Geweben, seinen Köperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen in der Zeit zwischen dem Beginn der Rennveranstaltung und dem Ende des Rennens, an dem das Pferd teilgenommen hat oder für welches das Pferd als Starter angegeben worden ist, keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen aufweisen….“ (SATZUNG UND ORDNUNGEN DES HVT, 2003, S.45).

Unter Absatz 1 Ziffer 2 wird ergänzt:

„2. Unabhängig von dem generellen Verbot der Verabreichung von Substanzen oder Mitteln, die in Absatz 1 (Anführung der verbotenen Substanzen) genannt sind, dürfen Pferde innerhalb von 72 Stunden vor Beginn des Rennens keine Injektionen oder Infusionen erhalten“

(SATZUNG UND ORDNUNGEN DES HVT, 2003, S. 71).

Damit soll die Applikation von aufbauenden Präparaten (zum Beispiel auch Elektrolyt- Lösungen) unterbunden werden.

1.3 Deutsche Reiterliche Vereinigung e.V. (FN)

Entsprechend den anderen Sportverbänden wird in den Richtlinien der FN aus dem Jahr 2004 ein Verbot der Teilnahme am Wettkampf und eine Disqualifizierung nach Anwendung unerlaubter Maßnahmen definiert. Im Teil A §66 der Leistungsprüfungsordnung der FN sind allgemeine Teilnahmebeschränkungen für Pferde und Ponys zusammengetragen. Absatz 3 listet Zustände auf, die zur Nichtzulassung oder zur Disqualifizierung führen.

Ziffer 3.7 besagt hierzu:

„Pferde/Ponys, bei denen eine vorübergehende lokale Schmerzausschaltung oder Neurektomie vorgenommen wurde oder bei denen akute Veränderungen der Haut bestehen sowie Pferde/Ponys mit implantiertem Tracheotubus.“ (LPO 2004, Teil A, S. 58)

Unter Ziffer 3.8 steht:

„Pferde/Ponys, denen gemäß §920.2e eine Dopingsubstanz oder ein verbotenes Arzneimittel verabreicht oder an denen eine verbotene Methode angewendet oder zur Beeinflussung der Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft irgendein Eingriff oder eine Manipulation vorgenommen wurde….“ (LPO 2004, Teil A, S. 58)

Die Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Reiterlichen Vereinigung führt in §67a die „Liste der verbotenen Substanzen“ auf: Neben den als Dopingsubstanzen bezeichneten Stoffgruppen (beispielsweise Stimulantia, Sedativa und Narkotika, Anabolika, Diuretika sowie Peptidhormone und Analoga) werden auch sogenannte verbotene Arzneimittel (wie Nerven-, Herz-Kreislauf-, Atmungs-, Verdauungs- und Harnsystem beeinflussende Substanzen und weitere) aufgelistet. Für nachfolgend (Tabelle 1a und 1b) aufgeführte Wirkstoffe existieren zudem in §67a der LPO der Reiterlichen Vereinigung Grenzwerte:

Tab.1a: Grenzwerte für Dopingsubstanzen nach Vorgaben der Richtlinien der Reiterlichen Vereinigung e.V. (2004)

Dopingsubstanz Grenzwert

Testosteron

bei Wallachen: freies und gekoppeltes Testosteron in einer Konzentration von 0,02 µg/ml Urin

bei Stuten: freies und gekoppeltes Testosteron in einem Verhältnis zu Epitestosteron in einem Verhältnis von 1 Nandrolon frei und gekoppelt 5 -estrane-3 , 17 -diol bis 5(10)-

estrene-3 , 17 -diol im Urin in einem Verhältnis von 1 Theobromin in einer Konzentration ab 2,0 µg/ml Urin

Cortisol in einer Konzentration ab 1,0 µg/ml Urin

Tab. 1b: Grenzwerte für verbotene Substanzen nach Vorgaben der Richtlinien der Reiterlichen Vereinigung e.V. (2004)

Verbotene Substanz Grenzwert

Salizylsäure in einer Konzentration ab 750,0 µg/ml Urin oder 6,5 µg/ml Blutplasma

Arsen in einer Konzentration ab 0,3 µg/ml Urin

Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration ab 15,0 µg/ml Urin oder in einer Konzentration ab 1,0 µg/ml Blutplasma

Verfügbares O₂ in einer Konzentration ab 37 mmol/l Blutplasma

In §67a Absatz 3 wird auf Ausnahmen von den Verboten eingegangen. Ausgenommen werden Substanzen, die „der Vorbeuge und Pflege dienen und unterstützend bei der Gesunderhaltung des Pferdes/Ponys wirken….“ (LPO 2004, Teil A, S. 60), so zum Beispiel Impfstoffe, Arzneimittel zur Bekämpfung von Endoparasiten, Substanzen zur Unterstützung des Immunsystems sowie äußerlich anzuwendende Desinfektionsmittel und Insektenschutzmittel.

Im Rahmen ihrer Bestimmungen besteht die FN auf einem regelmäßig erneuerten Impfschutz gegen Influenza-Viren. Ohne Impfschutz darf ein Pferd nicht bei einem Turnier starten. Auch gibt die FN den verantwortlichen Tierärzten die Möglichkeit, bestimmte Medikamente zumindest im Rahmen einer nötigen Therapie einzusetzen. Damit besteht in der Beurteilung das Problem, wann eine therapeutisch erforderliche Medikation vor dem Rennen zu beenden ist, um dem behandelten Pferd eine Teilnahme an einem Wettkampf zu ermöglichen. Im Sinne des Tierschutzes ist es auch selbstverständlich, kranke Tiere an einem Wettkampf nicht teilnehmen zu lassen (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass alle Reitsportverbände eigene Listen führen, in denen unerlaubte oder verbotene Substanzgruppen aufgeführt sind. Diese werden als sogenannte „Dopinglisten“ geführt. Wegen der schon vorhandenen und stetig wachsenden Vielfalt der zur Verfügung stehenden Medikamente sind den Dopinglisten keine Warennamen

oder gar Wirkstoffe angegliedert. Stattdessen werden Wirkstoffgruppen mit Dopingrelevanz angegeben (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Im Vergleich zu anderen Pferdesportverbänden sieht der HVT keine Angaben zu etwaigen Grenzwerten von bestimmten Substanzen vor. Hier gilt, dass jeglicher Nachweis von unerlaubten Substanzen oder von deren Abbauprodukten ein positives Dopingergebnis darstellt (Dopingbestimmungen des HVT, 2003; UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Neben der Verabreichung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Leistung, dürfen auch Maßnahmen des sogenannten physikalischen Dopings nicht außer Acht gelassen werden. In den Pferdesportverbänden (DIR, FN, HVT) wird hauptsächlich die Anwendung von Stoffen verboten. Die FN und das DIR verbieten zusätzlich die Anwendung bestimmter Maßnahmen zur Beeinflussung der Leistung (LPO, 2004; RO, 2002; SCHOENE, 1996). Die FN beschränkt sich dabei auf das Verbot der Neurektomie und Implantierung von Tracheotuben.

Der Einsatz „technischer Mittel, die im Rennen mitgeführt oder angewendet werden“ ist laut Rennordnung (DIR, 2002, S. 131) verboten. Technische Mittel sind beispielsweise das Anbringen spitzer Gegenstände an Sattel, Peitsche oder Reitstiefel, das Zufügen elektrischer Reize und ähnliches. Nervenschnitte sind ebenfalls nicht erlaubt (RO des DIR, 2002, S. 131).

Die Pferdesportverbände haben demnach kein übergreifendes und generelles Verbot für physikalische Mittel erlassen. Andererseits befasst sich das Tierschutzrecht unter anderem mit diesem Tatbestand, so dass hierüber die Anwendung physikalischer und technischer Mittel verboten ist.

Aus dem oben Gesagten kristallisiert sich heraus, dass den Tierärzten, die sich um die Behandlung von in Wettkämpfen eingesetzten Pferden kümmern, ausreichende pharmakokinetische Daten der einzusetzenden Substanzen zur Verfügung stehen müssen. Sie sollten nach KLAUS und HAPKE (1994) damit die Möglichkeit bekommen, aus entsprechenden Daten entnehmen zu können, wann eine eingesetzte Substanz unter Einhaltung einer bestimmten Sicherheitsspanne keine Dopingrelevanz mehr aufweist.

2 Aspekte des Tierschutzes

Im Zusammenhang mit dem Doping-Verbot spielt der Tierschutz eine ganz entscheidende Rolle (UNGEMACH, 1985). Den zentralen Punkt stellt §3 des Tierschutzgesetzes in der Neufassung vom 1. Juni 2001 dar. Demnach ist es verboten „einem Tier außer in Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen es wegen seines Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist oder die offensichtlich seine Kräfte übersteigern“ (TIERSCHUTZGESETZ, 2001, §3, Absatz 1),…., und vor allem die Ausführungen des Absatzes 1b: Es ist verboten „an einem Tier im Training oder bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Maßnahmen, die mit erheblichen Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sind und die die Leistungsfähigkeit von Tieren beeinflussen können, sowie an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Dopingmittel anzuwenden“

(TIERSCHUTZGESETZ, 2001, §3). Zum Tatbestand des physikalischen Dopings ist Abschnitt 11 des §3 des Tierschutzgesetzes anzuführen. Dieser beinhaltet das Verbot, „ein Gerät anzuwenden, das durch elektrische Reize das artgerechte Verhalten eines Tieres beeinflusst und insbesondere die Bewegung erheblich einschränkt oder aber außergewöhnliche Bewegungen erzwingt, die dem Tier Schmerzen, Leiden oder Schäden zufügen können“ (TIERSCHUTZGESETZ, 2001).

In verschiedenen Fällen des Dopings kann nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) angenommen werden, dass eine Verschlimmerung des Krankheitsprozesses aus der Manipulation resultiert oder dem Pferd durch Überbelastung „länger anhaltende oder sich wiederholende erhebliche Schmerzen oder Leiden zugefügt“ werden (vergleiche §17 des Tierschutzgesetzes).

Neben der Gefahr durch eventuelle Dopingmaßnahmen für das einzelne Tier kann derjenige, der gedopte Pferde in Wettkämpfen einsetzt, auch andere Teilnehmer und deren Pferde in Gefahr bringen (UNGEMACH, 1985).

Anhand des oben Aufgeführten wird deutlich, dass keine einheitliche Definition des Begriffs

„Doping“ zur Verfügung steht (SCHOENE, 1996). Ein Versuch, den Begriff des Dopings etwas näher zu beschreiben, ist die Kombination der verschiedenen Ausführungen der Pferdesportverbände. Demnach beinhaltet der Begriff „Doping“, die Anwendung unerlaubter oder verbotener Substanzen im Training als auch zum Zeitpunkt von Wettkämpfen, den Versuch der Anwendung, das Mitwissen einer Anwendung sowie die Duldung einer Anwendung beim Pferd. Des Weiteren gilt jegliches Verwenden technischer Mittel zu jedem Zeitpunkt als Doping.

3 Formen des Dopings

Es werden zwei große Gruppen des Dopings unterschieden (KLAUS u. HAPKE, 1994;

SCHOENE, 1996):

1.) Positives Doping: In die Gruppe der positiv gedopten Pferde reihen sich das Doping auf Sieg, das Doping zur Wiederherstellung der artgemäßen Leistungsfähigkeit, das Doping mit körpereigenen Substanzen und das physikalische bzw. technische Doping ein.

2.) Negatives Doping: Hierzu gehört das Doping auf Niederlage.

Neben diesen beiden am häufigsten vorkommenden Dopingarten finden sich auch Fälle von unabsichtlichem Doping sowie die Anwendung von Maßnahmen, die zur Erschwerung des Dopingnachweises führen.

Das Doping auf Sieg gilt als klassische Form des Dopings (UNGEMACH u.

NÜRNBERGER, 1999). Unterscheiden lässt sich dabei eine akute Form, bei der leistungssteigernde Mittel kurz vor dem Wettkampf angewendet werden, von einer chronischen Form (UNGEMACH, 1985; SCHOENE, 1996). Bei letzterer werden Wochen oder Monate vor dem Rennen bereits entsprechende fördernde Mittel, wie beispielsweise Anabolika, eingesetzt. Die so „rechtzeitig“ vor dem Wettkampf eingesetzten dopingrelevanten

Substanzen oder deren Metaboliten können unter Umständen bei einer Analyse unentdeckt bleiben. Doch haben sie bezüglich ihrer nachhaltigen aufbauenden Wirkung noch einen Effekt auf das gedopte Tier.

Zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit werden den Pferden zum Beispiel schmerzausschaltende beziehungsweise analgetisch wirkende Medikamente verabreicht (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Dabei spielen vor allem bei den Hochleistungspferden vorhandene Lahmheiten eine entscheidende Rolle. Besonders häufig als Dopingmittel eingesetzte Medikamente sind in diesem Zusammenhang nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAIDs), Lokalanästhetika und auch Glukokortikoide (UNGEMACH, 1985;

SCHOENE, 1996).

Beim Doping mit körpereigenen Substanzen werden beispielsweise einige Tage vor dem Wettkampf bestimmte Mengen an Blut entnommen und kühl gelagert. Kurz vor dem Start wird das Blut den Pferden wieder zugeführt. Die sich dahinter verbergende Absicht besteht in der Verbesserung der Sauerstoffversorgung des Gewebes vor allem dabei der Muskulatur. Im Wettkampf auftretende Ermüdungserscheinungen sollen durch die zusätzliche Sauerstoffmenge verlangsamt werden (UNGEMACH, 1985; SCHOENE, 1996).

Bei der Absicht des Dopings zur Niederlage können zum Beispiel sedativ wirkende Stoffe zum Einsatz kommen, wie Neuroleptika, Sedativa und Hypnotika. Der entscheidende Effekt ist das Nachlassen des Fluchtreflexes und der Antriebsfreudigkeit. In Frage kommt die Anwendung dieser Mittel wahrscheinlich zur Manipulation und Ausschaltung eines starken Konkurrenten im Wettkampf oder bei Manipulationen von Pferdewetten.

Zum Doping ist zusätzlich die paradoxe Form auf Sieg zu zählen (UNGEMACH u.

NÜRNBERGER, 1999). Die Verabreichung von beispielsweise kleinen Dosen von Beruhigungsmitteln, die einen dämpfenden Einfluss auf das Zentralnervensystem ausüben, können sehr nervöse Pferde startfähig machen (UNGEMACH, 1985). Des Weiteren kann eine milde Sedation ein stark gegen die Hand des Reiters oder Fahrers gehendes und daher schwer zu regulierendes Pferd gefügiger machen und ein Teilnehmen am Wettkampf somit auch erst ermöglichen. Ebenso ist bei Rennpferden der Einsatz geringer Mengen von sedativ wirkenden

Arzneimitteln denkbar. Nervöse Trabrennpferde neigen während des Rennens zum Anspringen und sensible Galopper verursachen erhebliche Schwierigkeiten beispielsweise beim Verbringen in die Startboxen. Hierbei wäre der Einsatz von Sedativa möglich, die die Bewegungsmotorik gar nicht oder nur geringgradig beeinflussen (JAESCHKE, 1983).

Ein großes Problem bildet das unabsichtliche Doping. Nicht selten beruhen diese Dopingfälle auf der Unkenntnis über die Pharmakologie und im besonderen über die Pharmakokinetik des entsprechenden Stoffes (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Des Weiteren fehlt das Wissen über Veränderungen der pharmakokinetischen Eigenschaften insbesondere in Belastungssituationen (beispielsweise während eines Rennens) oder im Krankheitszustand. Zum Teil werden für die verwendeten Arzneimittel festgesetzte Wartezeiten als Richtwerte vorgeschlagen. Diese belegen allerdings nur den Zeitpunkt bis zur Rückstandsunbedenklichkeit und nicht den Zeitraum bis zur vollständigen Ausscheidung der Substanz und sind daher nicht als Richtlinie für eine Arzneimittelunbedenklichkeit zum Zeitpunkt des Rennens geeignet.

Als Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises werden die Diurese steigernde Mittel eingesetzt (SCHOENE, 1996). Man erhofft sich über eine Steigerung der Harnproduktion eine raschere Ausscheidung beziehungsweise eine Verdünnung des unerwünschten Stoffes im Urin (TOBIN u. WOOD, 1989). Der Verdünnungseffekt tritt jedoch nicht bei allen Substanzen ein; stattdessen kann es auch zu einer Aufkonzentrierung von Substanzen wie Fentanyl und Procain kommen (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Außerdem ermöglichen die heute angewendeten und sehr sensibel arbeitenden Analysemethoden eine Detektion auch schon bei geringsten Substanzkonzentrationen. Eine weitere in diesem Zusammenhang zu nennende Substanz ist das Probenecid (FORTH et al., 1996). Im Gegensatz zum Furosemid hemmt es bei einer Vielzahl von Medikamenten die tubuläre Sekretion und führt damit allerdings zu einer Erhöhung beziehungsweise einem verzögerten Abfall des Plasmaspiegels. Durch den Einsatz dieses Wirkstoffes soll das Zurückhalten eines unerwünschten Stoffes im Plasma ein negatives Analyseergebnis der Urinprobe bewirken.

Zu den in den Dopinglisten aufgeführten Stoffgruppen zählt ein großer Teil der in der Praxis zum therapeutischen Einsatz kommenden Wirkstoffe. Für den die in Wettkämpfen eingesetzten Pferde behandelnden Tierarzt resultiert hieraus die Problematik der rechtzeitig abzusetzenden therapeutische Medikation, so dass am Wettkampftag bei einer Dopingkontrolle entweder die Grenzwerte nicht überschritten werden oder aber keinerlei Spuren einer unerlaubten Substanz zu finden sind.

Die Dauer der Anwesenheit von Arzneimitteln in Körperflüssigkeiten und Geweben ist von mehreren Faktoren abhängig. Es spielen dabei die verabreichte Dosis, die Pharmakologie des Stoffes inklusive einer individuellen Ausscheidungsgeschwindigkeit sowie die Sensitivität des verwendeten Nachweistests eine große Rolle (MOSS u. CLARKE, 1977; TOBIN u. WOOD, 1989).

Im Handbuch zur Medikation (FN, 2002) sind Karenzzeiten zu einigen Wirkstoffen aufgeführt. Diese Karenzzeiten geben den Zeitraum vor, in dem das Pferd nach der einmaligen Gabe einer Substanz nicht an den Start gehen darf (DÜE, 1998). Die Angaben sind jedoch nicht verbindlich und geben nur näherungsweise Auskunft bezüglich der Beendigung einer Wirkstoffgabe vor einem Wettkampf. Die dort aufgeführten Zeiten stammen aus Untersuchungen der FN und aus Auswertungen internationaler Literatur (DÜE, 1998). Die im Handbuch der Medikation aufgeführten Wirkstoffe beinhalten unter anderem Glukokortikoide, NSAIDs und Antiepileptika.

Dem Handbuch der Medikation ist außerdem zu entnehmen, dass für alle nicht in der Liste aufgeführten Arzneistoffe eine Karenzzeit von 14 Tagen empfohlen wird. Auch für diese Aussage gilt keine Verbindlichkeit.

Zur Sicherung der notwendigen medikamentösen Behandlung von Sportpferden schlagen KLAUS und HAPKE (1994) vor, eine begrenzte Anzahl von Arzneimitteln zum Wettkampfzeitpunkt zuzulassen beziehungsweise eine „geteilte Dopingliste“ aufzustellen.

Eine solche Liste könnte neben Wirkstoffen ohne therapeutische Wirkung im eigentlichen Sinne, Arzneimittel mit festzulegenden Karenzzeiten und bestimmte erlaubte Stoffe, die keinen Einfluss auf die Leistung eines Pferdes haben, umfassen. Als Karenzzeit wäre der Zeitraum zwischen dem Tag der letzten Arzneimittelgabe und dem Tag des Wettbewerbs zu

definieren (KLAUS u. HAPKE, 1994). Für die Festlegung von Karenzzeiten im Pferdesport bestehen keine Rechtsvorschriften (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Zur Zeit gilt durch die Richtlinien der Pferdesportverbände, dass praktisch jede, auch eine medizinisch gerechtfertigte, Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit der Teilnahme an einem Wettkampf untersagt ist (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Der Nachweis einer Substanz unabhängig von der gemessenen Konzentration wird als Versuch einer Leistungsbeeinflussung und damit als Doping gewertet, was auch als sogenannte „Null- Lösung“ bezeichnet wird (UNGEMACH, 1988; DÜE, 1998). Dabei ist es ohne Bedeutung, ob eine Leistungsbeeinflussung erfolgt oder nicht (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Neben der oben aufgeführten Problematik, dass verlässliche Karenzzeiten für viele Wirkstoffe fehlen, führen die heute zur Verfügung stehenden, hochsensiblen Analysemethoden dazu, dass immer geringere Konzentrationen bzw. Spuren von Wirkstoffen noch detektiert werden können (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Somit scheint die „Null-Lösung“ keine geeignete Alternative mehr zu sein. Vor allem kann ein großes Problem bei der Analyse von Urin entstehen, da selbst Spuren von Wirkstoffen häufig noch Tage nach einer legitimen therapeutischen Behandlung und lange nach dem Abklingen der pharmakologischen Effekte noch gefunden werden können (TOBIN, 1983). In diesen Situationen bleibt es den Sportverbänden überlassen, dieses zu ahnden.

Diese Tatsachen führten in den Sportverbänden zu Überlegungen, ob kleinste Konzentrationen oder lediglich Spuren von medizinisch eingesetzten Wirkstoffen bei einer Dopingkontrolle als positives Ergebnis gewertet werden sollten oder nicht (TOUTAIN u.

LASSOURD, 2002). Eine Entscheidung kann nur dahin gehend erfolgen, dass entweder jegliches Vorkommen eines Wirkstoffes geahndet wird, oder dass nur Konzentrationen oberhalb eines festgelegten Grenzwertes zur Meldung gelangen. Bei einer Meldung jeglichen Vorkommens wird die Nachweisgrenze für eine bestimmte Substanz der eingesetzten Analysenmethode eine Limitierung setzen. Sollen stattdessen bestimmte Grenzwerte ermittelt werden, um beispielsweise eine ausreichende tierärztliche Versorgung der an Wettkämpfen teilnehmenden Pferde zu gewährleisten, sind ausführliche pharmakokinetische und pharmakodynamische Daten Voraussetzung.

Einen Vorschlag zur Lösung beschrieben TOUTAIN und LASSOURD (2002). Mit ihrem PK/PD-Modell soll gerade in den Bereichen kleinster Wirkstoffkonzentrationen das Treffen von Entscheidungen ermöglicht beziehungsweise vereinfacht werden. TOUTAIN und LASSOURD schlagen eine mathematische Ermittlung sogenannter irrelevanter Plasma (IPC)- und Urinkonzentrationen (IUC) vor. Diese sind definiert als Plasma- oder Urinkonzentrationen, die die Abwesenheit jeglicher Auswirkungen des jeweiligen Wirkstoffes garantieren und für die es keine Maßnahmen von Seiten der Sportverbände geben müsste.

Unter Verwendung dieses PK/PD-Modells, sowie klinischen und pharmakokinetischen Daten zu den in Frage kommenden Wirkstoffen, soll eine Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentration möglich sein. In diese Berechnungen können allerdings nur systemisch wirkende Substanzen einbezogen werden. Um diese Berechnungen durchführen zu können, müssen ausreichende pharmakologische Daten zu den einzelnen Substanzen vorhanden sein (TOUTAIN u. LASSOURD, 2002).

4 Allgemeine pharmakokinetische Grundprinzipien

Die Pharmakokinetik ist neben der Pharmakodynamik ein Teilgebiet der Pharmakologie und befasst sich mit den Einflüssen des Organismus auf das Pharmakon (FICHTL et al., 1996).

Als Begriffe im Zusammenhang mit der Pharmakokinetik sind die Liberation, Absorption (Resorption), Distribution (Verteilung), Metabolisierung (Biotransformation) sowie Elimination (Ausscheidung) zu nennen (KAMERLING et al., 1994). Dabei umfasst die Invasion eines Wirkstoffes die Liberation, Absorption und Distribution, während Metabolisierung und Elimination Bestandteile der Evasion sind. Die einzelnen Vorgänge können anhand des Zeitverlaufes der Konzentration eines Wirkstoffes besonders in Blut oder Urin untersucht werden, da diese Flüssigkeitsräume einfach zugänglich sind (GLADTKE u.

VON HATTINGBERG, 1977; DERENDORF et al., 2002).

Der zeitliche Verlauf der Konzentration eines Wirkstoffes in Blut, Plasma oder Exkreten lässt sich unter vereinfachender Annahme mit Hilfe sogenannter Kompartimentmodelle analysieren (FICHTL et al., 1996). Als Kompartimente bezeichnet man Räume, die kinetisch als

einheitlich aufgefasst werden können wie beispielsweise den Gastrointestinaltrakt, das Blut oder Plasma oder bestimmte Gewebe (DOST, 1968). In diesen Räumen kann mit einer gleichmäßigen Verteilung der Substanz gerechnet werden.

Der Stofftransport zwischen den Kompartimenten kann unterschiedlich verlaufen. Erfolgt der Transport von einem Kompartiment in ein anderes konzentrationsabhängig, wird pro Zeit ein konstanter prozentualer Anteil der Stoffmenge transportiert (KIETZMANN, 1983). Ein solcher Verlauf der Konzentrationskurve entspricht einer Kinetik 1.Ordnung (GLADTKE u.

VON HATTINGBERG, 1977). Dabei bleibt die Zeit, in der die Konzentration um die Hälfte abnimmt gleich und wird als Halbwertszeit (HWZ) bezeichnet. In halblogarithmischer Darstellung zeigt sich die exponentielle Abnahme der Wirkstoffkonzentration (d_c) zu einem bestimmten Zeitpunkt (dt) linear und ist mit Hilfe des Quotienten dc/dt zu beschreiben. Die Steigung der Geraden entspricht der Geschwindigkeitskonstante der Elimination, über die die Plasmahalbwertszeit berechnet werden kann. Abbildung 1 zeigt die eben beschriebenen Verhältnisse im Diagramm in linearer und halblogarithmischer Darstellung:

Abb. 1: Schematische Darstellung des Konzentrationsverlaufs einer Kinetik 1. Ordnung folgend in linearer (linker Graph) sowie halblogarithmischer Darstellung (rechter Graph)

0,1 1 10 100 1000

0 2 4 6 8 10

Zeit (t)

Konzentration

0 20 40 60 80 100

0 2 4 6 8

Zeit (t)

Konzentration

Demgegenüber steht die Kinetik 0. Ordnung, nach der pro Zeiteinheit ein konstanter Teil der Stoffmenge vom einen zum anderen Kompartiment transportiert wird (FORTH et al., 1996).

Die Änderung der Konzentration stellt sich dabei bereits in linearer Darstellung als Gerade dar.

Ein einfaches pharmakokinetisches Modell beschreibt das Einkompartimentmodell (DERENDORF et al., 2002). In diesem Modell erfolgt die Verteilung des Wirkstoffes in einer vernachlässigbaren Zeit und die Ausscheidung folgt einer Kinetik 1. Ordnung.

Der Zeitverlauf der Konzentration eines Wirkstoffes C zu einer bestimmten Zeit t (Ct) kann dann durch folgende Gleichung beschrieben werden:

t kel

e t C

C = ₀ • ^{− •} [mg/ml] wobei

1 2

2 1

t t

C ln C k ln

el −

= − [h^-1]

Ct, C0 = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt t beziehungsweise Ausgangskonzentration k_el = Geschwindigkeitskonstante der Elimination

C₁,C₂ = zwei Messwerte der Plasmakonzentration

Bei Reaktionen erster Ordnung lässt sich die Eliminationsgeschwindigkeitskonstante kel auch über die Halbwertszeit (t1/2) ausdrücken:

/ kel

t ln2

2

1 =

Die Halbwertszeit ist für jeden Wirkstoff charakteristisch und wie die Formel zeigt unabhängig von der Ausgangskonzentration, das heißt der Dosis.

Zur Darstellung der Vorgänge im Körper ist für viele Wirkstoffe die Annahme von mindestens 2 Verteilungsräumen unterschiedlicher Größe und Zugänglichkeit erforderlich.

Dazu können die Mehrkompartimentmodelle verwendet werden. Trotzdem stellen diese Modelle noch immer eine erhebliche Vereinfachung der tatsächlich ablaufenden Verteilungs-

und Ausscheidungsvorgänge dar und haben keine direkte physiologische Entsprechung (FICHTL et al., 1996). Sie ermöglichen allerdings, den zeitlichen Verlauf der Konzentration eines Wirkstoffes in Plasma, Blut oder Exkreten mathematisch zu beschreiben.

Den einfachsten Fall eines Mehrkompartimentmodells beschreibt das Zweikompartimentmodell (DERENDORF et al., 2002). Wird ein Wirkstoff mittels intravenöser Injektion direkt in das zentrale Kompartiment verbracht, kann er von hier aus in ein peripheres Kompartiment diffundieren und sich dort verteilen. Als periphere Räume gelten Organe wie zum Beispiel Muskulatur, Magen-Darm-Trakt und Fettgewebe, aus dem der Wirkstoff langsam wieder in das zentrale Kompartiment zur Elimination gelangt (SEINSCH, 1998). Neben der Diffusion in einen peripheren Raum, beginnt die Elimination aus dem zentralen Kompartiment über Urin, Faezes und andere Exkrete. Verfolgt man diese Vorgänge in der Konzentrationskurve, fällt in der Phase der Invasion die Konzentration schnell ab und geht nach Erreichen eines Gleichgewichtes in eine lineare Eliminationsphase über (DERENDORF et al., 2002). Dies zeigt sich bei halblogarithmischer Darstellung meist als

‚Knick’ im Anfangsteil des abfallenden Kurvenverlaufs (KIETZMANN, 1983). In die mathematische Beschreibung gehen zwei Eliminationskonstanten b₁ und b₂ ein, die auch als Hybridkonstanten und bezeichnet werden:

) e B e

( t C

C = ₀ A• −^b1•^t + • ^b2•^t [mg/ml]

Mit Hilfe der Eliminationskonstanten b2 kann die Halbwertszeit des langsamsten Prozesses, die sogenannte terminale Halbwertszeit, berechnet werden (FICHTL et al., 1996). Diese hat eine große Bedeutung für die Bestimmung des Dosierungsintervalls eines Wirkstoffes (SEINSCH, 1998). Durch Verlängerung von b2 bis zur y-Achse erhält man die fiktive Konzentration B beim Erreichen eines Verteilungsgleichgewichtes. Eine lineare Beschreibung der Verteilungsphase erhält man durch Differenzbildung zwischen denjenigen Messwerten der schnellen Eliminationsphase (b1-Phase) und den Werten der extrapolierten b2-Geraden. Die resultierende Gerade verläuft steiler als der schnell abfallende Anfangsteil der Eliminationskurve. Ihr Schnittpunkt mit der y-Achse ist A und ihre Steigung wird mit Hilfe der Hybridkonstanten b₁ beschrieben. Die initiale oder auch fiktive Anfangskonzentration (C₀)

unmittelbar nach Ende der Injektion entspricht der Summe von A + B (DERENDORF et al., 2002). Abbildung 2 soll die eben beschriebenen Verhältnisse verdeutlichen:

Abb. 2: schematische Darstellung der Bestimmung der pharmakokinetischen Parameter A, B, und

Ein Parameter zur Beschreibung der Vorgänge im Organismus ist die Bioverfügbarkeit. Unter ihr versteht man den Anteil des Arzneimittels, der unverändert ins Blut, das heißt in den großen Kreislauf gelangt. Somit versteht man unter der Bioverfügbarkeit den Prozentsatz eines Wirkstoffes, der aus seiner Zubereitung in das Blut gelangt. Danach ist ein Wirkstoff nach intravenöser Applikation zu 100 % bioverfügbar. Demgegenüber beträgt die Bioverfügbarkeit nach extravasaler Applikation, wie beispielsweise nach oraler Aufnahme, weniger als 100% (FICHTL et al., 1996), da nach Passage von Darm und Leber dem Blut nur noch ein Teil der verabreichten Dosis zur Verfügung stehen. Zur Berechnung der Bioverfügbarkeit bedient man sich der Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve (Area Under the Curve, AUC), deren Fläche proportional zur Menge des Arzneistoffes (M) ist, die ins Blut gelangt:

CL

AUC= M [ng/ml*h]

CL = totale Clearance

1 10 100 1000

0 50 100 150

Zeit (t)

Konzentration

B

A ß

Der Quotient beschreibt schließlich in Verbindung mit der maximal erreichbaren Konzentration und Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentration die Bioverfügbarkeit.

Eine weitere in diesem Zusammenhang zu nennende Kenngröße ist das Verteilungsvolumen V, welches die Konzentration im Plasma mit der Arzneistoffmenge im Körper verbindet (DERENDORF et al., 2002). Das Verteilungsvolumen (V) ist eine fiktive Größe (GLADTKE u. VON HATTINGBERG, 1977). Für eine intravenöse Applikation des Wirkstoffes mit einer Kinetik 1.Ordnung gilt:

C0

D

Vc = [l/kg]

D = Dosis beziehungsweise Gesamtmenge; C0 = Anfangskonzentration

Wird eine bestimmte Dosis eines Wirkstoffes intravenös appliziert, befindet sich die gesamte Menge des Stoffes zunächst im Blut beziehungsweise Plasma, das heißt der Quotient aus Gesamtmenge (D) und der zunächst hohen Plasmakonzentration (C₀) ist niedrig. Dies lässt sich auch als ein geringes initiales Verteilungsvolumen des zentralen Kompartiments (V_c) beschreiben. Im weiteren Verlauf verteilt sich der Wirkstoff vom Blut oder Plasma in die Gewebe und erst nach Abschluss der Verteilungsphase wird ein konstantes Verhältnis zwischen Gesamtmenge und Plasmakonzentration erreicht. Das erreichte Gleichgewicht bezeichnet man als Verteilungsvolumen im Steady State (Vss). Da sich nur noch ein Teil der Gesamtmenge des Wirkstoffes im Plasma befindet, ist das Verteilungsvolumen der Verteilungsphase höher als in der Initialphase (FICHTL et al., 1996).

Zur Berechnung des Verteilungsvolumens im Steady State (V_ss) bedient man sich nachfolgender Formel:

c pc cp

ss ) V

k ( k

V = 1+ •

kcp, kpc = Transferkonstanten zwischen zentralem und peripheren Kompartiment

Durch die Elimination des Wirkstoffes aus dem zentralen Kompartiment, kommt es hier zu einer Abnahme der Konzentration (DERENDORF et al., 2002). Der entstandene Konzentrationsgradient zwischen dem peripheren und zentralen Kompartiment führt dazu, dass der Wirkstoff aus dem peripheren in den zentralen Raum diffundiert. Dieser Zustand wird auch als Pseudo-Steady-State bezeichnet und die Konzentration fällt linear ab. Dieser Abfall kann über die Hybridkonstante beschrieben werden. Das entsprechende Verteilungsvolumen in der Eliminationsphase (Vd ) kann nach DERENDORF et al. (2002) als Quotient aus der Clearance (CL, siehe weiter unten im Text) und berechnet werden:

β β V CL

d = [l/kg]

Ein weiterer wichtiger pharmakokinetischer Begriff ist die Clearance. Sie ist ein Maß für die Fähigkeit eines Organismus, einen Wirkstoff zu eliminieren (FICHTL et al., 1996). Die Clearance entspricht dem Volumen der untersuchten Körperflüssigkeit, die pro Zeiteinheit von dem Wirkstoff befreit wird (DERENDORF et al., 2002). Für die Exkretionsleistung sind die Nieren (renale Clearance) sowie die Leber verantwortlich. Letztere dient beispielsweise der Metabolisierung der Wirkstoffe und der Ausscheidung über die Galle und wird als extrarenale oder auch als hepatische Clearance bezeichnet (FICHTL et al., 1996). Die totale Clearance (CL) ergibt sich aus der Summe der renalen (CLR) und extrarenalen Clearance (CLNR).

el

/ ) V k

t / V ( ln

CL= 2• _{1 2} = • [ml/min]

kel = Geschwindigkeitskonstante der Elimination

Mit Hilfe der renalen Clearance lässt sich ein Zusammenhang zwischen der Konzentration des Wirkstoffes in Plasma und Urin herstellen:

) V / CL ( C

C _{Plasma R f}

Urin = • [mg/ml]

Vf = Volumenfluss des Urins

Nach dieser Gleichung sind die Konzentrationen in Plasma und Urin zueinander proportional, solange die renale Clearance und der Volumenfluss des Urins konstant sind. Die aktuelle Urinkonzentration kann sich von der erwarteten Konzentration unterscheiden, da die Blase den Urin mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen speichert und erst bei einer bestimmten Volumenmenge die Blase entleert wird (SAMS, 1996; TOBIN et al., 1999).

Demnach ist es nicht immer möglich, von der Urinkonzentration auf die vorliegende Plasmakonzentration zurück zu schließen. Zudem unterliegt die Urinproduktion starken Beeinflussungen durch beispielsweise Wasseraufnahme sowie Training oder Anstrengung (WOOD et al., 1990). Auch die renale Clearance ist Veränderungen unterworfen. Ein Absinken des pH-Wertes im Harn, wie es oft nach einem Rennen beobachtet wird, führt zu einer stärkeren Ionisation schwacher Basen im Urin, die dadurch weniger stark rückresorbiert und damit schneller ausgeschieden werden (SAMS, 1996; SCHOENE, 1996). Somit sollten basische Substanzen nach einem Rennen beziehungsweise einer körperlichen Anstrengung leichter nachzuweisen sein. Die umgekehrten Verhältnisse sind für schwache Säuren zu erwarten. Im basischen Urin liegen schwache Säuren mit einem pKa-Wert im niedrigeren pH- Bereich vorwiegend in ionisierter Form vor und können daher nicht rückresorbiert werden.

Ändert sich der pH-Wert in Richtung des pKa der jeweiligen Säure, kommt es immer mehr zum Ausgleich der Ionenladungen, so dass die entsprechende Substanz zunehmend in neutraler Form im Urin zu finden ist und somit rückresorbiert werden kann (SCHOENE, 1996).

Die hepatische Clearance umfasst den Metabolismus von Wirkstoffen in der Leber. Dieser Metabolismus ist vielfach erforderlich, um die Arzneimittel in eine ausscheidungsfähige Form zu bringen. Im Vordergrund steht die Bildung starker polarer Verbindungen mit Hilfe sogenannter Phase-I-Reaktionen und Phase-II-Reaktionen, die eine hohe Wasserlöslichkeit besitzen und rasch ausgeschieden werden können (SCHOENE, 1996; FREY, 2002). Die Phase-I-Reaktion umfasst dabei oxidative und reduktive Stoffwechselvorgänge sowie eine Hydrolyse mit dem Ziel einer Entgiftung des Wirkstoffes. Eine weitere Entgiftung durch Kopplungsreaktionen erfolgt in der sich anschließenden Phase-II-Reaktion. In dieser Phase werden auf die Moleküle Glucuronyl-, Acetyl- oder Sulfatgruppen übertragen. Diese Kopplungsprodukte sind pharmakologisch unwirksam und polar, so dass sie gut

ausgeschieden werden (FREY, 2002). Die Glucuronidierung stellt quantitativ den bedeutendsten Prozess bei der Phase-II-Reaktion dar. Solche konjugiert ausgeschiedenen Pharmaka müssen bei der Probenvorbereitung hydrolysiert werden, um aus der wässrigen Phase des Urins in das unpolare Lösungsmittel zur Analyse überzugehen. Die analysierte Urinkonzentration erhöht sich nach SEINSCH (1998) um einen Betrag, der theoretisch der hepatischen Clearance zuzurechnen ist.

Als weitere Ausscheidungswege sind der Vollständigkeit halber die biliäre Ausscheidung sowie die Abatmung bestimmter Stoffe wie beispielsweise Inhalationsnarkotika zu nennen (FREY, 2002). Aus der Leber werden lipophile Substanzen über die Galle in den Dünndarm sezerniert, wo beispielsweise auch erst viele glucuronidierte Substanzen von dem entsprechenden Enzym gespalten werden. Bleiben unkonjugierte Substanzen zurück, können sie über einen enterohepatischen Kreislauf zurück in die Leber zur Metabolisierung gelangen (BOCK, 1990).

5

-Adrenozeptor-Agonisten

Die im zentralen und peripheren Nervensystem vorkommenden -Adrenorezeptoren vermitteln die physiologischen Wirkungen der körpereigenen Transmitter Noradrenalin und Adrenalin. Als direkt wirkende Sympathomimetika ahmen die ₂-Adrenozeptor-Agonisten die Wirkungen der Transmitter auf den Organismus nach (STARKE, 1981). In der Gruppe der - Rezeptoren unterscheidet man zwischen 1- und 2- Rezeptoren. Diese Einteilung beruht auf der relativen Affinität der Agonisten für diesen Rezeptor (STARKE, 1981).

Im Gegensatz zu einigen anderen Sympathomimetika besitzen die im Folgenden aufgeführten Substanzen die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren (LÖSCHER, 2002). Damit ist ihnen sowohl eine Wirkung auf periphere als auch auf zentrale -Rezeptoren sicher und sie wirken hier sowohl prä- als auch postsynaptisch (SCHEININ u. MACDONALD, 1989) an sympathisch innervierten Nervenzellen. Allerdings besitzen auch nicht sympathisch innervierte Nervenzellen 2-Rezeptoren. So sind dopaminerge, cholinerge und serotonerge Neuronen präsynaptisch mit diesen Rezeptoren bestückt und reagieren mit einer verminderten

Freisetzung des jeweiligen Transmitters, Dopamin, Acetylcholin bzw. Serotonin (ESTLER, 1996).

Durch eine Veränderung der chemischen Struktur bekamen die ₂-Adrenozeptor-Agonisten den Charakter von Imidazolinen, die im Organismus über Imidazolinrezeptoren ihre Wirkung entfalten (MOLDERINGS, 1996; MICHEL u. ERDBRÜGGER, 1996).

Die als erste in dieser Stoffgruppe hergestellte und in der Humanmedizin eingesetzte Substanz ist Clonidin. Etwa zeitgleich wurde das für die Veterinärmedizin hergestellte Xylazin entwickelt. In den letzten Jahren wurden verschiedene neue, ebenfalls zentral wirkende 2- Rezeptor-Agonisten synthetisiert. Zu ihnen zählen die für die Tiermedizin zugelassenen Substanzen Detomidin, Medetomidin und Romifidin. Sie zeigen dem Clonidin und Xylazin ähnliche Wirkungen, doch unterscheiden sie sich von ihnen durch eine höhere Selektivität gegenüber den 2-Rezeptoren sowie durch eine höhere Wirkungspotenz. Aber auch untereinander differiert die Selektivität und Potenz für die Rezeptoren (LOUIS et al., 1988).

Letzteres führt vor allem dazu, dass geringere Mengen der jeweiligen Substanz zum Einsatz kommen und der gewünschte Effekt ebenso gut oder sogar besser erzielt wird als mit den zuerst entwickelten Substanzen.

5.1 Pharmakodynamische Daten von Romifidin und anderen

-Agonisten

Romifidin ist dem Imidazolinderivat Clonidin strukturell sehr ähnlich (INTERNE FIRMENUNTERLAGEN BOEHRINGER INGELHEIM, 1991; MOENS et al., 2003) und besitzt analoge Eigenschaften. Die Veränderung der chemischen Struktur der körpereigenen Katecholamine (Noradrenalin und Adrenalin) mit Anfügung eines Brom- und eines Fluoratoms führte zur Entwicklung von Romifidin (MERCK INDEX, 1989). Es handelt sich daher chemisch um 2-(2-Brom-6-fluorphenyl)imino-imidazolin (siehe Abbildung 3). Eine weitere Bezeichnung der Substanz lautet STH 2130 (INTERNE FIRMENUNTERLAGEN BOEHRINGER INGELHEIM, 1989; POULSEN NAUTRUP, 1988). In der Veterinärmedizin wird es intravenös zur Sedation und Prämedikation bei Pferden eingesetzt (POULSEN NAUTRUP u. KELLER, 1989). Obwohl es Untersuchungen zu alternativen

Applikationsmethoden gibt, haben sich der intramuskuläre oder sublinguale Einsatz trotz guter Gewebsverträglichkeit nicht durchsetzen können (FREEMAN u. ENGLAND, 1999).

Abb. 3: Struktur- und Summenformel von Romifidin mit Molmasse (MM)

C9H9BrFN3, MM: 258

Romifidin ist in den sedativen und analgetischen Wirkungen potenter und selektiver für ₂- Adrenozeptoren als Xylazin, so dass der Wirkungseintritt nach der Applikation rascher erreicht ist. Beim Romifidin erfolgt der Eintritt der sedierenden Wirkung etwa 1 bis 4 Minuten nach intravenöser Gabe von 0,04 mg/kg KGW und etwa 1 bis 2 Minuten nach Applikation von 0,08 mg/ml KGW intravenös (POULSEN NAUTRUP, 1988).

Demgegenüber berichtet VOEGTLI (1988) unter Verwendung einer Dosis von 0,03 mg/kg KGW bereits von einer sichtbaren Wirkung des Medikaments 30 bis 60 Sekunden nach der Verabreichung sowie nach einer Dosis von 0,06 mg/kg KGW von einem Wirkungseintritt 30 Sekunden und dem Erreichen einer tiefen Sedation 60 Sekunden nach intravenöser Gabe von Romifidin.

Im Vergleich zu Detomidin (siehe unten im Text) bewirkt es eine ähnlich lang andauernde Sedation, wobei die Senkung des Kopfes und die Ataxie dabei etwas geringer ausfallen (ENGLAND u. CLARKE, 1996). Je nach angewandter Dosis beträgt die Wirkungsdauer zwischen 50 und 120 Minuten post applikationem (VOEGTLI, 1988). Allerdings kann nach KANNEGIETER (1993) die Sedation bis zu vier Stunden nach der Applikation bestehen bleiben, sofern die Pferde nur wenigen äußeren Reizen ausgesetzt sind.

Als Zeichen der Sedation werden vor allem das Senken des Kopfes, das Hängen lassen der Unterlippe, das Herabhängen der oberen Augenlieder, die zum Teil sehr stark reduzierte Reaktion auf akustische und visuelle Stimuli sowie Körperschwanken angesehen (VIRTANEN, 1986). Letzteres begründet POULSEN NAUTRUP (1988) mit einer generalisierten Muskelrelaxation. Diese kann im Einzelfall ein Zusammensinken eines

Br

F N N H N H

Pferdes bewirken (VOEGTLI, 1988). Über ein Niederstürzen der in verschiedenen Studien eingesetzten Pferde nach der Gabe von Romifidin wird nicht berichtet. Des Weiteren kann es zu unterschiedlich starkem Schwitzen sowie bei männlichen Tieren zum Prolaps des Penis kommen (DYKE, 1993; ENGLAND et al., 1996). POULSEN NAUTRUP (1988) vermutet als Ursache für das Schwitzen einen -mimetischen Effekt.

Über seine analgetischen Eigenschaften wird in der Literatur noch kontrovers diskutiert.

Einerseits soll Romifidin keinerlei analgetische Wirksamkeit besitzen (HAMM et al., 1995), andererseits werden ihm analgetische Eigenschaften durch zeitweiligen Anstieg der nozizeptiven Schwellenwerte bescheinigt (MOENS et al., 2003). Nach DYKE (1993) besitzen alle ₂-Agonisten eine analgetische Komponente, doch ist ihre Wirkungsdauer in Vergleich zur Sedation teilweise bedeutend kürzer.

Wie auch für andere 2-Rezeptor-Agonisten beschrieben, können Pferde nach Gabe von Romifidin mit Vorhandensein eines oder mehrerer der oben erwähnten Anzeichen der Sedation auf Schmerz auslösende Provokationen mit einer plötzlichen und teilweise starken Abwehr reagieren (POULSEN NAUTRUP, 1988). In dem Moment der Abwehr erscheint das Pferd völlig unsediert und kann durch Aufbäumen oder gezieltes Ausschlagen der Registrierung des Schmerzes Ausdruck verleihen (DYKE, 1993; KELLER et al., 1994). Nach Abklingen des Reizes übernehmen die Zeichen der Sedation wieder das vorherrschende Bild.

Dieser Durchbruch der Sedation zeigt sich vor allem bei schmerzhaften Eingriffen bzw.

Manipulationen an der Hinterhand der Pferde (POULSEN NAUTRUP, 1988; KELLER u.

GENZOW, 1994).

Zu den Wirkungen auf das kardiovaskuläre System zählt der Abfall der Herzfrequenz innerhalb kürzester Zeit nach Applikation (FREEMAN u. ENGLAND, 2000). Zusätzlich zur ausgeprägten Bradykardie bewirkt Romifidin einen Blutdruckabfall nach initialer Hypertonie sowie das Auftreten von Herzarrhythmien (ENGLAND u. CLARKE, 1996) in Form von aterioventrikularen Überleitungsstörungen 1. und 2. Grades (AV-Blöcke) sowie von sinuatrialen Leitungsstörungen (SA-Block). Durch die Gabe einer bestimmten Dosis Atropin vor dem Einsatz des Sedativums konnten GASTHUYS et al. (1990) zeigen, dass die Ausprägung sowohl der Bradykardie als auch der SA- und AV-Blöcke verhindert werden konnte.

Innerhalb kürzester Zeit nach der Gabe von Romifidin kommt es, wie bei anderen zentral wirkenden ₂-Agonisten auch zu beobachten ist, zu einem initialen Anstieg des Blutdruckes (POULSEN NAUTRUP, 1988; ENGLAND u. CLARKE, 1996). Es wird davon ausgegangen, dass der initiale Blutdruckanstieg aller Wahrscheinlichkeit nach auf eine Erregung peripherer postsynaptischer 1-Rezeptoren zurückzuführen ist (DYKE, 1993; ESTLER, 1996). Die 1- Wirkung wird bei besonders hohen Konzentrationen erreicht. Nach intravenöser Gabe der 2- Agonisten ist kurzzeitig eine hohe Konzentration der jeweiligen Substanz im Blut anzufinden und erregt die 1-Rezeptoren, die mit einer Kontraktion der glatten Muskelzellen der Arteriolen antworten (ENGLAND et al., 1992; ESTLER, 1996).

Demgegenüber beruht der sich anschließende blutdrucksenkende Effekt der ₂-Agonisten wahrscheinlich auf zwei unterschiedlichen, sich jedoch ergänzenden Effekten. Einen kleinen Anteil an dieser Wirkung vermögen die peripheren präsynaptischen Rezeptoren zu vermitteln.

Werden die präsynaptischen 2-Rezeptoren stimuliert, kommt es zu einer Hemmung der Noradrenalinfreisetzung aus den sympathischen Varikositäten (VIRTANEN, 1986). Auf der postsynaptischen Seite sinken der Sympathikotonus und damit die Stärke der Vasokonstriktion. Eine Folge ist die Zunahme der Vasodilatation durch Überwiegen des Vagustonus. Den wesentlich größten Teil der hypotensiven Wirkung macht offenbar die zentrale Regulation aus (ENGLAND u. CLARKE, 1996). Steigt im Körper der Blutdruck an, wird dieses von Barorezeptoren im Aortenbogen und Carotissinus registriert. Zum zentralen Nervensystem aufsteigende Bahnen führen die Erregung zu bestimmten Neuronenzentren im Hirnstamm, dem Nucleus tractus solitarii, weiter. Ein exzitatorisches Neuron leitet die Erregung weiter zur ventralen Medulla oblongata, wo eine Umschaltung auf inhibitorische 2- Adrenozeptoren erfolgt. Diese drosseln über die vermehrte Freisetzung eines inhibitorischen Transmitters den Sympathikotonus und in der Peripherie kommt es zu einer Erweiterung der Gefäße und zur Blutdruckabnahme. MOLDERINGS (1996) beschreibt weiter, dass zusätzlich über eine Wirkung auf zentrale Neuronenzentren, wie den Nucleus tractus solitarii sowie Nervenzellen in Locus coeruleus (POULSEN NAUTRUP, 1988), die Herzfrequenz, die Sedation, die Hormonfreisetzung und die Schmerzwahrnehmung beeinflusst werden können.

In diesen Fällen erfolgt nach MOLDERINGS (1996) die Regulierung vorwiegend über auf der postsynaptischen Neuronenseite lokalisierte Rezeptoren, die inhibierenden Charakter haben und die sympathische Aktivität durch Hemmung der Erregung der Aktionspotentiale

reduzieren. Zur Beeinflussung der im Rückenmark gelegenen Neurone sind ebenfalls vorwiegend postsynaptische Rezeptoren verantwortlich.

Als Auswirkung auf das respiratorische System hat die Applikation von Romifidin - wie auch für andere 2-Rezeptor Agonisten bereits beschrieben - einen Abfall der Atemfrequenz mit einer Vertiefung einiger Atemzüge zur Folge (VOEGTLI, 1988). Der einer Abnahme ursächlich zu Grunde liegende Mechanismus ist bislang nicht eindeutig geklärt (POULSEN NAUTRUP, 1988), doch wird eine atemdepressive Wirkung als Ursache angenommen. Mit der Abnahme der Atemfrequenz gehen eine Abnahme des Sauerstoff-Partialdruckes (pO2) sowie die Zunahme des Kohlendioxid-Partialdruckes (pCO₂) einher (POULSEN NAUTRUP, 1988; VOEGTLI, 1988). Den Anstieg des Kohlendioxidgehaltes begründet POULSEN NAUTRUP (1988) analog zu Detomidin mit der Abnahme der Atemfrequenz.

Die Auswirkungen von Romifidin auf die Körpertemperatur werden als nicht signifikant angesehen (POULSEN NAUTRUP, 1988). Als ursächlich ist in diesem Zusammenhang der Einfluss der 2-Agonisten zu nennen, die einen Zusammenbruch der zentralen Thermoregulation bewirken, so dass eine gerichtete Änderung der Temperatur fehlt.

Veränderungen der Körperinnentemperatur führen FREEMAN et al. (2002) auf die Aktivierung unterschiedlicher Rezeptoren zurück. Folglich bewirkt eine Stimulation von ₁- Rezeptoren einen Anstieg, demgegenüber eine Aktivierung von 2-Rezeptoren einen Abfall der Körperinnentemperatur. Letzteren sehen FREEMAN et al. (2002) als vorherrschenden Effekt an, da die hohe, 1-Rezeptoren aktivierende Konzentration direkt post applikationem rasch abnimmt.

Die sich unter dem Einfluss von Romifidin einstellende Verringerung der Darmgeräusche (POULSEN NAUTRUP, 1988) wurde von FREEMAN et al. (2001) mittels einer transrektalen Ultraschall-Methode eingehend untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass mit der Minimierung der Muskelkontraktionen im gesamten Darmbereich unter dem Einfluss von Romifidin kleine, intestinale Bewegungen der Darmwand ohne jeglichen Effekt auf den Weitertransport des Darminhaltes resultieren. Eine Erklärung für diese Änderung der Motilität scheint nach FREEMAN et al. (2001) allerdings noch nicht gefunden zu sein. So vermuten die Autoren in ihren Ausführungen, dass entweder eine sympathische Stimulation der Muscularis Mucosa Schicht, ein direkter Effekt des ₂-Agonisten auf die Muskelzellen