Aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der
Dopingrelevanz beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Sophie Koppe (geb. Richers)
aus Berlin
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. h.c. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007
Meinem Mann und
meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 13
2 LITERATURÜBERSICHT 14
2.1. Definition von Doping 14
2.2. Bestimmungen 16
2.3. Methylxanthine 18
2.3.1. Vorkommen 18
2.3.2. Wirkung 19
2.3.3. Theophyllin 27
2.3.4. Theobromin 30
2.4. Pharmakokinetische Grundlagen 32
2.5. Pharmakokinetische Parameter 39
3 MATERIAL UND METHODE 45
3.1. Aufbau des Experiments und Vers uchsplanung 45
3.1.1. Versuchstiere und Haltungsbedingungen 45
3.1.2. Testsubstanzen 46
3.1.3. Vorversuch 47
3.1.4. Hauptversuch 47
3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung 48 3.2. Analytik 49
3.2.1. Chemikalien 49
3.2.2. Instrumente 50
3.2.3. Methodenentwicklung 51
3.2.4. Aufarbeitung der Urinproben 55
3.2.5. Aufarbeitung der Plasmaproben 56
INHALTSVERZEICHNIS
3.3. Validierung der Methode 58
3.3.1. Selektivität und Spezifität 58
3.3.2. Linearität 58
3.3.3. Nachweisgrenze 60
3.3.4. Bestimmungsgrenze 61
3.3.5. Richtigkeit 61
3.3.6. Präzision 62
3.3.7. Stabilität 63
3.3.8. Wiederfindung 64
3.4. Pharmakokinetische Auswertung 65
4 ERGEBNISSE 66
4.1. Ergebnisse der Analysemethoden 4.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und ihrer internen Standards 66
4.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin 66 4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin 67 4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein 69
4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin 70
4.2. Ergebnisse der Validierung 71
4.2.1. Selektivität 71
4.2.2. Linearität 74
4.2.3. Nachweisgrenze (LOD) 77
4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ) 78
4.2.5. Richtigkeit 79
4.2.6. Präzision 83
4.2.7. Stabilität 85
4.2.8. Wiederfindung 87
INHALTSVERZEICHNIS
4.3. Ergebnisse des Hauptversuches 88
4.3.1. Plasma 88
4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 88 4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 91 4.3.1.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 94
4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen 96
4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation 96 4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation 97 4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation 99
4.3.3. Urin 101
4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 101 4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation 104 4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation 107 4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin 109
4.3.4.1. Herzfrequenz 109
4.3.4.2. Atemfrequenz 109
4.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen 109 4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von
Theophyllin 111
4.4.2. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen von
Theobromin 112
4.5. Ausscheidungszeiten 113
4.5.1. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach intravenöser Applikation 113 4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation 114 4.5.3. Ausscheidungszeiten von Theobromin nach intravenöser Applikation 115
INHALTSVERZEICHNIS
5 DISKUSSION 116
5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur
Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin 116 5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin 118 5.3. Bewertung der Ergebnisse 129
6 ZUSAMMENFASSUNG 130
7 SUMMERY 132
8 LITERATURVERZEICHNIS 134
9 TABELLENVERZEICHNIS 148
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 153
11 ANHANG 158
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µmol Mikromol
Abb. Abbildung
AC Adenylatcyclase
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
ATP Adenosintriphosphat
AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (area under the curve)
bzw. beziehungsweise
C Konzentration
ca. circa
Ca++ Calcium
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CL Clearance
CO2 Kohlendioxid
D Gesamtdosis
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EHSLC European Horserace Liaison Committee EPC effektive Plasmakonzentration ESI Electro Spray Ionisation
F Bioverfügbarkeit
f Freiheitsgerade der linearen Kalibration
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft FEI Fédération Équestre International
FN Fédération National
g Gramm
ºC Grad Celsius
h Stunde
H+ Proton
H2O Wasser
HCl Salzsäure
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
HQC High Quality Control Standard
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.
HWZ Halbwertszeit
IPC irrelevante Plasmakonzentration
i.v. intravenös
k10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
k12 Transferkonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment
k21 Transferkonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment
ka Resorptionskonstante
ke Eliminationskonstante
kel Eliminationskonstante
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
KM Körpermasse
l Liter
LC Liquid Chromatography
ln natürlicher Logarithmus LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantification
LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Low Quality Control Standard
λ Hybridkonstante
M Konzentration
Mg++ Magnesium
m/z Masse zu Ladung Verhältnis
mg Milligramm
mmol Millimol
min Minute
ml Milliliter
MQC Midrange Quality Control Standard
MS Massenspektrometrie
ng Nanogramm
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
n.n. nicht nachweisbar n.m. not measured (nicht gemessen) p.a. post applicationem
p.a. pro analysi
PDE Phosphordiesterase
PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch Q Organdurchblutung
QCS Quality Control Standard
Qx Summe der Abweichungsquadrate R2 Korrelationskoeffizient
Sb totale Präzision, interday repeatability
SF Sicherheitsfaktor
SW Tagespräzision, intraday repeatability SxO Reststandardabweichung
Rss Verhältnis von Harn- zu Plasmakonzentration im Steady State t Zeit
t1/2 Halbwertszeit
tA Ausscheidungszeit
Tab. Tabelle
TINV t-Wert der t-Verteilung
V Verteilungsvolumen
Vdβ Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady State Vss Verteilungsvolumen im Steady State
WADA World Anti-Doping Agency
x Mittelwert
z.B. zum Beispiel
EINLEITUNG
1 EINLEITUNG
Zur Zeit gilt im Pferdesport eine sogenannte „Nulllösung“, das heißt, dass bis auf wenige klar definierte Ausnahmen jeglicher Nachweis einer körperfremden Substanz oder ihrer Metaboliten im Blut oder Urin eines Pferdes am Wettkampftag als Einsatz unerlaubter Mittel und damit als Verstoß gegen die Dopingregeln gilt (KIETZMANN et al., 2006a; KLUGE, 2002). Das bedeutet, dass neben tatsächlich verbotenerweise zur Leistungsbeeinflussung eingesetzten Stoffen auch Therapeutika bei nicht ausreichend lang angesetzter Karenzzeit bis zur nächsten Wettkampfteilnahme zur positiven Medikationskontrolle / Dopingkontrolle führen können. Durch diese sogenannte „Nulllösung“ wird die wettkampfnahe Behandlung von Sportpferden sehr schwierig, da erhebliche Unterschiede in Dosierung, Nachweisgrenzen und Pharmakokinetik der einzelnen Wirkstoffe und Ausscheidungsverhalten der Pferde keine Aussage über einheitliche Karenzzeiten erlauben. Um unabsichtliches Doping besser vermeiden und trotzdem eine adäquate Therapie der Sportpferde gewährleisten zu können, hat das European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) ein europaweites Projekt begründet, in dem pharmakokinetische Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen stattfinden. Die ermittelten Daten dienen in einem PK/PD-Modell nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) zur Berechnung unwirksamer Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und im Urin.
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Erarbeitung und Validierung einer geeigneten Analysemethode zur Quantifizierung von Methylxanthinen im Urin und im Plasma von Pferden sowie der Berechnung der Eliminationskinetik von Theophyllin nach intravenöser und oraler Verabreichung sowie von Theobromin nach intravenöser Gabe.
LITERATURÜBERSICHT
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1. Definition von Doping
Laut UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) ist Doping „die Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel der Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen“.
Es werden verschiedene Formen des Dopings unterschieden, wobei man grundsätzlich
„positives Doping“ mit dem Ziel der Leistungssteigerung und „negatives Doping“ mit dem Ziel der Leistungsverminderung voneinander trennen muss. Neben dem „Doping auf Sieg“
mit leistungssteigernden Mitteln wie Stimulanzien (akutes Doping auf Sieg), die kurz vor dem Start appliziert werden (SCHOENE, 1996), oder der Gabe von Anabolika (chronisches Doping auf Sieg) hat im Pferdesport vor allem das „paradoxe Doping auf Sieg“ und das
„Doping auf Wiederherstellung der eigentlichen Leistungsfähigkeit“ Bedeutung (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999; DEBACKERE, 1989). Unter „paradoxem Doping auf Sieg“ versteht man die Verabreichung zum Teil sehr geringer Mengen von Sedativa an nervöse oder ängstliche Pferde, um diese startfähig zu machen (SCHOENE, 1996). Das „Doping auf Wiederherstellung der eigentlichen Leistungsfähigkeit“ ist beim Pferd ebenfalls verbreitet (UNGEMACH 1985). Der Mensch darf einen Wettkampf unter Schmerzmittel- oder Antibiotikawirkung bestreiten, da man davon ausgeht, dass der Athlet diese Entscheidung selbst trägt. Dies ist aus Tierschutzgründen im Pferdesport nicht erlaubt.
Nach den Dopingbestimmungen besteht zum Zeitpunkt des Wettkampfes kein Unterschied zwischen Therapie und Doping, deshalb ist jede Arzneitherapie zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit während des Wettkampfes verboten (UNGEMACH 1985).
Grundlage hierfür ist das Tierschutzgesetz, welches in § 3 Absatz 1 verbietet, Tieren außer in Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen sie offensichtlich nicht gewachsen sind, oder die ihre Kräfte übersteigen und das in Absatz 1b auch ausdrücklich die Verabreichung von Dopingmitteln verbietet (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ, ERNÄHRUNG UND LANDWIRTSCHAFT, 2001). Ausnahmen bilden lediglich Impfungen, Entwurmungsmittel, Immuninducer, Homöopathika sowie einige Desinfektionsmittel.
LITERATURÜBERSICHT
Paragraph 11 des Tierschutzgesetzes verbietet auch das sogenannte „physikalische Doping“.
Damit sind Maßnahmen gemeint, die nicht durch Verabreichung chemischer Substanzen zur Leistungsbeeinflussung führen, sondern die zum Beispiel durch Anbringen von spitzen Gegenständen oder durch elektrische Reize die Schmerzempfindlichkeit des Pferdes verstärken. Unter „Doping mit körpereigenen Substanzen“ versteht man vor allem das Blutdoping und die Verabreichung von Erythropoetin (MÜLLER, 1999). Diese Form des Dopings spielt beim Pferd, im Gegensatz zum Menschen, aufgrund seiner unter Belastung physiologischen Erythrozytenfreisetzung aus der Milz, eher eine untergeordnete Rolle (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999). Unter „negativem Doping“ bzw. „Doping auf Niederlage“ versteht man eine Leistungsverschlechterung des Pferdes zum Beispiel durch Verabreichung von Sedativa oder ähnlichem (UNGEMACH und NÜRNBERGER, 1999).
Eine große Problematik stellt das „unabsichtliche Doping“ im Pferdesport dar. Wenn ein zur Therapie einer akuten Erkrankung eingesetztes Arzneimittel dopingrelevante Nebenwirkungen hat, nach perkutaner Anwendung ein Wirkstoff auch systemisch nachzuweisen ist, oder ein Wirkstoff dopingrelevante Metaboliten bildet, kann es zu positiven Dopingbefunden kommen, ohne dass jemand vorsätzlich gehandelt hat. Das größte Problem hierbei sind häufig unbekannte Absetzfristen von Arzneimitteln, bzw. die individuell sehr unterschiedlichen Eliminationszeiten, bedingt durch verschiedene Stoffwechselleistungen des Organismus und eventuell nicht bedachte Wechselwirkungen zwischen zusammen verabreichten Arzneimitteln (UNGEMACH, 1985; TOBIN und WOOD, 1989). Früher wurde durch sogenannte Maskierungsmittel versucht, den Nachweis von verbotenen Substanzen zu erschweren (SCHOENE, 1996; KLUGE, 2002). Dies hat aber heutzutage aufgrund der sehr empfindlichen Nachweisverfahren kaum noch Relevanz. In Tab.1 sind die verschiedenen Dopingformen nochmals aufgeführt.
LITERATURÜBERSICHT
▫ Doping auf Sieg (akute, chronische, paradoxe Form)
▫ Doping auf Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit positives Doping
▫ Doping mit körpereigenen Substanzen
▫ Physikalisches Doping
_________________________________________________________________________
▫ Doping auf Niederlage negatives Doping
__________________________________________________________________________
▫ unabsichtliches Doping
▫ Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises
Tab.1: Dopingformen nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999)
2.2. Bestimmungen
Das Direktorium für Vollblutzucht und Rennen unterteilt die sogenannten Mittel in fünf Listen: Liste I sind die erlaubten Substanzen wie Impfungen, Liste II enthält Substanzen, für die ein Grenzwert besteht, und Liste III enthält Antiinfektiva, deren Einsatz bei Dokumentation im Medikamentenbuch und Deklaration bei Probenentnahme erlaubt ist. Die unerlaubten Mittel werden in den Listen IV und V geführt, wobei die Liste IV Doping- Substanzen enthält und die Liste V alle Substanzen, welche nicht in einer der Listen I bis IV aufgeführt sind (DIREKTORIUM FÜR VOLLBLUTZUCHT UND RENNEN e.V., 2002).
Der Rennbahntierarzt hat eine strenge Dokumentationspflicht und muss jegliche Verabreichung mit genauer Indikation im Medikamentenbuch eintragen. Dadurch besteht die Möglichkeit eines wettkampfnahen therapeutischen Einsatzes von zum Beispiel Antibiotika.
Die Liste der verbotenen Substanzen der Deutschen Reiterlichen Vereinigung unterteilt alle Substanzen in drei Klassen: Die erste Klasse enthält die Dopingsubstanzen, also Substanzen welche geeignet sind, die Leistung des Pferdes zu beeinflussen, wobei für einige Hormone und Theobromin eine Grenzwertregelung besteht.
Die zweite Klasse beinhaltet die verbotenen Arzneimittel. Das sind therapeutisch eingesetzte Arzneimittel, deren Einsatz aber während des Wettkampfes verboten ist. Auch in dieser Liste gilt für manche Substanzen ein Grenzwert.
LITERATURÜBERSICHT
Die dritte Klasse listet Ausnahmen auf. Das sind Impfstoffe, Antiendoparasitika, Paraimmunitätsinducer, Insektenschutzmittel und Desinfektionsmittel (DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG e.V., 2004).
Diese unterschiedlichen Bestimmungen zeigen auf, dass im Renn- und Turniersport unterschiedliche Regeln gelten:
Der Rennbahntierarzt hat eine strenge Dokumentationspflicht und muss jegliche Verabreichung mit genauer Indikation im Medikamentenbuch eintragen. Es besteht dadurch aber die Möglichkeit des wettkampfnahen therapeutischen Einsatzes von Stoffen der Liste III.
Diese Möglichkeit hat der Tierarzt auf nationaler Ebene nicht. Er muss die Medikation so wählen, dass keine Substanz, außer den Ausnahmen, am Wettkampftag nachweisbar ist, sonst darf er das Pferd nicht starten lassen.
Auf internationaler Ebene besteht nach dem Regelwerk der FEI wiederum die Möglichkeit des wettkampfnahen Einsatzes bestimmter Therapeutika, wenn diese vom Mannschaftstierarzt deklariert und vor Anwendung genehmigt worden sind.
Die Pferdesportverbände führen neben den Wettkampfkontrollen auch Trainingskontrollen durch, die je nach Verband und Bundesland im WADA-akkreditierten Labor am Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln oder in der Abteilung für Dopinganalytik im Veterinärmedizinischen Analysezentrum in Geesthacht untersucht werden.
Im Jahre 2006 wurden im Auftrag der deutschen Pferdesportverbände im Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln 1462 Analysen durchgeführt. Davon wurden 22 Proben positiv getestet und 26 Substanzen nachgewiesen. Die Auflistung ist in Tab.2 tabellarisch dargestellt (www.dshs-koeln.de).
LITERATURÜBERSICHT
gesamt positiv Substanzen Wirkstoff
Trainingskontrollen
120 2 2 1x Flunixin
1x Morphin
Wettkampfkontrollen
1342 20 24 1x Acepromacin
1x Ambroxol
2x Betamethason
1x Boldenon
1x Clenbuterol
2x Dembrexin
1x Diclofenac
1x Flunixin
1x Koffein
1x Kokain
1x Lidocain
2x Methocarbamol
1x Morphin
1x Oxyphenbutazon
1x Pentobarbital
4x Phenylbutazon
1x Theophyllin
1x Xylazin
Summe 1462 22 26
Tab.2: Zusammenfassung der 2006 im Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln im Auftrag der Pferdesportverbände durchgeführten Analysen
2.3. Methylxanthine
2.3.1 Vorkommen
Die Methylxanthine Coffein (1,3,7-Trimethylxanthin), Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) und Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) zählen zu den ältesten Genuß- und Arzneimitteln und kommen natürlicherweise in mehreren Pflanzen vor. Die Kaffeebohne enthält Coffein, Spuren von Theobromin (LEHMANN u. MARTINOD 1967) und in geringen Mengen Theophyllin (ca. 5 mg/kg) (FRANZKE et al., 1968). In Teeblättern lassen sich Theophyllin (ca. 15 mg/kg), Coffein und Theobromin nachweisen. Kakaobohnen enthalten Theobromin (bis zu 3%) und Coffein. Das in Abb.1 mit aufgeführte Paraxanthin (1,7-Dimethylxanthin) ist ein Metabolit von Coffein und Theophyllin und kommt nicht in Pflanzen vor.
LITERATURÜBERSICHT
Coffein: Theophyllin:
Theobromin: Paraxanthin:
Abb.2: Strukturformeln der Methylxanthine
2.3.2. Wirkung
Pharmadynamische Wirkung
Zentrale Wirkungen
Zentral wirken Methylxanthine erregend, besonders im Bereich der Großhirnrinde (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Dies geschieht laut FREY et al. (2002) durch Dämpfung mediothalamischer Strukturen, Stimulation der Großhirnrinde sowie Erregung autonomer Zentren des Gehirns. Die Erregung der Großhirnrinde führt zur allgemeinen Steigerung der psychischen und motorischen Funktionen. Kaffee bzw. Coffein in den üblichen Dosierungen von ca. 50-200 mg bewirkt, dass bei müden Personen die Ermüdung aufgehoben und die Leistungen gesteigert werden, bei ausgeruhten Personen ist allerdings keine Leistungssteigerung zu erzielen (MUTSCHLER, 1996; CHOU, 2003). Laut STAMFORD (1989) bewirkt Coffein eine Verzögerung des Eintrittes der Müdigkeit und eine Erhöhung der Unruhe. In höheren Dosierungen oder bei parenteraler Applikation soll es auch zur Stimulation des Stammhirnes und somit zur direkten Stimulation der autonomen Zentren für Atmung und Kreislauf kommen (LÖSCHER, 2006). ELDRIDGE et al. (1983) konnten bei ihrer Studie nach intracerebroventriculärer Applikation von Theophyllin nicht die gleichen
LITERATURÜBERSICHT
stimulierenden respiratorischen Effekte wie nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin beobachten. RALL (1993) erklärt die Steigerung des Atemminutenvolumens durch die Methylxanthine durch eine Erhöhung der CO2-Empfindlichkeit. Laut WETTENGEL (1998) zeigt sich diese zentrale atemstimulierende Wirkung nur bei Theophyllin.
Die Kontraktion von Hirngefäßen und die Senkung des Liquordruckes durch Methylxanthine werden in der Humanmedizin zur Therapie von vasomotorischen Kopfschmerzen genutzt (MUTSCHLER, 1996). In hohen bis toxischen Dosen können sie allerdings zu Krämpfen führen (LÖSCHER, 2006). Laut MUTSCHLER (1996) besitzt Theobromin diese zentralerregenden Effekte praktisch nicht.
STAHLE et al. (1991) erklären anhand ihrer Studien den stärker ausgeprägten zentralnervösen Effekt von Coffein, im Gegensatz zu Theophyllin, durch eine stärkere Penetration von Coffein in das Gehirn, bedingt durch eine geringe Plasmaproteinbindung.
Periphere Wirkungen
Peripher bewirken die Methylxanthine über Relaxation der Bronchialmuskulatur eine Bronchodilatation (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Sie ist bei Theophyllin am stärksten ausgeprägt. Allerdings konnte von MAGNUSSEN (1986) gezeigt werden, dass Theophyllin im Vergleich mit den β2-Sympathomimetika ein eher schwacher Bronchodilatator ist. Theophyllin steigert außerdem die mucoziliäre Clearence, verbessert die Zwerchfellskontraktionskraft und senkt den pulmoarteriellen Mitteldruck (WETTENGEL, 1998).
Theophyllin hat bereits bei Plasmakonzentrationen von 5-10 mg/l eine protektive Wirkung gegenüber bronchokonstriktorischen Stimuli wie Histamin (WETTENGEL, 1998). Außerdem hemmt es die T-Lymphocytenanhäufung im Lungengewebe und verhindert die Migration der eosinophilen Granulozyten durch Hemmung der Interleukin-5-Freisetzung (MARKHAM u.
FAULDS, 1998; MUTSCHLER, 1990). Am Herzen stimulieren die Methylxanthine alle Herzfunktionen (SAWYNOK u. YAKSH, 1993; LÖSCHER, 2006). Am stärksten ist die Steigerung der Kontraktilität des Herzmuskels, also die positiv inotrope Wirkung (MUTSCHLER, 1996). Außerdem führen Methylxanthine zur Zunahme des coronaren Blutflusses (WETTENGEL, 1998) und zur Coronargefäßerweiterung (MUTSCHLER, 1996).
Dies, zusammen mit der peripheren Vasodilatation, erklärt die verstärkte Organdurchblutung (RALL, 1980). Theophyllin ist dem Coffein hinsichtlich der therapeutisch ausnutzbaren Effekte Broncholyse und Herzstimulation deutlich überlegen (LÖSCHER, 2006).
LITERATURÜBERSICHT
Methylxanthine führen zu einer Verstärkung der Lipolyse (LÖSCHER, 2006; MUTSCHLER, 1996; STAMFORD, 1989; DODD et al., 1993; GRAHAM et al., 1994). Laut MUTSCHLER (1996), LÖSCHER (2006) und GRAHAM et al. (1994) verstärken Methylxanthine auch die Glycogenolyse. STAMFORD (1989) und DODD et al. (1993) hingegen gehen davon aus, dass Coffein die Glycogenolyse reduziert.
Erhöhte Nierendurchblutung und Gefäßerweitung erklären den diuretischen Effekt der Methylxanthine (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Laut MUTSCHLER (1996) können sie als schwache bis maximal mittelstarke Diuretika eingestuft werden.
Außerdem stimulieren sie die Magensaftsekretion (LÖSCHER, 2006) und hemmen die Mastzelldegranulation (MUTSCHLER, 1996). Laut WETTENGEL (1998) und MARKAM und FAULDS (1998) sind im Konzentrationsbereich von 5000-10000 ng/ml antientzündliche und immunmodulierende Effekte nachweisbar.
Die unterschiedlichen Hauptwirkungen der verschiedenen Methylxanthine sind in Tab. 3 zusammenfassend dargestellt.
Wirkung Coffein Theophyllin Theobromin
zentrale Erregung +++ ++ -
Herzstimulation + +++ ++
Broncho- und Vasodilatation ++ +++ +++
Stimulation der Skelettmuskulatur +++ ++ +
Diurese + +++ ++
Tab.3: Pharmakodynamische Wirkungen der Methylxanthine (LÖSCHER, 2006)
Als unerwünschte Wirkungen können Tachycardie, Extrasystolen sowie gastrointestinale Störungen durch Erhöhung der Magensaftsekretion auftreten. Coffein löst im Magen lokale cholinerge Reflexe und die Freisetzung von Gastrin aus (MUTSCHLER, 1996). Daneben kann es zu zentralnervösen Erregungszuständen kommen, weshalb die Anwendung bei epileptischen Patienten besonderer Vorsicht bedarf (LÖSCHER, 2006). In der Humanmedizin wird von der Verabreichung von Methylxanthinen in der Stillzeit abgeraten. In Tierversuchen zeigten sich teratogene Wirkungen (MUTSCHLER, 1996). Während großer körperlicher
LITERATURÜBERSICHT
Anstrengungen besteht eine erhöhte Gefahr von Dehydration aufgrund der Herzfrequenzerhöhung und der gesteigerten Diurese (STAMFORD, 1989).
Beim Pferd kann es bereits bei Dosierungen von 10-30 mg/kg zur Tachycardie, Tachyarrhytmie, Blutdruckabfall, Muskelrigidität und Muskelzittern, Unruhe bis hin zu Krämpfen kommen (LÖSCHER, 2006).
CURRY et al. (1985) konnten die cardiovaskulären Folgen einer experimentellen Theophyllinintoxikation bei Hunden effektiv mit α-Agonisten behandeln. BIBERSTEIN et al.
(1984) berichten von intravenöser Verabreichung von β-Antagonisten als effektivste Therapie des Blutdruckabfalls bei Theophyllinintoxikationen.
Wechselwirkungen
Methylxanthine verstärken die Wirkung von Digitalispräparaten und β2-Sympathomimetika (LÖSCHER, 2006). Coffein greift in die Stoffwechselvorgänge der Leber ein, die für die Bildung von Gerinnungsfaktoren verantwortlich sind (KLÖCKING, 1996). Die Wirkungen von Adenosin und von Benzodiazepinen werden abgeschwächt (NEHLIG et al., 1992).
Cimetidin, synthetische Methylxanthine, Tuberculoseimpfstoff, Gyrasehemmer und Makrolidantibiotika verzögern die Biotransformation von Theophyllin und führen so zu einer verstärkten und verlängerten Wirkung des Theophyllins. Barbiturate und Carbamazetin erniedrigen den Theophyllinplasmaspiegel (MUTSCHLER, 1996). Bei gleichzeitiger Anwendung von Aciclovir muss die Theophyllindosis vermindert werden. Coffein hat eine entzündungshemmende Wirkung und unterstützt auch die antiinflammatorische Wirkung einiger Cyclooxygenasehemmer, ohne selbst die Prostaglandinsynthese zu hemmen (VINEGAR et al., 1976).
Molekulare Wirkungsmechanismen
Die Wirkungen der Methylxanthine werden durch verschiedene Mechanismen erklärt. Da die therapeutischen Plasmakonzentrationen von Theophyllin oder Coffein im Bereich von 10-50 µmol/l liegen, wird die kompetitive Hemmung der Adenosinrezeptoren, die im Konzentrationsbereich von 10-100 µmol/l nachgewiesen wurde, als der Hauptwirkungsmechanismus angesehen (DUNWIDDIE und MASINO, 2001; FREDHOLM, 1980; DODD et al. 1993; RALL, 1982; NEHLING et al., 1992; SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Andere Autoren erklären die Wirkung durch die Hemmung der Phosphordiesterase
LITERATURÜBERSICHT
und dem dadurch bedingten Anstieg der intrazellulären Konzentration von cyclischem Adenosinmonophosphat. Desweiteren führen Methylxanthine zur Calciummobilisation aus dem Sarkoplasmatischen Reticulum und verhindern deren Rückspeicherung. Aufgrund der benötigten Plasmaspiegel von 0,1-1 mmol/l, scheinen die beiden letztgenannten Wirkungsmechanismen von untergeordneter Bedeutung zu sein.
Adenosin- Rezeptor- Blockade
Adenosin-Rezeptoren gehören zu den P1- Purinozeptoren mit den Subtypen A1, A2 und A3
(SAWYNOK u. YAKSH, 1993; MUTSCHLER, 1996; DALY et al., 1983). A1- und A2- Rezeptoren werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Stärke auf die Adenosin-Analoga unterteilt. A1 wird nochmals in A1a und A1b nach der nötigen Agonistenkonzentration und A2
in A2a und A2b nach der unterschiedlichen Affinität zu N-Ethylcarboxamidadenosin an verschiedenen Stellen unterschieden. A3 wird als Rezeptor beschrieben, der den Calciumfluss reguliert, wobei hierbei Adenosin die Aktivität von Ionenkanälen ohne Wirkung auf die cAMP-Konzentration beeinflusst (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Nach RALEVIC und BURNSTOCK (1998) wird heute eine Einteilung der Adenosin-Rezeptoren in die vier Subtypen A1, A2A, A2B und A3 durchgeführt. A1-Rezeptoren sind an Gil/2/3 oder an G0-Proteine gekoppelt, A2A- Rezeptoren an GS, Golf oder an G15/16, A2B-Rezeptoren ebenfalls an GSoder an Gq/11 und A3-Rezeptoren an Gi2/3 oder an Gq/11-Proteine (LELIEUR, 2004). Für die Rezeptoren A1, A2A und A3 konnten bereits spezifische Agonisten und Antagonisten synthetisiert werden (KLOTZ, 2000). Die Kopplung an die Phosphorlipase C zeigt sich bei allen Adenosin- Rezeptoren. Die Aktivierung der Phophorlipase C führt zur Hydrolyse von Phophatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2), wodurch Diacylglycerol (DAG) und Inositol- 1,4,5-Triphosphat (IP3) entstehen. Dies führt zur Aktivierung der Proteinkinase C und zu einer Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels. Außerdem haben die Adenosin- Rezeptoren Einfluss auf die Regulation der Adenylatcyclase. Die A1- und A3-Rezeptoren bewirken eine Inhibition und die A2A- und A2B- Rezeptoren hingegen eine Stimulation der Adenylatcyclase und haben auf diese Weise Einfluss auf den intrazellulären Gehalt an cAMP (LELIEUR, 2004).
Adenosin ist an der Blutdruckregulation im Gehirn und an der Niere beteiligt, am Schlaf- Wach-Rhythmus sowie sehr wahrscheinlich an der Induktion und Aufrechterhaltung des Schlafes. Außerdem hat Adenosin eine thrombocytenaggregationshemmende Wirkung (MUTSCHLER, 1996).
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Die autoregulatorische Steigerung der Coronardurchblutung ist ebenfalls adenosinvermittelt.
Sauerstoffmangel im Myocard bewirkt eine unzureichende Resynthese von ATP, was wiederum zu einer Zunahme von Adenosin führt, welches eine Dilatation der Coronargefäße bewirkt (MUTSCHLER, 1996; GROTHE, 1990).
Wird durch Adenosin über die A1-Rezeptoren am Herzen die Adenylatcyclase gehemmt, öffnen sich die Kalium-Kanäle im Sinusknoten, das Membranruhepotential nimmt zu und die Herzfrequenz sinkt. Adenosin hat eine negativ chronotrope Wirkung. Am AV-Knoten werden durch Adenosin die Calcium-Kanäle blockiert, was zu einem negativ dromotropen Effekt führt. An den Herzkammern hat Adenosin keine Wirkung.
Methylxanthine schwächen durch Blockade der Adenosin-Rezeptoren die Wirkung von Adenosin ab (DUNWIDDIE und MASINO, 2001), und führen so am Herzen zu positiv chronotropen und positiv dromotropen Effekten (MUTSCHLER, 1996).
Adenosin wirkt vasokonstriktorisch an den Vasa afferentia. Die Blockade des Adenosin- Rezeptors durch Methylxanthine führt zu einer Mehrdurchblutung der Niere mit einer Durchblutungssteigerung des Nierenmarks. Der Widerstand der Vasa afferentia sinkt stärker als der der Vasa efferentia, somit steigt die glomeruläre Filtrationsrate. Die Wirkung beruht zumindest teilweise auf einer vermehrten Primärharnbildung. Die verstärkte Durchblutung des Nierenmarks verhindert zusätzlich die Aufrechterhaltung des dort normalerweise hohen Konzentrationsgradienten. Das führt zu einer verstärkten Diurese (MUTSCHLER, 1996).
Wird die adenosinvermittelte Inhibition der Lipolyse durch Coffein antagonisiert, soll dies zu einer Erhöhung der freien Fettsäuren im Blut führen (DODD et al., 1993).
Die kompetetive Adenosin-Rezeptor-Blockade durch Methylxanthine findet laut SAWYNOK u. YAKSH (1993) im Konzentrationsbereich von 10-100 µmol/l statt und liegt damit im Bereich der erreichbaren Plasmaspiegel. Theophyllin ist ein geringgradig potenterer Antagonist als Coffein, und beide Methylxanthine weisen eine geringe Rezeptorsubtypenselektivität auf.
Konzentrationen von 10-300 µmol/l blockieren Adenosin-Effekte prä- und postsynaptisch im zentralen sowie im peripheren Nervensystem. A3-Rezeptoren sind auf ähnliche Methylxanthin-Konzentrationen sensibel, intrazelluläres Andenosin ist nicht methylxanthin- sensibel (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). Laut DODD et al. (1993) bewirken bereits Plasmakonzentrationen von 40 µmol/l eine 50 %ige Blockierung der Adenosin-Rezeptoren.
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Phosphodiesterase- Hemmung
Viele Reaktionen im Organismus laufen über „second messenger“ ab: Der „erste Bote“ (zum Beispiel ein Hormon) bindet an einen speziellen Hormonrezeptor an der Plasmamembran.
Diese Bindung führt zur Stimulierung des membrangebundenen Effektorenzyms Adenylatcycase. Dieses Enzym katalysiert intrazellulär die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zu cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP). Dieser „second messenger“ cAMP steuert über allosterische Interaktionen die Aktivität von sekundären Effektorenzymen, die wiederum bestimmte Proteine in der Zelle phophorylieren und dadurch biologische Wirkungen auslösen (KALSON et al., 1994). Das intrazelluläre Enzym Phosphodiesterase (PDE) baut cAMP wieder ab. Stoffe, die die PDE hemmen, bewirken durch Verhinderung der Spaltung von cAMP, dass der intrazelluläre cAMP-Spiegel hoch bleibt und führen somit zu einer Verlängerung und Intensivierung der cAMP-Wirkung (STRYER, 1990a).
Über diesen Wirkmechanismus führen die Methylxanthine zu ähnlichen Effekten wie die β- Sympathomimetika, welche durch Stimulation der Adenylatcyclase die cAMP- Konzentration erhöhen. Es resultieren Relaxation der glatten Gefäß- und Bronchialmuskulatur, Stimulation der Herzfunktionen und Verstärkung der Lipolyse (LÖSCHER, 2006; MUTSCHLER, 1996; STRYER, 1990b; VOET und VOET, 1994). Die Erhöhung der cAMP-Konzentration in den Thrombocyten hemmt viele Plättchenfunktionen, wodurch Theophyllin aggregationshemmend wirken kann (KLÖCKING, 1996). Phosphodiesterasen werden je nach Substratspezifität und subzellulärer Lokalisation in elf Unterfamilien unterteilt. Coffein und Theophyllin inhibieren sowohl Ca++-abhängige als auch unspezifische, freie und membrangebundene Phosphodiesterasen im Zentralen Nervensystem. Da sie nicht nur die PDE III hemmen, die für die cardialen Effekte verantwortlich gemacht wird, ergeben sich die vielen extracardialen Wirkungen (SPONER, 1996). Eine ungefähr 50%ige PDE-Hemmung durch Coffein wird bei 480-750 µmol/l und durch Theophyllin im Bereich von 350-1000 µmol/l beobachtet (SAWYNOK u. YAKSH, 1993). DODD et al. (1993) geben für eine 50%ige PDE-Hemmung durch Methylxanthine eine Plasmakonzentration von ca. 1000 µmol/l an. FREDHOLM (1985) gibt Plasmakonzentrationen von > 1000 mol/l zur vollständigen PDE-Hemmung an. Laut DALY et al. (1983) werden für diese Hemmung lediglich Konzentrationen von 500-1000 µmol/l erfordert.
Also ist dieser Wirkmechanismus vor allem im Konzentrationsbereich von 100-1000 µmol/l relevant und therapeutische Konzentrationen von 10-50 µmol/l können nicht ausschließlich
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über diesen Weg zu ihrem Effekt führen. Die PDE-Hemmung ist zu einem gewissen Prozentsatz an der Wirkung beteiligt und ist eventuell für die Toxizität mitverantwortlich (SAWYNOK u. YAKSH, 1993).
Mobilisation von Calcium
Der Effekt von Coffein auf den Calciumhaushalt der Zelle wurde zuerst am Skelettmuskel untersucht (BIANCHI, 1961; NEHLIG et al., 1992). Bei Untersuchungen im Labor ließ sich durch Coffein die Kontraktion erhöhen und bei höheren Konzentrationen trat eine Dauerkontraktion auf. Die Kontraktion resultiert aus der Zunahme des intrazellulär verfügbaren Ca++, da Coffein die Freisetzung von Ca++ aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum fördert und die Rückspeicherung hemmt (JOHNSON und INESI, 1969).
Außerdem soll Coffein eine Erhöhung der Sensibilität der Myofilamente für Calcium bewirken ( DODD et al., 1993).
Dies geschieht im Konzentrationsbereich von ca. 1000-2500 µmol/l und trägt somit nur bei höheren Konzentrationen zur Wirkung der Methylxanthine bei und ist eventuell mitverantwortlich für die Toxizität der Methylxanthine (SAWYNOK u. YAKSH, 1993;
KATZ et al., 1977). FREDHOLM (1995) hält einen Einfluss der Calciummobilisation auf die Gesamtwirkung der Methylxanthine für nahezu ausschließbar, da er die nötigen Konzentrationen im millimolaren Bereich angibt. DALY (1993) gibt die nötigen Konzentrationen mit 1-10 mmol/ l an. Laut DODD et al. (1993) werden invitro für die Ca++- Mobilisation und die Verhinderung der Rückspeicherung lediglich Konzentrationen von 500- 750 µmol/l benötigt.
Bei Konzentrationen von 200-2000 µmol/l kann Coffein laut SAWYNOK u. YAKSH (1993) nur durch Verbesserung der Ca++-induzierten Ca++-Ausschüttung indirekt die Calcium- Konzentration erhöhen.
Benzodiazepin – Antagonismus
Anhand von In-vitro-Versuchen an Ratten- und Menschengehirnen konnten MARANGOS et al. (1979) eine kompetitive Hemmung der Diazepamwirkung durch Theophyllin, Theobromin und Coffein nachweisen. Die Hemmwirkung durch Coffein ist stärker als die von Theophyllin und Theobromin und zeigte sich bei Konzentrationen von 500-700 µmol/l. Dies bestätigen auch klinische Studien von MATTILA et al. (1982). Auch BOULANGER (1982) stufte die Methylxanthine als Benzodiazepinantagonisten ein. Laut NEHLIG et al. (1992) binden
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Methylxanthine an Benzodiazepinrezeptoren, ihre Affinität zu diesen ist aber im Vergleich zu Adenosinrezeptoren sehr schwach.
Auswirkungen auf den Noradrenalinabbau
Coffein und Theophyllin verstärken die Noradrenalinwirkungen an Blutgefäßen. Sie hemmen die Wiederaufnahme von Noradrenalin in das Neuron und den Abbau der Katechol-O- Methyltransferase (KALSNER, 1971; KALSNER et al, 1975). Laut NEHLIG, DAVAL und DEBRY (1992) induzieren Coffein und Theophyllin eine Zunahme der Noradrenalinsyntheserate und vermindern die Dichte der β-Adrenorezeptoren im Gehirn. Dies tritt bei Konzentrationen von 150 µmol/l auf und wird an den Wirkungen der Methylxanthine auf das Gefäßsystem beteiligt sein. Laut DODD et al. (1993) und ROBERTSON et al. (1978) verursacht Coffeinaufnahme bei nicht coffeingewöhnten Menschen eine Erhöhung der Plasmacatecholamine.
2.3.3. Theophyllin
1888 entdeckte Albrecht Kossel das Theophyllin als Bestandteil des Tees (WETTENGEL, 1998). Aber erst nachdem die industrielle Herstellung von Theophyllin rund um die Jahrhundertwende möglich wurde, konnte es als Reinsubstanz genutzt werden. Zunächst wurde es allerdings lediglich als Diuretikum eingesetzt. Die bronchospasmolytische Wirkung entdeckte 1922 der Arzt S. R. Hirsch. Seine auf seinen Studien begründete Empfehlung, Theophyllin zur Asthmatherapie einzusetzen, fand allerdings lange Zeit keine Beachtung.
Auch Veröffentlichungen der Ärzte Herrmann und Aynesworth 1936 zum erfolgreichen Einsatz von Theophyllin beim Status asthmaticus hatten zunächst kaum Auswirkungen auf die Anwendung in der Asthmatherapie (WETTENGEL, 1998).
Durchsetzen konnte sich Theophyllin erst nach der Entwicklung von Retard-Präparaten in den 70er Jahren und weiteren Studien, die den therapeutischen Stellenwert als Asthmatherapeutikum zusätzlich begründeten. In den 80er Jahren wurde das Theophyllin von den topischen Steroiden als Basisasthmatherapeutikum verdrängt. Inzwischen ist der kombinierte Einsatz in der Asthmatherapie, gerade bei der Behandlung der schwereren Verlaufsformen, wieder üblich (WETTENGEL, 1998).
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Physikalisch- chemische Eigenschaften
Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin bzw. 1,3-Dimethyl-2,6(1H,3H)-purindion) hat eine Molmasse von 180,16 und die Summenformel C7 H8 N4 O2 (MERCK INDEX, 2001). 1 g löst sich in 120 ml Wasser, besser in heißem Wasser (PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 2006), 80 ml Ethanol oder 110 ml Chloroform (MERCK INDEX, 2001). Theophyllin zersetzt sich in verdünnten Mineralsäuren, Ammoniak und Alkalihydroxid-Lösungen (PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 2006). Durch die heterozyklisch gebundenen N- Atome reagieren die Methylxanthine schwach basisch, Theophyllin hat einen pKa-Wert von 8,77 (MERCK INDEX, 2001). Theophyllin ist weißes, geruchloses, bitter schmeckendes, kristallines Pulver mit einem Schmelzpunkt bei 270°C. Die Strukturformel wird in Abb.1 gezeigt.
Pharmakokinetik
Nach oraler Applikation ist die Resorption von Theophyllin aus dem Magen-Darmtrakt des Menschen und auch des Hundes nahezu vollständig (OGILVIE, 1978). TSE und SZETO (1981) geben die orale Absorption beim Hund mit > 90% an, MC KIERNAN et al. (1981) mit 91%. Die Bioverfügbarkeit wird mit 80-90% und das Verteilungsvolumen mit 0,6 l/kg angegeben (LÖSCHER et al., 2006b; MC KIERNAN et al., 1981). BOURAOUI et al. (1994) ermittelten bei Kaninchen ein Verteilungsvolumen von 0,79 l/kg. LOEFFLER et al.(2000b) konnten bei Hunden eine Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung von 73% nachweisen.
Die Plasmahalbwertzeit nach intravenöser Applikation liegt bei Hunden bei 5 Stunden (LOEFFLER et al., 2000b) bzw. 3,8-6,4 Stunden (TSE und SZETO, 1981), und nach oraler Verabreichung bei 4,3-7,5 Stunden (TSE und SZETO, 1981). LOEFFLER et al. (2000b) ermittelten in ihrer Studie kürzere Halbwertzeiten von 3,2 Stunden nach oraler Applikation.
Laut LÖSCHER (2006) ist die Halbwertzeit tierartlich sehr unterschiedlich. Er gibt sie beim Hund mit 6 Stunden, beim Schwein mit 11 Stunden und beim Pferd mit 10-17 Stunden an.
Methylxanthine werden hauptsächlich in der Leber durch oxidative Demethylierung, Kohlenstoff-Oxidation und Acetylierung metabolisiert. Theophyllin kann zu den Monomethylxanthinen 3- bzw. 1-Methylxanthin demethyliert und weiter zu Harnsäurederivaten oxidiert werden oder durch Ringspaltung direkt zu Uracilderivaten hydriert und oxidiert werden (ARNAUD 1987). Nach TANG- LUI und RIEGELMAN (1981) werden ca. 90% des verabreichten Theophyllins per Ringoxidation und N-Demethylierung zu 1,3-Dimethylharnsäure, 3-Methylxanthin und 1-Methylharnsäure verstoffwechselt. Rund 10%
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des aufgenommenen Theophyllins werden unverändert über die Niere ausgeschieden (OGILVIE, 1978).
Aus Theophyllin kann im Organismus Coffein gebildet werden. Nach TANG-LIU u.
RIEGELMAN (1981) werden beim Menschen ca. 6% des verabreichten Theophyllins zu Coffein metabolisiert, bevor dieses vor der renalen Ausscheidung weiter verstoffwechselt wird. Diese endogene Coffeinsynthese konnte auch bei Pferden beobachtet werden (TODI et al., 1999). STAHLE et al. (1991) konnten in ihren Studien diesen Metabolismus von Theophyllin zu Coffein bei Ratten nicht nachweisen. Eine Synthese von Coffein aus Theobromin oder Paraxanthien konnte nicht beobachtet worden.
Die letale Dosis 50 liegt beim Hund bei 290 mg/kg KM und bei Katzen bei 800 mg/kg KM (SUTTON, 1981).
Therapeutischer Einsatz
Laut MUTSCHLER (1990) ist Theophyllin in der Humanmedizin im Stufenplan der Asthmatherapie bei schweren bis sehr schweren Symptomen vorgesehen, wobei der therapeutische Plasmaspiegel im Bereich von 6000-12000 ng/ml liegt. Humanmedizinisch sind neben Theophyllin als Injektionslösung und als Retardpräparate auch Formen des wasserlößlichen Ethyldiaminkomplexes (Aminophyllin) und Theophyllin- Natriumglycinat im Handel (LÖSCHER, 2006).
Zulassungssituation in der Veterinärmedizin
In der Veterinärmedizin ist zur Zeit kein Präparat mit dem Hauptwirkstoff Theophyllin zugelassen.
Die Dosierung von Theophyllin zur Behandlung von Bronchialasthma und anderen Indikationen für Bronchodilatation wird mit 5-6 mg/kg Körpergewicht intravenös und bis zu 10 mg/kg Körpergewicht oral angegeben. Pferde sollen initial 10 mg/kg appliziert bekommen und anschließend als Erhaltungsdosis 5 mg/kg täglich über 10 bis 14 Tage (LÖSCHER, 2006).
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2.3.4. Theobromin
Theobromin wurde 1842 erstmals von Woskresensky isoliert (ARNAUD, 1984). Früher wurde es als Diuretikum und Herzstimulanz genutzt, bis es von neueren, wirksameren Präparaten ersetzt wurde ( BOOTH, 1977).
Physikalisch- chemische Eigenschaften
Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) hat genau wie Theophyllin eine Molmasse von 180,16 und die Summenformel C7 H8 N4 O2 (MERCK INDEX, 2001). Theobromin ist eine schwache Base (pKs1 < 1) und eine schwache Säure (pKs2 = 10). Ein Gramm Theobromin löst sich in 2000 ml Wasser, in 150 ml kochendem Wasser oder in 2220 ml 95%igem Alkohol. In Ether, Benzol oder Chloroform ist Theobromin fast unlöslich (PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 2006). Bei der Komplexbildung mit Natriumacetat oder Natriumsalicylat entsteht ein stark hygroskopisches Pulver, welches CO2 aus der Luft adsorbiert. Auch Theobromin ist ein weißes, geruchloses kristallines Pulver allerdings mit einem Schmelzpunkt bei 357°C (MERCK INDEX, 2001). Die Strukturformel wird in Abb.1 gezeigt.
Pharmakokinetik
Aus dem Gastrointestinaltrakt von Säugetieren wird Theobromin schnell und gut resorbiert.
Es passiert aufgrund seiner hydrophoben Eigenschaften biologische Membranen gut und verteilt sich in sämtliche Körperkompartimente. So passiert es die Plazentaschranke und penetriert in die Milch. Die Penetration der Blut-Hirn-Schranke erfolgt ebenfalls, allerdings in geringerem Ausmaß als bei Coffein (SNYDER et al., 1981).
Theobromin wird genau wie Theophyllin hauptsächlich in der Leber metabolisiert. Die Ausscheidung erfolgt auch bei Theobromin überwiegend renal. Im Harn sind beim Menschen nach Theobrominaufnahme die Metaboliten 7-Methylxanthin (28-30%), 3-Methylxanthin (14- 21%) und 7-Methylharnsäure sowie 11-12% unverändertes Theobromin enthalten (CORNISH und CHRISTMAN, 1957). Im Harn von Ratten fanden ARNAUD und WELSCH (1979) nach Theobrominverabreichung ursprüngliches Theobromin (49%), 6-Amino-5-[N- Formylmethylamino]-1-Methyluracil (36%), 7-Methylxanthin (7%), 7-Methylharnsäure (4%), 3,7-Dimethylharnsäure (3%) sowie geringe Mengen Dimethylallantoin und N- Methylharnstoff.
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Therapeutischer Einsatz
Theobromin findet heute als Medikament keine Anwendung mehr.
Durch den Theobromingehalt der Kakaobohne und ihren Einsatz in der Futtermittelindustrie sowie als Bestandteil von Schokolade kommt dem Theobromin eher eine Bedeutung als Ursache von Vergiftungen zu. Während des zweiten Weltkrieges wurden dem Viehfutter häufig kakaohaltige Abfälle zugemischt, um den Energiegehalt des Futters preiswert zu erhöhen (LAMBERT et al., 1985). Dies führte zu zahlreichen Intoxikationen (DROLET et al., 1984; SUTTON, 1981). Ebenso wird in der Literatur über Vergiftungen von Haustieren durch die Aufnahme von Schokolade berichtet (SUTTON, 1981; DROLET et al., 1984;
STRACHAN und BENNET, 1994; DECKER und MYERS, 1972).
Die letale Dosis beim Hund wird von STACHAN und BENNETT (1994) mit 100 mg/kg Körpergewicht reinem Theobromin angegeben. Dunkle Schokolade mit einem hohen Kakaoanteil kann bis zu 630 mg Theobromin pro 100 g enthalten, so dass ein kleiner Hund nach dem Verzehr von zwei Tafeln dunkler Schokolade bereits Theobromin in letaler Dosis zu sich genommen hat. Der LD 50- Wert bei Katzen liegt bei ca. 200 mg/kg (SUTTON, 1981).
Zulassungssituation in der Veterinärmedizin
Weder in der Veterinär- noch in der Humanmedizin ist zur Zeit ein Präparat mit dem Hauptwirkstoff Theobromin zugelassen.
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2.4. Pharmakokinetische Grundlagen
Die Wirkung eines Arzneimittels ist das Ergebnis zahlreicher komplexer Vorgänge im Organismus, die in die pharmazeutische, die pharmakokinetische und in die pharmakodynamische Phase unterteilt werden können (MUTSCHLER, 1996). Die pharmazeutische Phase umfasst den Zerfall bzw. das Auflösen des verabreichten Pharmakons in einen resorptionsfähigen Zustand und hängt somit vor allem mit der Galenik des Arzneimittels zusammen. Zur pharmakokinetischen Phase gehören alle Einflüsse des Organismus auf das Arzneimittel (FICHTL et al., 1996). Sie umfasst die Resorption, die Verteilung, den Metabolismus (Biotransformation) und die Exkretion (Ausscheidung) eines Pharmakons (KOCH und RITSCHEL, 1986). Die pharmakodynamische Phase beinhaltet alle Wirkungen des Pharmakons auf den Organismus.
Resorption:
Unter der Resorption eines Pharmakons versteht man dessen Aufnahme in die Blutbahn, über die es dann im Organismus verteilt wird (MUTSCHLER, 1996). Wie schnell und vollständig ein Arzneimittel resorbiert wird, hängt neben vielen Faktoren vor allem von seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften, von der Teilchengröße, der Applikationsart und des Applikationsortes, von der verwendeten Arzneiform, der Größe der Resorptionsfläche, dem Maß der Zerstörung durch z.B. Darmenzyme und der Interaktion mit andern Arzneimitteln ab (BENET et al., 1996; KOCH und RITSCHEL, 1986). Bei der intravasalen Applikation entfällt die Resorption, da das Pharmakon direkt in die Blutbahn verbracht wird. Aufgrund dessen ist der Wirkungseintritt bei der intravasalen Applikation am schnellsten.
Verteilung:
Ist ein Pharmakon in die Blutbahn gelangt, wird es mit dem Blut in alle Organe des Körpers transportiert. Nach DOST (1968) erstreckt sich die Verteilung eines Stoffes auf das Plasma, den Extra- und Intrazellularraum und auf die Anreicherung in bestimmten Geweben.
Stoffeigenschaften wie Lipophilie, Molekülgröße, Plasma- und Gewebsproteinbindung beeinflussen die Verteilung. Ein Pharmakon ist bestrebt die Blutbahn zu verlassen, um sich anhand des Konzentrationsgefälles im gesamten Körper gleichmäßig zu verteilen. Aufgrund dessen wird das Arzneimittel schneller in die stärker durchbluteten Gewebe verteilt als in die weniger gut durchbluteten. Dies gleicht sich nach Erreichen des Verteilungsgleichgewichts wieder aus. Der Austritt des Stoffes aus der Blutbahn geschieht auf ähnlichem Wege wie der
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Eintritt. Allerdings variieren die Bedingungen, wie z.B. das Konzentrationsgefälle, stark in Abhängigkeit des Gewebes oder der Körperflüssigkeit. Neben den bereits oben aufgeführten Faktoren ist auch die Bindung an Plasmaproteine bedeutsam, die eine Abgabe an das Gewebe deutlich verringert.
Unter funktionellen Gesichtspunkten kann der gesamte Organismus in verschiedene Verteilungsräume (Kompartimente) eingeteilt werden. Zum Intrazellularraum (75%) gehören die intrazelluläre Flüssigkeit und die intrazellulären festen Zellbestandteile. Zum Extrazellularraum (25%) gehören das intravasale Plasmawasser, die Flüssigkeit im Intestinum, sowie diejenige im festen Bindegewebe und die transzellulären Flüssigkeiten.
Hinsichtlich ihrer Verteilung und Anreicherung auf die verschiedenen Kompartimente lassen sich Arzneimittel in drei verschiedene Gruppen aufteilen: Stoffe, die sich nur im Plasma verteilen, solche die sich nur im Plasma und im restlichen Extrazellularraum verteilen und Stoffe, die sich sowohl im Extra- als auch im Intrazellularraum verteilen (MUTSCHLER, 1996).
Biotransformation:
Die Metabolisierung von Fremdstoffen erfolgt vor allem in der Leber, aber zum Teil auch in anderen Organen wie dem Darm, der Niere, der Lunge oder der Milz (KOCH und RITSCHEL, 1986). Sie hat den Zweck, Stoffe in eine ausscheidbare Form zu bringen. Dazu werden die Stoffe von Enzymen in einer Phase-I-Reaktion meist zunächst oxidativ, reduktiv oder hydrolytisch verändert, um die Polarität zu erhöhen und besser chemische Bindungen eingehen zu können (FRAIGLE, 1981). Anschließend werden sie in einer Phase-II-Reaktion an einen körpereigenen Stoff gekoppelt, um damit ausgeschieden werden zu können.
Manche der durch Biotransformation entstehenden Stoffe sind weiterhin wirksam, werden erst durch die Biotransformation wirksam oder haben sogar schädliche Wirkungen. Andere Stoffe wiederum behindern ebenfalls auszuscheidende Stoffe bei der Ausscheidung oder beschleunigen diese. Diese Mechanismen können die Wirksamkeit mancher Arzneimittel stark verändern und müssen als Neben- oder Wechselwirkungen beachtet werden (MUTSCHLER, 1996).
Ausscheidung:
Die Ausscheidung eines Pharmakons erfolgt entweder in unveränderter Form oder als Metabolit. Das Hauptausscheidungsweg ist renal über den Urin. Desweiteren kann ein Stoff biliär und intestinal über die Faezes oder pulmonal über die Ausatemluft ausgeschieden
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werden. Eine Ausscheidung über die Milchdrüse, die Haut und den Speichel oder Schweiß sind ebenfalls möglich, quantitativ allerdings von untergeordneter Rolle (BENET et al., 1996).
Die renale Ausscheidung von Stoffen kann je nach Löslichkeit, Proteinbindung und pka- Wert und pH-Wert des Urins in Form von glomerulärer Filtration, tubulärer Rückresorption sowie als aktive tubuläre Sekretion erfolgen. Durch die glomeruläre Filtration wird in der Niere ein Ultrafiltrat des Plasmas abgepresst. Auf diesem Weg gelangen freie, nicht proteingebundene Stoffe in den Primärharn. Die tubuläre Rückresorption der Stoffe erfolgt durch passive Diffusion. Daher ist diese durch den pH-Wert des Urins zu verändern. Ansäuerung oder Alkalisierung des Urins kann dazu führen, dass ein Pharmakon überwiegend in der nichtionisierten Form vorliegt, somit nicht rückresorbiert und dadurch schneller ausgeschieden wird (KAMERLING und OWENS, 1994). Bei der tubulären Sekretion werden Stoffe durch aktiven Transport ausgeschieden. Starke Säuren und Basen werden auf diesem Weg ausgeschieden. Eine Proteinbindung beeinflusst die tubuläre Sekretion nicht.
Stoffe mit einem Molekulargewicht von über 500 Dalton werden meist über die Galle ausgeschieden. Sie treten entweder durch Diffusion oder durch aktiven Transport aus der Leberzelle in die Gallenkapillare über. Die pulmonale Ausscheidung erfolgt nur per Diffusion anhand des Konzentrationsgefälles zwischen Blut und Atemluft.
Basierend auf gemessenen Plasmakonzentrationen erfolgen pharmakokinetische Berechnungen unter Verwendung verschiedener Modellvorstellungen:
Kinetik 0. Ordnung:
Hierbei wird pro Zeiteinheit eine konstante Menge eine Pharmakons resorbiert oder eliminiert. Die Größe der Änderung erfolgt dabei unabhängig von der Ausgangskonzentration (FORTH et al., 1996). Es wird pro Zeiteinheit eine konstante Menge resorbiert oder eliminiert bis schließlich das gesamte Depot resorbiert/ eliminiert ist (KOCH und RITSCHEL, 1986).
Ein solcher Verlauf kommt dann vor, wenn der aufnehmende (z. B. ein aktiver Transportmechanismus) bzw. ausscheidende (z.B. ein Enzym) Mechanismus gesättigt ist.
LITERATURÜBERSICHT
t M
Abb.3: Resorption nach einer Kinetik 0. Ordnung (FREY, 2002)
M = Konzentration t = Zeit
Kinetik 1. Ordnung:
Bei einer Kinetik 1. Ordnung wird ein Pharmakon proportional seiner jeweiligen Konzentration resorbiert oder eliminiert (KOCH und RITSCHEL, 1986). Trägt man die Menge im Depot (M) gegen die Zeit (t) auf, erhält man eine Exponentialkurve, die sich n, er Menge im Depot) kann diese Kurve in eine Gerade umgewandelt werden (FREY, 2006;
.
asymptotisch der Nulllinie nähert. Durch Logarithmierung der Ordinate (der Konzentratio d
KIETZMANN, 1983)
t M
Abb.4: Lineare Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
M = Konzentration t = Zeit
LITERATURÜBERSICHT
1 10
log M
t
Abb.5: Halblogarithmische Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
M = Konzentration
4). Dabei ird der Organismus in einzelne Verteilungsräume (Kompartimente) unterteilt, die kinetisch betrachtet werden und in denen jeweils die Wirkstoffkonzentration identisch ist OCH und RITSCHEL, 1986). Je nach Applikationsart, Verteilungsverhalten, artimentmodelle ngewendet werden (KIETZMANN, 1983).
Kinetik nach i.v. Injektion:
ravenöser Applikation im Körper als in
t = Zeit
Pharmakokinetische Modelle:
Zur Beschreibung der Konzentrationsverläufe von Wirkstoffen werden in der Pharmakokinetik häufig Kompartiment-Modelle verwendet (DYKE und SAMS, 199
w
als einheitlich (K
Metabolisierungs- und Eliminationsverhalten können Ein- oder Mehrkomp a
Ein-Kompartiment-Modell /
Hierbei wird angenommen, dass sich ein Stoff nach int
einem einzigen Kompartiment gleichmäßig verteilt (DERENDORF, 2002).
Abb.6: Ein-Kompartiment-Modell nach intravenöser Applikation
1 = zentrales Kompartiment
K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
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Folgt die Elimination dabei einer Kinetik 1. Ordnung, lässt sich die Abnahmegeschwindigkeit des Plasmaspiegels berechnen und ergibt nach Integration die Exponentialfunktion:
t = C0 · e -kel · t
rade mit der Gleichung:
C = ln C0 – kel · t
Geschwindigkeit der Elimination.
wei-Kompartiment-Modell / Kinetik nach i.v. Injektion:
esem Modell geht man davon aus, dass sich der Stoff nach intravenöser Verabreichung it unterschiedlicher Geschwindigkeit in die verschiedenen Kompartimente verteilt. Man
s timent, welches sich kinetisch wie das Transportorgan Blut e ripheres Kompartiment (DERENDORF, 2002). Laut BAGGOT (1978) sc t d s rmakokinetik der meisten Therapeutika am besten.
C
Bei logarithmischer Umformung erhält man eine Ge
ln
kel = Eliminationskonstante
C0, Ct = Plasmaspiegel zur Zeit t bzw. Ausgangskonzentration
Die Steigung der Geraden ist ein Maß für die
Z Bei di m
unter cheidet das zentrale Kompar verhält und in pe
be hreib ie es Modell die Pha
Abb. 7: Zwei-Kompartiment-Modell nach intravenöser Applikation
1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment
12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1 K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
K K
LITERATURÜBERSICHT
Bei halblogarithmischer Darstellung der Plasmakonzentrationen fallen diese zunächst rasch bfallenden Geraden zu liegen. Es zeigt sich ein
n n.
ie Gleichung für die Plasmakonzentrationskurve lautet wie folgt:
C =
C = Plasmakonzentration C1 und Cz = Ordinatenabschnitte C und C = C0
ab, um später auf einer weniger stark a biexpo entieller Phasenverlauf der Gerade D
t z
t C e
e
C1⋅ −λ1⋅ + 2⋅ −λ⋅
1 2
λ1 und λz = Hybridkonstanten
ohl Verteilungs- als auch Hybridkonstanten sind Geschwindigkeitskonstanten, in die sow
Eliminationsvorgänge einfließen.
λ1 charakterisiert vorwiegend die Verteilungsgeschwindigkeit, λz vorwiegend die
inetik bei einmaliger oraler Gabe:
ei oraler Verabreichung laufen Resorption, Verteilung und Elimination parallel zueinander Eliminationsgeschwindigkeit,.
K B
ab. Bei einem diese Situation beschreibenden Modell muss ein Eingangskompartiment hinzugefügt werden, welches das Substanzdepot enthält (MUTSCHLER, 1996).
Abb. 8: Zwei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation
0 = Eingangskompartiment
K 01 Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
1 = zentrales Kompartiment
=
=
LITERATURÜBERSICHT
Abb. 9: Drei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation
Funktion gibt die Gleichung für die Kurvenverläufe für Resorption, limination und gleichzeitige Resorption und Elimination linear und halblogarithmisch
r 10):
=
0 = Eingangskompartiment 1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment
K 01 = Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
K 12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 K 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1
Die sogenannte Bateman- E
wiede (BATEMAN, 19
(
kelt k t)
el
e k e
k k
C ⋅ − ⋅ − − ⋅
−
⋅ 1
1 1
C 0
.
2.5. Pharmakokinetische Parameter
):
ls Bioverfügbarkeit (F) wird das Ausmaß und die Geschwindigkeit bezeichnet, mit der ein m freigesetzt, resorbiert und am Wirkort verfügbar ist. Somit erabreichten Arzneimittels nahezu 100%. Nach xtravasaler Verabreichung beträgt die Bioverfügbarkeit weniger als 100% (FICHTL et al., Bioverfügbarkeit (F
A
Wirkstoff aus einer Arzneifor
beträgt die Bioverfügbarkeit eines intravenös v e
1996).
Stellvertretend für die nicht messbare Konzentration am Wirkort, wird die Bioverfügbarkeit durch Konzentrationsmessung im Plasma oder Urin ermittelt. Diese Methode ist nicht für
LITERATURÜBERSICHT
topisch angewendete Stoffe zulässig, da diese nicht über den Blutweg zu ihrem Zielorgan elangen.
it ermittelt, indem zunächst der Wirkstoff intravasal erabreicht wird, um so die volle Bioverfügbarkeit zu erhalten. Anschließend wird die gleiche
achdem die Flächen unter den beiden Plasma-Konzentratrions- rve / AUC), die das Maß für die Konzentration im Organismus l den, kann die Bioverfügbarkeit wie folgt berechnet werden (KOCH nd RITSCHEL, 1986):
g
Praktisch wird die Bioverfügbarke v
Dosis extravasal verabreicht. N Kurven (Area under the cu darstel en, berechnet wur u
F = 100
. .v
AUCAUCix ⋅
[%]
zentration- Zeit- Kurve bei extravasaler Applikation
AUC . = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve bei intravenöser Applikation
aß für die Ausscheidungsgeschwindigkeit eines Stoffes. Sie asmavolumen, welches pro Zeiteinheit von dem Stoff gereinigt
wird wie folgt berechnet:
F = Bioverfügbarkeit AUCx = Fläche unter der Kon
i.v.
Clearance (CL):
Die Clearence ist ein M bezeichnet das virtuelle Pl
wird. Die Gesamtkörper-Clearance
CL = AUC
D [ml/min]
CL = Gesamtkörper-Clearance D = Dosis
AUC = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve
Wird ein Stoff ausschließlich durch ein Organ eliminiert, entspricht die Gesamtkörper- learance der Organ-Clearance. Ist jedoch, wie in den meisten Fällen, mehr als ein Organ an
Clearances zusammen (SAMS, 1992):
C
der Eliminierung des Arzneimittels beteiligt, setzt sich die Gesamtkörper-Clearance aus den verschiedenen Organ-
