Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Dembrexin hinsichtlich der Dopingrelevanz
beim Pferd
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Susanne Massmann
aus Paderborn Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: PD Dr. B. Ohnesorge
Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2004
Meinem Vater
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG 1
II LITERATURÜBERSICHT 4
1 Doping im Pferdesport 4
1.1 Begriffsbestimmungen 7
1.1.1 Doping 7
1.1.2 Doping auf Sieg 8 1.1.3 Doping auf Niederlage 8
1.1.4 Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit 9 1.1.5 Doping mit körpereigenen Substanzen 9 1.1.6 Unabsichtliches Doping 9 1.1.7 Physikalisches Doping 10 1.2 Grundlagen der Dopingbestimmungen 10
1.3 Dopingbestimmungen der Pferdesportverbände 11 1.3.1 Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI) 11 1.3.2 Deutsche Reiterliche Vereinigung (FN) 12
1.3.3 Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen e.V. (HVT) 12 1.3.4 Direktorium für Vollblutzucht und Rennen (DIR) 12 2 Pharmakokinetische Grundprinzipien 14
3 Analytik 21
3.1 Allgemeiner Überblick 21 3.2 Gaschromatographie 23 3.2.1 Die Trennsäule 23 3.2.2 Der Injektor 24 3.2.3 Der Säulenofen 25 3.2.4 Detektor 25
3.3 Massenspektrometrie (MS) 26 4 Pathophysiologie der Atemwegserkrankungen beim Pferd 28 4.1 Physiologie des Atmungstraktes 28
4.2 Chronisch obstruktive Bronchitis (COB) 29
5 Dembrexin 31 5.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften 31 5.2 Wirkungen und therapeutische Anwendungen 31
5.2.1 Wirkungen auf die tracheobronchiale Sekretion 32 5.2.2 Wirkungen auf das Surfactantsystem 33 5.2.3 Antitussive Wirkung 35 5.2.4 Klinische Studien 36
5.3 Pharmakokinetik von Dembrexin 37 5.3.1 Resorption 37 5.3.2 Verteilung 37 5.3.3 Metabolismus 37 5.3.4 Elimination 38 III MATERIAL UND METHODEN 39
1 Versuchstiere 39
2 Angewandtes Präparat 41
3 Vorversuch 41
4 Hauptversuch 42
4.1 Durchführung des Versuchs mit intravenöser Applikation 42 4.1.1 Dosierung und Applikation 42 4.1.2 Entnahme der Blut- und Urinproben 43
4.2 Durchführung des Versuchs mit oraler Applikation 43 4.2.1 Dosierung und Applikation 43 4.2.2 Entnahme der Blut- und Urinproben 44
5 Analytik 45
5.1 Chemikalien 45 5.2 Aufbereitung der Plasmaproben 46
5.2.1 Aufbereitung der Plasmaproben ohne Hydrolyse 46 5.2.2 Aufbereitung der Plasmaproben mit saurer Hydrolyse 47 5.2.3 Aufbereitung der Plasmaproben mit Hydrolyse durch
ß-Glucuronidase 47
5.2.4 Aufbereitung der Plasmaproben mit Hydrolyse durch
ß-Glucuronidase/Arylsulfatase 47 5.3 Aufbereitung der Urinproben 48 5.4 Gerätebedingungen 51 6 Validierung der eingesetzten Methode 52 6.1 Selektivität 52 6.2 Wiederfindung 52 6.3 Linearität 52 6.4 Sensitivität der Methode 54 6.5 Nachweisgrenze 54 6.6 Richtigkeit der Methode 55 6.7 Präzision der Methode 55 6.8 Stabilität 56
6.9 Analytik für Dembrexin nach intravenöser Applikation 57 6.10 Analytik für Dembrexin nach oraler Applikation 57 7 Pharmakokinetische Auswertung 58
IV ERGEBNISSE 59
1 Analytik 59
1.1 Gaschromatographische und massenspektrometrische Bestimmungen 59 1.2 Ergebnisse des Vorversuchs 62 1.3 Ergebnisse der Validierung 64 1.3.1 Selektivität 64 1.3.2 Wiederfindung 66 1.3.3 Linearität 66 1.3.4 Sensitivität der Methode 69 1.3.5 Nachweisgrenze 70 1.3.6 Richtigkeit der Methode 70 1.3.7 Präzision der Methode 72 1.3.8 Stabilität 73
1.4 Ergebnisse des Hauptversuchs 78 1.4.1 Pharmakokinetik nach intravenöser Applikation 78
1.4.1.1 Plasma 78
1.4.1.2 Urin 87
1.4.2 Pharmakokinetik nach oraler Applikation 92 1.4.3 Bioverfügbarkeit 98
1.5 Berechnung irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen 99
V DISKUSSION 106
1 Eignung der GC/MS-Methode zum Nachweis von Dembrexin in
Plasma und Urin 106
2 Pharmakokinetik von Dembrexin 108
2.1 Pharmakokinetik von Dembrexin nach intravenöser Applikation 108 2.2 Pharmakokinetik von Dembrexin nach oraler Applikation 113
3 Bewertung der Ergebnisse 115
VI ZUSAMMENFASSUNG 119
VII SUMMARY 122
VIII LITERATURVERZEICHNIS 124
IX ANHANG 133
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AMG Arzneimittelgesetz AUC Area under the curve ß-Gluc. ß-Glucuronidase
ß-Gluc./Aryls. ß-Glucuronidase/Arylsulfatase bzw. beziehungsweise
C Konzentration
C0 Konzentration zum Zeitpunkt 0 ca. cirka
Cl Clearance
COB Chronisch obstruktive Bronchitis D Dosis
d.h. das heißt
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EPC Effektive Plasmakonzentration F Bioverfügbarkeit
FEI Fédération Équestre international FN Fédération nationale g Gramm
GC Gaschromatographie h Stunde
HNED Highest No Effect Dose
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen i.m. intramuskulär
i.p. intraperitoneal
IPC Irrelevante Plasmakonzentration ISTD interner Standard
IUC Irrelevante Urinkonzentration i.v. intravenös
ka Resorptionskonstante ke Eliminationskonstante kg Kilogramm
KM Körpermasse l Liter
LLQC Lower limit of quantification ln natürlicher Logarithmus LOD Limit of detection
LPO Leistungsprüfungsordnung µg Mikrogramm
µl Mikroliter m Meter max maximal mg Milligramm
min Minute ml Milliliter mm Millimeter
MS Massenspektrometrie
MSTFA N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid m/z Masse durch Ladung
ng Nanogramm niv nicht-intravenös n.n. nicht nachweisbar
PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch p.o. per os
R2 Regressionskoeffizient RA relative Abweichung RO Rennordnung
Rss Urin/Plasma-Konzentrationsverhältnis im Steady State s. siehe
sb Zwischenpräzision s.c. subcutan
SCAN Totalionenstrom
SEV Sekundärelektronenvervielfacher SF Sicherheitsfaktor
SID single ion detection SIM single ion monitoring s.o. siehe oben
sw Wiederholpräzision t Zeit
t1/2 Halbwertszeit Tab. Tabelle TMS Trimethylsilyl u.a. und andere u.s.w. und so weiter Vd Verteilungsvolumen vgl. vergleiche
x Mittelwert z.B. zum Beispiel
I EINLEITUNG
Aufgrund der Dopingbestimmungen der deutschen Pferdesportverbände (Deutsche Reiterliche Vereinigung (FN), Direktorium für Vollblutzucht und Rennen (DIR), Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen (HVT)), ist jede Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit einem Wettkampf verboten, auch wenn diese medizinisch gerechtfertigt ist. Als Doping gilt die nachgewiesene Anwendung von Substanzen, die auf der Dopingliste stehen. Ausgenommen sind einige wenige Therapeutika, für die Grenzwerte festgelegt wurden.
Der Wissensstand über die Ausscheidungszeit und Nachweisdauer von Arzneimitteln in Blut und Urin ist für viele Substanzen unzureichend, was unter anderem auch für Dembrexin gilt.
Das stellt den behandelnden Tierarzt vor das Problem, zu entscheiden, wie lange vor einem Wettkampf ein Medikament eingesetzt werden darf, ohne dass das Pferd in einer Dopingkontrolle positiv getestet wird. Die Kenntnis der Eliminationskinetik eines Arzneimittels kann möglicherweise dazu beitragen, Absetzfristen bzw. sogenannte Karenzzeiten zu ermitteln. Ein solche Karenzzeit gibt den Zeitraum an, in dem das Pferd nach einmaliger Gabe der Substanz nicht an den Start gehen darf (DÜE 1998). Als Richtwerte können sie dem Tierarzt oder Besitzer dienen, den Zeitpunkt zu bestimmen, wann ein Pferd nach Absetzen eines Medikamentes wieder an einer Leistungsprüfung teilnehmen kann. Diese Absetzfristen können jedoch nicht als verbindlich gesehen werden, da die Nachweisdauer einer Substanz in Blut und Urin von mehreren Faktoren beeinflusst wird. Unter anderem wird sie auch wesentlich durch die Analysemethoden und Nachweisempfindlichkeit der Labors bestimmt.
In Anbetracht dieser Problematik findet ein europaweites Projekt zur internationalen Harmonisierung von Untersuchungsmethoden in Dopinglabors statt. An diesem Projekt ist Deutschland neben Irland, Frankreich, Italien und Großbritannien mit der Prüfung von vier Arzneistoffen, unter anderem Dembrexin, beteiligt. Bei den zu untersuchenden Arzneistoffen, handelt es sich vornehmlich um Substanzen, die zu Therapiezwecken eingesetzt werden.
Dembrexin ist ein Arzneimittel, dessen Einsatz im Pferdesport nach der Einteilung von UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) in die Kategorie des „Dopings zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit“, bzw. „Unabsichtliches Doping“ fällt.
Tabelle 1 zeigt die Anzahl und Häufigkeit der mit Dembrexin positiv getesteten Dopingproben aus dem Institut für Biochemie der deutschen Sporthochschule Köln von 1999 bis 2002.
Tab. 1: Anzahl und Häufigkeit (Prozent der insgesamt analysierten Proben) der im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule in Köln mit Dembrexin positiv gegebenen Proben von 1999-2002
Jahr FN DIR
1999 2 (0,4 %) 2 (0,3 %)
2000 3 (0,4 %) 3 (0,3%)
2001 1 (0,2 %) 1 (0,1 %)
2002 3 (0,7 %) -
Hinsichtlich der Dopingproblematik ist dieser Wirkstoff deshalb von besonderer Bedeutung, da er sehr häufig bei chronisch kranken Pferden und demzufolge teilweise über einen langen Zeitraum eingesetzt wird. Eine Besserung des Gesundheitszustandes im Verlaufe der Behandlung verleitet schnell zu der Annahme, das Pferd sei wieder einsatzbereit und voll belastbar. Dieser Aspekt ist nicht zuletzt tierschutzrelevant.
Ziel dieser Arbeit ist es, eine geeignete Analysemethode für Dembrexin zu entwickeln und zu validieren und das pharmakokinetische Verhalten dieser Substanz zu untersuchen. Anhand der Ergebnisse soll eine Aussage darüber getroffen werden, wie lange Dembrexin in Plasma und Urin detektierbar ist und welche Konsequenz das für den Einsatz vor einem Wettkampf hat.
In den folgenden Kapiteln wird zunächst auf die Dopingproblematik im Pferdesport, pharmakokinetische Grundprinzipien und das analytische Verfahren eingegangen. Da Dembrexin zur Therapie von Atemwegserkrankungen bei Pferden eingesetzt wird, soll weiterhin kurz der physiologische Zustand der Lunge und die Veränderungen bei der chronisch obstruktiven Bronchitis, einem wichtigen Indikationsgebiet von Dembrexin skizziert werden. Schließlich wird auf die Eigenschaften und Wirkungen von Dembrexin und die Ergebnisse bisheriger pharmakokinetischer Studien eingegangen.
II LITERATURÜBERSICHT
1 Doping im Pferdesport
Schon bevor die Menschen sich Dopingsubstanzen zu eigen machten, um ihre sportlichen Leistungen zu verbessern, wurden Pferden Mittel zur Leistungssteigerung verabreicht. So nutzte man im Römischen Reich ein Gemisch aus Honig und Wasser, bezeichnet als
„Hydromel“, bei Streitwagenpferden, worauf die Todesstrafe (Kreuzigung) stand (BERNSCHNEIDER und RICHTER 1980, DEBACKERE 1989, PICK 1993). Die ältesten bekannten Dopingbestimmungen, mit denen in England die Anwendung von „Stimulantien“
bei Pferden verboten wurde, stammen aus dem Jahre 1666. 1881 wurde in Preußen die Verabreichung alkoholischer Zubereitungen an „feige“ Pferde unter Strafe gestellt (UNGEMACH 1985).
Erste Dopingkontrollen ordnete der Australische Jockey Klub im Jahr 1910 an. Ein russischer Chemiker behauptete, Alkaloide im Speichel von Pferden nachweisen zu können. Er weigerte sich jedoch, seine Methode preiszugeben (DEBACKERE 1989). Eine gezielte Dopingbekämpfung setzte um 1900 ein. Die rasante Zunahme des Einsatzes von leistungssteigernden Substanzen bei Leistungsprüfungen und die schnelle Neuentwicklung von Medikamenten, führte zu dem Erlass immer neuer Dopingordnungen (UNGEMACH 1985, DEBACKERE 1989). TOBIN et al. (1985) zeigten auf, dass durch die Dopingkontrollen und Sanktionierungen ein deutlicher Rückgang der positiven Dopingfälle verzeichnet werden kann.
In Deutschland wird die unerlaubte Leistungsbeeinflussung im Pferdesport heute durch die Dopingbestimmungen der drei großen Pferdesportverbände reglementiert (LEISTUNGSPRÜFUNGSORDNUNG (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V.
[FN]; RENNORDNUNG (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen e.V. [DIR];
TRABRENNORDNUNG des Hauptverbandes für Traber-Zucht und – Rennen e.V. [HVT]).
Sie stimmen mit dem generellen Verbot jeglicher „körperfremder“ Substanzen zum Zeitpunkt
eines Wettkampfes weitestgehend überein. Für einige wenige Arzneimittel wurden Grenzwerte festgelegt.
Die sogenannte „Null-Lösung“, d.h., dass der Nachweis jeder beliebigen Menge eines Arzneimittels als positiver Dopingbefund gewertet wird, gibt immer wieder Anlass zur Diskussion, da es mit den heutigen Analysemethoden möglich ist, geringste Mengen einer Substanz, die oftmals weit unterhalb der pharmakologisch wirksamen Konzentration liegen, nachzuweisen. Daher wird von einigen Autoren gefordert, Grenzwerte für Medikamente festzulegen. So wird von TOUTAIN und LASSOURD (2002) vorgeschlagen, die Plasma- und Urinkonzentrationen zu berechnen, bei denen keine relevante pharmakologische Wirkung eines Medikaments mehr zu erwarten ist. Diese „irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen“ sollen anhand von pharmakokinetischen und klinischen Daten ermittelt werden. Mit dieser Vorgehensweise soll im Gegensatz zur oben genannten „Null-Lösung“
eine ordnungsgemäße Behandlung der Pferde gesichert werden. Nachteil dieser Vorgehensweise ist jedoch, dass sie nicht auf Arzneimittel, die lokal appliziert werden oder auf Arzneimittel, deren pharmakologische Wirkung länger andauert, als sie im Körper präsent sind (z.B. Anabolika) angewendet werden kann. Weiterhin ist laut TOUTAIN und LASSOURD (2002) Urin als Matrix für diese Untersuchungen weniger geeignet. Eine ähnliche Vorgehensweise wie TOUTAIN und LASSOURD (2002) haben TOBIN et al.
(1999) mit dem Vorschlag, eine „Highest No Effect Dose“ (HNED) eines Arzneimittels zu ermitteln. In einem Experiment am Pferd wird diesem die geschätzte höchste Dosis, die keine pharmakologische Wirksamkeit mehr besitzt, verabreicht. Daraufhin wird die Konzentration des Analyten, entweder das Arzneimittel selbst oder dessen Metabolit, mit einer geeigneten Methode gemessen. Die auf diese Weise ermittelten Daten können nach TOBIN et al. (1999) allerdings nicht angewendet werden, wenn das Arzneimittel auf eine andere Weise oder mehrfach verabfolgt wurde, oder wenn eine andere Analysemethode verwendet wird.
Um dem Tierarzt, Besitzer oder Trainer einen Anhaltspunkt zu geben, wann ein Medikament vor einem Wettkampf abgesetzt werden muss, wurden für einige Substanzen sogenannte Absetzfristen (Karenzzeiten) festgelegt. KLAUS und HAPKE (1994) geben Vorschläge für einige nichtsteroidaler Antiphlogistika:
Phenylbutazon und Flunixin-Meglumin 7 Tage
Meclofenaminsäure 6 Tage
Naproxen und Acetysalicylsäure 5 Tage
Das unveröffentlichte Handbuch zur Medikation der Deutschen Reiterlichen Vereinigung enthält derzeit Karenzzeiten für 17 Arzneimittel.
Da die Ausscheidungszeit einer Substanz interindividuellen Schwankungen unterliegt und sich unter Praxisbedingungen von denen unter Versuchsbedingungen erheblich unterscheiden kann, können diese Absetzfristen nur als Richtwerte gelten. Sie sind nicht verbindlich.
Insbesondere ist zu beachten, dass verschiedene Faktoren die Eliminationszeit eines Arzneimittels beeinflussen, so z.B.:
Harnproduktion
Die Harnproduktion entscheidet maßgeblich über die Arzneimittelmenge die ausgeschieden wird. Die Angaben über die Urinproduktionsmenge beim Pferd sind unterschiedlich. GÄBEL (2000) gibt für Pferde 3-18 ml/kg KM/Tag an, SCHÄFER (1999) 24-48 ml/kg KM/Tag.
Beeinflusst wird das Urinvolumen von vielen physiologischen Faktoren, wie z.B. diurnalen Schwankungen, Flüssigkeitsaufnahme, Stress, körperlicher Belastung u.a. (SAMS 1992).
pH-Wert des Harns
Die renale Elimination von Arzneimitteln hängt vom pH-Wert des Urins ab. Da dieser beispielsweise durch ein intensives Training oder einen Wettkampf erniedrigt wird, werden schwach saure Substanzen (wie z.B. viele nichtsteroidale Antiphlogistika) langsamer, schwach basische (z.B. Lokalanästhetika) teilweise schneller ausgeschieden (UNGEMACH 1985, BAAK 1990).
Metabolisierungsrate der Arzneimittel in der Leber
Eine verminderte Durchblutung der Leber, wie sie z.B. bei starker Belastung vorkommt, kann bei Medikamenten, die normalerweise zu einem großen Teil der hepatischen Elimination unterliegen, zu einer langsameren Ausscheidung führen (BAAK 1990).
Interaktion gleichzeitig verabreichter Medikamente
Beispielsweise werden Lokalanästhetika vom Estertyp durch bestimmte Enzyme abgebaut.
Gleichzeitige Verabreichung von Anthelmintika, die diese Enzyme hemmen, können zu einer verlangsamten Ausscheidung der Lokalanästhetika führen (UNGEMACH 1985).
Gesundheitszustand des Pferdes
Kranke Tiere scheiden Arzneimittel häufig langsamer aus als gesunde (UNGEMACH 1985).
1.1 Begriffsbestimmungen
1.1.1 Doping
Das Wort „Doping“ erschien zum ersten Mal im Jahr 1899 in einem englischen Wörterbuch im Zusammenhang mit dem Gebrauch von Opium und anderen Narkotika bei Pferden. Es gibt unterschiedliche Angaben zur Herkunft des Wortes. DEBACKERE (1989) beschreibt, dass es von dem niederländischen Wort „doop“ stammt, womit „tauchen“ bzw „eintauchen“ gemeint ist. In Amerika wurde damit umgangssprachlich eine Unsitte bezeichnet, mit Drogen versetzten Tabak anzubieten, um Personen auszurauben. Laut BERNSCHNEIDER und RICHTER (1980) rührt das Wort ursprünglich aus der Bantu-Sprache (DOP) und bezeichnet einen hochprozentigen dickflüssigen Saft, der von den Bantus als Stimulans bei religiösen Riten benutzt wurde.
Nach zahlreichen Versuchen, eine eindeutige Definition des Begriffs „Doping“ zu finden, wurde im Jahr 1977 auf einer internationalen Konferenz der westlichen Pferdesportverbände in Rom beschlossen, dass „alle Substanzen äußeren Ursprungs, auch wenn sie im Pferd natürlicherweise vorkommen können, verboten sind, wenn sie zu den in einer Dopingliste veröffentlichten unerlaubten Mitteln zu rechnen sind“. Diese Entscheidung dient bis heute vielen internationalen und nationalen Pferdesportverbänden als Grundlage ihrer Dopingbestimmungen im Galopprennsport, Reit- und Fahrsport.
Die Dopinglisten beinhalten nahezu alle Gruppen pharmakologisch wirksamer Substanzen.
Für einige gelten Ausnahmen, für andere sind Grenzwerte festgelegt (s. Tab. 2).
Das bedeutet, dass jedwede Anwendung von Arzneimitteln, auch eine medizinisch gerechtfertigte, im Zusammenhang mit der Teilnahme an einer Leistungsprüfung außer in den genannten Ausnahmen verboten ist (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999).
1.1.2 Doping auf Sieg
Diese Form des Dopings zielt darauf ab, die natürliche Leistungsfähigkeit zu erhöhen. Es wird zwischen einer akuten Verabreichung direkt vor dem Rennen und einer chronischen Form des Dopings mit Langzeitverabreichung unterschieden.
Im Fall der akuten Form des Dopings auf Sieg sind die am häufigsten eingesetzten Arzneimittel psychomotorische Stimulantien, die erregend auf das Zentralnervensystem wirken. Sie zielen darauf ab, physiologische psychische und physische Barrieren, wie z.B.
Ermüdung und Schmerz, zu durchbrechen oder Konzentration und Leistungsfähigkeit zu erhöhen. Hierzu gehören beispielsweise Phenylalkylamine (wie Amphetamin) und Methylxanthine (wie Coffein).
Bei der chronischen Form des Dopings auf Sieg, werden über einen längeren Zeitraum z.B.
Anabolika oder Hormone verabreicht. Diese Substanzen führen zu einer Muskulaturzunahme, Verstärkung des Skeletts und erhöhter Erythropoese.
Eine dritte Form ist die „paradoxe“ Form des Dopings auf Sieg. Hierbei kommen kleine Dosen Sedativa (wie z.B. Phenothiazine) für nervöse, übererregbare Pferde zum Einsatz (UNGEMACH 1985).
1.1.3 Doping auf Niederlage
Der Einsatz von Neuroleptika oder Tranquilizern führt zu einer psychomotorischen Antriebshemmung und damit zum Leistungsabfall. Die Anwendung dieser Mittel wird am ehesten von Außenstehenden, z.B. Konkurrenten, vermutet und wird deshalb auch als
„Outside Job“ bezeichnet (BERNSCHNEIDER und RICHTER 1980, UNGEMACH 1985).
1.1.4 Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit
In diese Kategorie fallen vor allem nichtsteroidale Antiphlogistika, Glucocorticoide und Lokalanästhetika, aber auch andere therapeutische Maßnahmen, die das Ziel haben, die natürliche Leistungsfähigkeit eines Pferdes wiederherzustellen (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999, DEBACKERE 1989). Entsprechend der Dopingdefinition ist zum Zeitpunkt einer Leistungsprüfung die aktuelle Leistungsfähigkeit des Pferdes relevant. Der Einsatz der oben genannten Arzneimittel täuscht jedoch ein Leistungsstand des Tieres vor, den es zum Zeitpunkt des Rennens aufgrund einer körperlichen Beeinträchtigung nicht hat.
Dies ist ein vor allem tierschutzrechtlich wichtiger Aspekt.
1.1.5 Doping mit körpereigenen Substanzen
Die Verabreichung von Eigenblut vor dem Wettkampf sowie die parenterale Gabe von Elektrolyten, Hydrogencarbonat, Glucose und Vitaminen, die normalerweise in ausreichender Menge mit der Nahrung aufgenommen werden, ist ebenfalls verboten.
1.1.6 Unabsichtliches Doping
Für diese Form ungewollten Dopings gibt es mehrere Ursachen:
Unkenntnis über die Ausscheidungszeiten von Arzneimitteln
Aufgrund des bezüglich der Dopingproblematik eingangs erwähnten noch unzureichenden Kenntnisstandes über die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik verschiedener Arzneimittel beim Pferd, ist es nicht möglich, genaue Fristen festzulegen, innerhalb derer ein Medikament vor einer Leistungsprüfung abgesetzt werden muss, damit es zum Zeitpunkt der Prüfung unwirksam und nicht mehr nachweisbar ist (UNGEMACH 1989).
Unkenntnis der gesamten Wirkungsbreite eines Arzneimittels
Manche Arzneimittel haben neben einer unverdächtigen Hauptwirkung eine dopingrelevante Nebenwirkung. Die Dopingbestimmungen beziehen sich aber auf alle Wirkungen eines Medikaments. Ein Beispiel sind verschiedene klassische Antihistaminika; sie wirken im therapeutischen Dosisbereich unter anderem zentral dämpfend (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999).
Entstehung dopingrelevanter Substanzen durch Metabolisierung bzw.
Kombinationspräparate
Beispielsweise sind viele positive Dopingbefunde von Procain auf die Anwendung von Procain-Penicillin zurückzuführen. Das Lokalanästhetikum wird in dieser Arzneiform über einen viel längeren Zeitraum ausgeschieden als das Monopräparat (HARKINS et al. 1996).
Perkutane Resorption verbotener Substanzen nach lokaler Applikation
Die Resorption von Substanzen in Salben oder Gels durch die Haut kann zu messbaren Konzentrationen im Blut führen. Ein Beispiel sind Kampfer und Dimethylsulfoxid (DMSO), denen auch eine stimulierende bzw. analgetische Wirkungskomponente zugeschrieben wird (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999).
Pharmakologische Hilfsstoffe
Diese sind nach den arzneimittelrechtlichen Vorschriften nicht immer vollständig deklariert, so dass aus der Arzneimittelkennzeichnung nicht immer zu ersehen ist, ob eine Substanz, wie z.B. DMSO, enthalten ist (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999).
1.1.7 Physikalisches Doping
Hierunter fallen Maßnahmen, die nicht durch Verabreichung chemischer Substanzen zu einer Leistungsbeeinflussung führen. Beispiele hierfür sind Neurektomie, Tracheotomie, Anbringung spitzer Gegenstände an Sattel, Peitsche, Reitstiefel, elektrische Reize usw.
(UNGEMACH 1985).
1.2 Grundlagen der Dopingbestimmungen
Die Dopingbestimmungen im Pferdesport dienen vor allem dazu, dem Tier bzw. dem Tierschutz gerecht zu werden. Die gesetzliche Grundlage hierzu findet sich in §3 des Tierschutzgesetzes vom August 2002. Im Gegensatz dazu basiert das Dopingverbot im Humansport auf dem Arzneimittelgesetz (AMG §6a).
Nach §3 Absatz 1 des Tierschutzgesetzes ist es verboten, einem Tier, außer in Notfällen, Leistungen abzuverlangen, denen es wegen seines Zustandes offensichtlich nicht gewachsen
ist [...]. Absatz 1a verbietet es einem Tier Leistungen abzuverlangen, wenn an ihm Eingriffe und Behandlungen vorgenommen worden sind, die einen leistungsmindernden körperlichen Zustand verdecken. Absatz 1b besagt, dass die Anwendung von Dopingmitteln verboten ist.
Bei Doping kann es sich im Einzelfall auch nach §17 des Tierschutzgesetzes, nach §263 des Strafgesetzbuches (Betrug) und nach §95 des Arzneimittelgesetzes um eine strafbare Handlung handeln. Als Straftat gilt nach §17 2b des Tierschutzgesetzes, wenn einem Wirbeltier länger anhaltende oder sich wiederholende Schmerzen, Leiden oder Schäden zugefügt werden. Dies kann nach IRVINE (1990) und UNGEMACH (1988) beispielsweise der Fall sein, wenn sich der Krankheitszustand eines unter Schmerzmedikamenten stehenden Pferdes durch die Belastung verschlimmert bzw. irreversible Schäden entstehen. Nach §95 Absatz 2a des Arzneimittelgesetzes wird mit einer Freiheitsstrafe bis zu drei Jahren bestraft, wer Arzneimittel zu Dopingzwecken am Menschen in den Verkehr bringt, verschreibt oder anwendet.
Weiteres Ziel des Dopingverbotes ist es, faire Wettkämpfe zu gewährleisten, eine von gedopten, leichter außer Kontrolle geratenden Tieren ausgehende Gefährdung zu verhindern, eine falsche Zuchtauslese zu vermeiden und auch den Schutz vor Täuschung des zahlenden und wettenden Publikums zu sichern (UNGEMACH 1985, PICK 1993).
1.3 Dopingbestimmungen der Pferdesportverbände
1.3.1 Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI)
Laut Bestimmungen der Internationalen Reiterlichen Vereinigung sollen „bei FEI- Wettkämpfen die Talente von Pferden und Reitern unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten verglichen werden. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung beeinflussen oder das Vorliegen eines Gesundheitsproblems überdecken und damit das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen“. Daher ist die Liste der verbotenen Substanzen so zusammengesstellt, dass sie alle Kategorien pharmakologischer Wirksamkeit umfasst. Eine verbotene Substanz gilt nach den Dopingbestimmungen als nachgewiesen, wenn die Substanz selbst, ihre Metaboliten, ihre Isomere oder die Isomere der Metaboliten identifiziert wurden. Wenn ein Beweis dafür vorliegt, dass eine verbotene Substanz
verabreicht wurde, gilt diese als nachgewiesen. Die FEI macht Ausnahmen für Ranitidin und Omeprazol, deren Anwendung nach den Dopingbestimmungen erlaubt ist, und legt für einige Arzneimittel Grenzwerte fest.
1.3.2 Deutsche Reiterliche Vereinigung (FN)
In §67a der Leistungsprüfungsordnung (LPO) sind Dopingsubstanzen, verbotene Arzneimittel und Substanzen, für die Ausnahmen gelten, aufgeführt (Tab.2). In den Durchführungsbestimmungen des §65 ist die Vorgehensweise bei Medikationskontrollen geregelt.
1.3.3 Hauptverband für Traber-Zucht und – Rennen e.V. (HVT)
Nach §93 Absatz 1 der Satzungen und Ordnungen des HVT darf ein Pferd in seinen Geweben, seinen Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen in der Zeit zwischen dem Beginn der Rennveranstaltung und dem Ende des Rennens, an dem das Pferd teilgenommen hat [...] keine gemäß der Dopingliste verbotene Substanz aufweisen [...]. In Absatz 1 der Durchführungsbestimmungen ist die Liste der verbotenen Substanzen aufgeführt. Sie ist in ihren Grundzügen der Liste der LPO vergleichbar, enthält aber keine Ausnahmen. Absatz 2 verbietet weiterhin Injektionen oder Infusionen innerhalb von 72 Stunden vor Beginn eines Rennens.
1.3.4 Direktorium für Vollblutzucht und Rennen (DIR)
Die Rennordnung des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen vom Dezember 1999 unterscheidet in Kapitel XIV 2 zwischen erlaubten und unerlaubten Mitteln. Eine Liste 1 des
§539 enthält erlaubte Mittel (Impfungen). Die Liste 2 beinhaltet Substanzen mit Grenzwerten und Liste 3 kontrolliert erlaubte Substanzen (anti-infektiöse Substanzen). Liste 4 und 5 des
§540 und §541 weisen die unerlaubten Mittel auf. Unter anderem verbietet §541 Nervenschnitte an Gliedmaßen und das Mitführen oder Anwenden technischer Mittel im Rennen. Weiterhin wird in §535 geregelt, dass auch bei einem im Training befindlichen Pferd kein unerlaubtes Mittel nachgewiesen werden darf, soweit es nicht von einem Tierarzt aus therapeutischen Gründen angewendet wurde. Verantwortlich dafür, dass ein Pferd nicht unter dem Einfluss eines unerlaubten Mittels steht, ist nach §534 der Trainer.
Tab. 2: Liste kontrollierter Substanzen gemäß § 67a der LPO 1. Dopingsubstanzen
sind Substanzen, die geeignet sind, die Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Das sind: Stimulantia
Sedativa und Narkotika Anabolika
Diuretika
Peptidhormone und Analoga
Grenzwerte gelten für: Testosteron Nandrolon Theobromin Cortisol
Außerdem gilt die Verabreichung von Vollblut und/oder Zubereitungen, die rote Blutkörperchen enthalten, sowie jede Manipulation einer Probe als Doping.
2. Verbotene Arzneimittel
sind Substanzen, die als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind, und zwar solche, die auf das Nerven-, Herz-Kreislauf-, Atmungs-, Verdauungs-, Harn-, Muskel- und Skelettsystem, auf die Geschlechtsorgane, die Haut und gegen Infektionserreger wirken.
Grenzwerte gelten für Salizylsäure, Arsen, Dimethylsulfoxid und verfügbares CO2.
3. Ausnahmen
Erlaubt ist die Anwendung von Impfstoffen bis spätestens 14 Tage vor Beginn der Pferdeleistungsschau, Substanzen zur Bekämpfung von Endoparasiten, Paramunitäts- Inducern, externen Desinfektionsmitteln und Insektenschutzmitteln. Dies trifft auf Substanzen zu, die in Deutschland für Pferde/Ponys zugelassen sind.
2 Pharmakokinetische Grundprinzipien
Die Pharmakokinetik beschäftigt sich als Teilgebiet der Pharmakologie mit den Konzentrationsprofilen, die nach Gabe eines Arzneimittels im Körper zu erwarten sind (DERENDORF et al. 2002). Die Konzentration eines Arzneistoffs im Körper ändert sich nach seiner Applikation als Funktion der Zeit und wird von folgenden Faktoren beeinflusst:
Freisetzung des Medikaments aus der Arzneiform (Liberation), Absorption (Resorption), Verteilung im Organismus (Distribution), Metabolisierung (Biotransformation) und Elimination (KOCH und RITSCHEL 1986). Diese Vorgänge im Organismus werden durch pharmokokinetische Parameter, wie z.B. Bioverfügbarkeit, Verteilungsvolumen, Clearance und Halbwertszeit beschrieben (FICHTL 2001).
Um den zeitlichen Verlauf der Konzentration eines Pharmakons im Plasma, Blut und Urin darzustellen, wurden Modelle entwickelt, die die komplexen Verteilungs- und Eliminationsvorgänge im Körper mathematisch beschreiben (DYKE und SAMS 1994). Diese Modelle unterteilen den Organismus in Verteilungsräume (Kompartimente). Als Kompartiment wird ein Raum bezeichnet, für den eine gleichmäßige Verteilung postuliert wird, z.B. Blutplasma, Magen-Darm-Trakt oder bestimmte Gewebe (DOST 1968).
Im Ein-Kompartiment-Modell verteilt sich eine Substanz nach intravenöser Applikation hypothetisch im Körper als einem einzigen zentralen Kompartiment. Bei Elimination nach einer Kinetik erster Ordnung gehorcht die Konzentration C folgender Funktion:
t k
0 e e
C
C= ⋅ − ⋅ [1] ln C=ln C0−ke⋅t [2]
C0 = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt 0, unmittelbar nach der Injektion ke = Eliminationskonstante
t = Zeit
Die graphische Darstellung von Gleichung [1] ergibt eine Exponentialkurve (s. Abb. 1 (a)).
Durch Logarithmieren kann sie in die Form einer Geradengleichung überführt werden (Gleichung [2], Abb. 1 (b)).
a.) linear
t C
Abb. 1: Lineare (a) und halblogarithmische (b) Darstellung der Plasmakonzentration (C) als Funktion der Zeit (t) im Ein-Kompartiment-Modell
Die Eliminationskonstante entspricht der Steigung der Geraden der logarithmischen Funktion und dient der Ermittlung der Halbwertszeit.
Die Halbwertszeit ist die Zeitspanne, in der eine Konzentration auf die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes abfällt (DERENDORF et al. 2002). Sie ist abhängig von der Elimination und der Verteilung eines Pharmakons.
Es gilt folgende Beziehung:
e
1/2 k
t =ln2
t1/2 = Halbwertszeit
ke = Eliminationskonstante
Die Halbwertszeit ist in der Pharmakokinetik ein wichtiger Parameter, der vor allem zur Berechnung von Dosierungsintervallen genutzt wird. Zum anderen kann man mit Hilfe der Halbwertszeit ungefähr vorhersagen, wann ein Medikament abgesetzt werden muss, um es bei einem Wettkampf nicht mehr nachweisen zu können. Es gilt allgemein, dass eine Substanz ca.
fünf Halbwertszeiten benötigt, um zu etwa 97 % ausgeschiedenen zu sein (KAMERLING und OWENS 1994). Die Zeit, bis zur vollständigen Ausscheidung einer Substanz, d.h. bis das letzte Arzneimittelmolekül eliminiert ist, hängt von der Anzahl der applizierten Moleküle ab
b.) logarithmisch
t ln C
[3]
und wird mit etwa 66-77 Halbwertszeiten veranschlagt (TOBIN 1986, TOBIN et al. 1982).
Das Zwei-Kompartiment-Modell beschreibt die Kinetik der meisten Therapeutika laut BAGGOT (1978) am besten. Hierbei wird angenommen, dass sich der Arzneistoff nach der Applikation zunächst homogen in einem zentralen Kompartiment, womit in der Regel das Plasma und gut durchblutete Organe, wie Leber, Niere, Lunge gemeint sind, verteilt. Aus diesem zentralen Kompartiment wird die Substanz in schlechter durchblutete Gewebe (z.B.
Muskulatur oder Haut), das sogenannte periphere Kompartiment, transferiert. Die Elimination findet ausschließlich über das zentrale Kompartiment statt. Im Zwei-Kompartiment-Modell zeigt die Konzentrationszeitkurve einen biexponentiellen Verlauf (s. Abb. 2), wobei die erste Phase als Verteilungsphase (α), die zweite als Eliminationsphase (ß) bezeichnet wird.
Gleichung [4] und Abbildung 2 beschreiben die Arzneistoffkonzentration (C) im Zwei- Kompartiment-Modell als Funktion der Zeit:
t e β t B e α A
C= ⋅ − ⋅ + ⋅ − ⋅ [4]
t ln C
Aus der Eliminationskonstanten ß errechnet sich mit Hilfe von Gleichung [3] die terminale Halbwertszeit. Extrapolation der durch ß beschriebenen Geraden auf die y-Achse ergibt die Konzentration B einer Substanz nach Erreichen des Verteilungsgleichgewichtes. Die in Abbildung 2 dargestellte Gerade mit der Steigung α und dem Schnittpunkt A auf der y-Achse beschreibt die initiale Phase der Verteilung und beginnenden Ausscheidung. Addition der Konzentrationen A und B ergibt die fiktive Anfangskonzentration C0.
A ß α
B
Abb.2: Halblogarithmische Darstellung der Plasmakonzentration (C) als Funktion der Zeit (t) im Zwei-Kompartiment-Modell
Neben dem Zwei-Kompartiment-Modell gibt es weiterhin Mehr-Kompartiment-Modelle, je nachdem, in wievielen Verteilungsräumen sich eine Substanz anreichert. DERENDORF et al.
(2002) beschreiben beispielsweise ein Drei-Kompartiment-Modell, in dem ein sogenanntes
„flaches“ Kompartiment schnell im Verteilungsgleichgewicht mit dem zentralen Kompartiment steht, während die Verteilung und Rückverteilung in ein „tiefes“
Kompartiment länger dauert.
Wird ein Arzneimittel extravasal (z.B. p.o., i.m., s.c.) verabreicht, muss bei der Berechnung der Konzentrationen noch die Resorption berücksichtigt werden. So ergibt sich für die Plasmakonzentration (C) bei Resorption gemäß Kinetik 1. Ordnung als Funktion der Zeit die sogenannte Bateman-Funktion (FICHTL 2001):
) e ) (e
k (k V
k
C D k t k t
e a d
a ⋅ − e⋅ − − a⋅
−
⋅
= ⋅
[5]
C = Konzentration zum Zeitpunkt t D = gegebene Dosis
Vd = Verteilungsvolumen ka = Resorptionskonstante ke = Eliminationskonstante
Die „Resorptionsrate“ einer extravasal verabreichten Substanz bestimmt neben anderen Faktoren die Bioverfügbarkeit.
DERENDORF et al. (2002) beschreiben als Bioverfügbarkeit „das Ausmaß und die Geschwindigkeit, mit der der therapeutisch wirksame Bestandteil eines Arzneistoffs in den systemischen Kreislauf gelangt“. Die Bioverfügbarkeit nach intravenöser Applikation wird mit 100 % angenommen. Die Resorption nicht intravenös verabreichter Medikamente (p.o., s.c., i.m.,i.p. usw.), wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst, so dass der den systemischen Kreislauf erreichende Anteil in der Regel geringer ist. Das Ausmaß der Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt wird z.B. bestimmt von der Dosis des Medikaments, seinen
physikalischen-chemischen Eigenschaften (Ionisierungszustand, Lipophilie), der intestinalen Durchblutung, der Größe der Resorptionsoberfläche, der Zerstörung durch Darmenzyme oder der Interaktion mit anderen Arzneimitteln (BENET et al. 1996). Aus dem Darm gelangen Substanzen über die Pfortader zuerst in die Leber, wo sie eventuell metabolisiert werden (hepatischer „First-Pass-Effekt“). Einige Substanzen werden anschließend in die Galle und so mit den Faeces ausgeschieden. Manche Substanzen unterliegen dem sogenannten enterohepatischen Kreislauf. Das bedeutet, dass der mit der Galle in den Darm ausgeschiedene metabolisierte Arzneistoff, von Darmenzymen (z.B. ß-Glucuronidase) in seine ursprüngliche Form verwandelt und daraufhin erneut resorbiert wird (BENET et al.
1996). Bei einigen Medikamenten erreicht der „First-Pass-Effekt“ ein Ausmaß, dass die Substanzen in der Leber bei erster Passage vollständig inaktiviert werden (SAMS 1996).
Zur Berechnung der Bioverfügbarkeit (F) wird die Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (area under the curve, AUC) verwendet. Der Quotient
AUC 100 D
AUC F% D
iv niv
niv
iv ⋅
⋅
= ⋅
[6]
D = Dosis iv = intravenös niv = nicht-intravenös
beschreibt schließlich in Verbindung mit der errechneten maximalen Konzentration (Cmax) und der Zeit (tmax) bis zum Erreichen dieser Konzentration die Bioverfügbarkeit.
Über die Verteilung eines Pharmakons im Körper gibt das Verteilungsvolumen (Vd) Aufschluss. Es gilt als Proportionalitätsfaktor zwischen der im Organismus vorhandenen Menge eines Arzneistoffs (X) und seiner Plasmakonzentration (C) (FICHTL 2001).
C Vd=X
[7]
BAGGOT (1978) beschreibt das Verteilungsvolumen als einen pharmakokinetischen Term, der dazu genutzt wird, die Dosis zu berechnen, die benötigt wird, um eine gewünschte Plasmakonzentration zu erhalten. Es ist ein Maß für die Gewebegängigkeit eines Arzneimittels und nach intravenöser Applikation initial gering, da sich die gesamte Arzneimittelmenge in der Blutbahn befindet. Mit der anschließenden Verteilung der Substanz in die Körpergewebe vergrößert sich das Verteilungsvolumen. Ist es gleich dem Volumen des Gesamtkörperwassers, bedeutet das, dass die Substanz intra- und extrazellulär verteilt wird.
Arzneimittel, die eine hohe Plasmaproteinbindung eingehen, haben ein geringes Verteilungsvolumen, das nicht wesentlich größer ist als das Plasmavolumen (SAMS 1996).
Als Maß zur Ermittlung der Ausscheidungsgeschwindigkeit eines Arzneistoffs dient die Clearance (DERENDORF et al 2002). Sie kann mit folgender Gleichung beschrieben werden:
C dE/dt Cl=
[8]
Cl = Clearance
dE/dt = ausgeschiedene Arzneistoffmenge pro Zeit C = Arzneistoffkonzentration
Da mehrere Organe an der Elimination eines Arzneistoffs beteiligt sind, setzt sich die Gesamtclearance (ClT) aus der Summe einzelner Organclearances zusammen (SAMS 1992):
ClT = ClH + ClR + Clandere [9]
ClH = hepatische Clearance ClR = renale Clearance
Hauptausscheidungsorgane sind Niere und Leber. Die renale Elimination erfolgt durch glomeruläre Filtration, tubuläre Sekretion und tubuläre Rückresorption. Da das Ausmaß der renalen Elimination von der Durchblutung der Nieren und dem Harn pH-Wert abhängt, ist sie
teilweise erheblichen Schwankungen unterworfen. So werden beispielsweise schwache Säuren (wie z.B. Phenylbutazon) durch den Abfall des Harn pH-Wertes, wie es nach einem Wettkampf beobachtet wird, verstärkt tubulär rückresorbiert, was eine längere Ausscheidungszeit einer Substanz zur Folge haben kann (KAMERLING und OWENS 1994).
Die hepatische Clearance setzt sich aus Metabolismus und Sekretion der Substanzen in die Gallenblase zusammen. Sie kann nicht direkt gemessen werden, sondern wird aus der Differenz der totalen und renalen Clearance errechnet (SAMS 1996). In sogenannten Phase-I- Reaktionen werden die Arzneistoffe enzymatisch verändert (oxidiert, reduziert oder hydrolytisch gespalten) und in der Phase-II-Reaktion an hydrophile Gruppen (z.B.
Glucuronsäure u.a.) gekoppelt. Diese Kopplungsprodukte werden aufgrund ihrer hohen Wasserlöslichkeit schneller ausgeschieden (FREY 1996). Andere Wege der Elimination (Clandere), beispielsweise über Speichel, Schweiß und Tränen sind nach BENET et al. (1996) zumeist quantitativ vernachlässigbar.
Um über einen bestimmten Zeitraum einen gewissen Wirkspiegel aufrecht zu erhalten, ist bei vielen Arzneimitteln die mehrmalige Applikation erforderlich. Zur Festlegung des Dosierungsintervalls ist die Kenntnis der Verteilung und Ausscheidung wichtig. Die Einhaltung von etwa zwei Halbwertszeiten zwischen zwei Applikationen gilt in vielen Fällen als sinnvoll (KIETZMANN 1983). Die Arzneistoffkonzentration fluktuiert nach Mehrfachapplikation zwischen einem Maximum und einem Minimum (s. Abb. 3). Ein Gleichgewichtszustand (Steady-State) ist ereicht, wenn die Erhaltungsdosis die Menge ersetzt, die innerhalb eines Dosierungsintervalls eliminiert wird (BAGGOT 1978).
0 5 10 15 20
0 50 100
t C
Abb. 3: Verlauf der Arzneistoffkonzentration (C) nach mehrmaliger Applikation
3 Analytik
3.1 Allgemeiner Überblick
Um Substanzen in biologischen Flüssigkeiten wie Blut und Urin zu identifizieren und quantifizieren, müssen sie zunächst von anderen Substanzen, die sich ebenfalls in diesen Matrices befinden, getrennt werden. Diese Trennung erreicht man mittels Chromatographie.
Bei der Chromatographie werden Stoffgemische über zwei nicht miteinander mischbare Phasen, von denen sich eine (mobile Phase) an der anderen (stationäre Phase) vorbeibewegt, verteilt (SCHWEDT 1986). Aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften kommt es zu einer ständigen Adsorption (Oberflächenanhaftung) an und Desorption (Ablösung) von der stationären Phase mit Weitertransport durch die mobile Phase. Die Trennung der Substanzen erfolgt aufgrund ihrer unterschiedlichen Verweilzeiten (Retentionszeiten) in dem chromatographischen System (GOTTWALD 1996). Man unterscheidet Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Säulen-Flüssigkeits-Chromatographie und Gaschromatographie (s.Tab.3) (SCHWEDT 1986).
DYKE und SAMS (1994) stellten heraus, dass die in der Dopinganalytik am häufigsten angewandten Verfahren chromatographische sind. Die Gaschromatographie wird in Kombination mit der Massenspektrometrie (GC/MS) eingesetzt, um ein Ergebnis zu bestätigen. Da die Analytik in dieser Arbeit mittels Gaschromatographie erfolgt, soll auf dieses Verfahren näher eingegangen werden.
Tab. 3: Chromatographische Methoden, Verfahren und Techniken (nach SCHWEDT 1986) 1. Papierchromatographie
2. Dünnschichtchromatographie (DC)
einschließlich Hochleistungs-DC (engl. HPTLC: high performance thin-layer chromatography) als:
Verteilungs- Adsorptions-, Gel- oder Ionenaustausch-Chromatographie auf Schichten
3. Säulen-Flüssigkeits-Chromatographie (LC)
einschließlich HPLC: Hochdruck- oder Hochleistungs(high-performance)- Flüssigkeits- Chromatographie als:
Verteilungs-Chromatographie Adsorptions-Chromatographie Ionen-Chromatographie
Ionenaustausch-Chromatographie Ionenpaar-Chromatographie Reversed-phase-Chromatographie Gelpermeations-Chromatographie Bioaffinitäts-Chromatographie
4. Gas-Chromatographie (GC) einschließlich Kapillare-GC als:
Adsorptions-GC Verteilungs-GC
3.2 Gaschromatographie
Bei der Gaschromatographie muss das zu trennende Stoffgemisch gasförmig vorliegen und als mobile Phase dient strömendes Gas (Trägergas, z.B. Helium, Wasserstoff, Stickstoff). Die stationäre Phase ist entweder eine Flüssigkeit (Gasverteilungschromatographie) oder ein Feststoff (Gasadsorptionschromatographie). Sie befindet sich an der Innenseite der Trennsäule, die aus Kupfer, Stahl, Glas bzw. Quarz besteht (GOTTWALD 1995).
Das zu trennende Substanzgemisch wird durch den Probeneinlass in das System injiziert, verdampft und mittels des Trägergases in die Säule verbracht. Bei der Gasverteilungschromatographie kommt es zu einer Verteilung der Substanzen zwischen der stationären und mobilen Phase. Es findet substanzspezifisch ein dynamischer Prozess von Adsorption und Desorption statt. Die Substanzen verlassen die Säule zeitlich getrennt und werden von einem nachgeschalteten Detektor (s. 3.2.4) registriert.
3.2.1 Die Trennsäule
Man unterscheidet zwischen „gepackten“ Säulen und Kapillarsäulen. Die „gepackte“ Säule enthält auf ihrer Innenseite eine Trägersubstanz (z.B. Kieselgur, Tonerde, Celite, Glasperlen).
Auf diesen Trägerstoff ist die eigentliche stationäre Phase aufgezogen, die aus Materialien, wie z.B. Paraffin, Siliconöl, Wachs, polymere Ether und Ester besteht (NEUMÜLLER 1981).
„Gepackte“ Säulen sind etwa 1-6 m lang und haben einen Durchmesser von 3-8 mm.
Kapillarsäulen unterteilt man in Filmkapillarsäulen (WCOT-Säulen, Wall Coated Open Tubular) und Schichtkapillarsäulen (PLOT, Porous Layer Open Tubular). Bei den Filmkapillarsäulen liegt die stationäre Phase als Film direkt der Innenwandung der Säule an.
Sie bestehen meistens aus Quarzglas- oder Alkaliglasröhren, sind 25-60 m lang und haben einen Innendurchmesser von 100-750 µm. Als stationäre Phase der Filmkapillarsäule werden unpolare bis polare Siliconderivate (Polysiloxane), unpolare, hochmolekulare Kohlenwasserstoffe und hochpolare Polyether verwendet (GOTTWALD 1995).
Die Schichtkapillarsäulen (Dünnschichtsäule, PLOT-Säule) enthalten eine feste Schicht an der Innenwandung ihrer Säule. Für die stationäre Phase werden desaktiviertes Aluminiumoxid, synthetisch hergestellte, poröse Polymere und Molekularsiebe aus Aluminiumsiliciumoxid verwendet. Die Trennleistung der Kapillarsäulen ist deutlich besser als die der „gepackten“ Säulen (GOTTWALD 1995).
3.2.2 Der Injektor
Mittels des Injektors wird das Stoffgemisch in den Trägergasstrom verbracht. Es gibt verschiedene Arten der Injektion.
Bei der Direktinjektion wird die Probe durch ein Septum in den Injektor injiziert, dort sofort verdampft und in die Trennsäule geschleust. Diese Technik ist die älteste und nur geeignet für gepackte Säulen und Kapillarsäulen mit relativ großen Durchmessern, da die gesamte Substanzmenge in die Säule gelangt.
Bei der Splitinjektion wird nur ein Teil der verdampften Probe in die Säule geschleust, der größte Teil wird vor Erreichen der Säule wieder aus dem System entfernt. Dieses ist bei Kapillarsäulen mit geringen Innendurchmesser erforderlich, damit diese nicht überlastet werden. Das Splitverhältnis gibt an, wie viel einer definierten Substanzmenge in die Säule und wie viel aus dem Splitausgang getrieben wird. Das gewählte Splitverhältnis für die Untersuchungen in dieser Arbeit ist beispielsweise 1:6. Das bedeutet bei einer Substanzmenge von 1 µl, dass ca. 0,16 µl in die Säule und ca. 0,83 µl ungenutzt aus dem Splitausgang geschleust werden.
Die Split/Splitlessinjektion ist eine Technik, bei der die Probe hochverdünnt in den Injektor gespritzt wird und am Anfang der Säule zunächst wieder kondensiert, da die Säule ungeheizt ist. Der Splitbetrieb wird erst nach einer bestimmten Zeit aufgenommen. Wird die Ofentemperatur hochgefahren, um die Säule zu heizen, siedet zunächst nur das Lösungsmittel, so dass die eigentliche Probe aufkonzentriert wird. Durch weitere Erhöhung der Ofentemperatur siedet schließlich auch die Probe und wird in die Säule geschleust.
Auch bei der On-Column-Methode ist die Probe sehr stark verdünnt und zwar mit einem Lösungsmittel, dessen Siedepunkt mindestens um 100 Grad niedriger ist, als der der Probe.
Nachdem das Gemisch kalt und in flüssiger Form in den Säulenanfang injiziert wurde, wird die Trennsäule aufgeheizt. Es kommt auch hier zu einer Aufkonzentrierung der Probe, da das Lösungsmittel zuerst verdampft (GOTTWALD 1995).
3.2.3 Der Säulenofen
Die Trennsäule ist in einem Säulenofen aufgehängt. Die Temperatur der Säule kann auf diese Weise variiert werden, was eine Verschiebung der Substanzen, in Abhängigkeit von ihrem Siedepunkt, mehr zur stationären oder zu mobilen Phase bewirkt. Es gibt isotherme Öfen, die nur eine bestimmte Temperatur einhalten und Öfen, bei denen Temperaturprogramme eingestellt werden können. Das Temperaturprogramm beginnt zunächst mit einer niedrigeren Temperatur. Dann erfolgt eine zumeist lineare Aufheizung der Säule, woraufhin die Probenkomponenten in Abhängigkeit ihrer Siedepunkte nacheinander in die Säule wandern (PAUSCHMANN und BAYER 1973).
3.2.4 Detektor
Nachdem die Probenkomponenten die Trennsäule verlassen haben, gelangen sie in einen Detektor, der ein der Menge der betreffenden Komponente proportionales Signal erzeugt. Das Signal wird in Abhängigkeit zur Zeit von einem Schreiber in Form eines „Peaks“
aufgezeichnet. Mit einem so erstellten Chromatogramm kann eine Substanz anhand ihrer Retentionszeit identifiziert werden. Weiterhin lässt sich aus der Höhe oder der Fläche eines Peaks im Vergleich zu der Fläche einer Referenzsubstanz (interner Standard) auf die Menge der Substanz schließen (SCHWEDT 1986). Man unterscheidet konzentrationsabhängige von massenabhängigen Detektoren. Bei ersteren ist das Signal der Konzentration, bei letzteren der Masse proportional. Die gebräuchlichsten Detektoren in der Gaschromatographie sind (GOTTWALD 1995):
- Wärmeleitfähigkeitsdetektoren
- Flammenionisationsdetektoren
- Stickstoff-Phosphor-Detektoren
- Elektroneneinfangdetektoren
- Flammenfotometrische Detektoren
- Fotoionisationsdetektoren
- Massenspektrometer
In dieser Arbeit dient ein dem Gaschromatographen nachgeschaltetes Massenspektrometer zur Detektion.
3.3 Massenspektrometrie (MS)
Die Ankopplung eines Massenspektrometers an einen Gaschromatographen dient der direkten Identifizierung unbekannter Substanzen und lässt aufgrund des substanzspezifischen Fragmentierungsmusters Rückschlüsse auf ihre Strukturformel zu.
Nach der Trennung der Substanzen im Gaschromatographen, werden sie im Massenspektrometer ionisiert und fragmentiert. Die Ionisation erfolgt in einem Vakuum mittels Elektronenstoßionisation, chemischer Ionisation, Oberflächenionisation oder Sprayverfahren (BUDZIKIEWICZ 1998). Bei der Elektronenstoßionisation beispielsweise wird die zu untersuchende Substanz mit Elektronen beschossen. Dadurch kommt es zur Abspaltung oder Aufnahme eines Elektrons aus bzw. in das Probenmolekül. In der Regel entstehen positiv geladene Molekülionen durch Abspaltung eines Elektrons. Diese Ionen können daraufhin noch in weitere Fragmente zerfallen. Unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Die entstandenen Molekülionen werden anschließend nach Masse und Ladung getrennt. Dazu werden sie zunächst in einem elektrischen Feld beschleunigt. Senkrecht zu diesem elektrischen Feld befinden sich Magnetfelder, durch die die Ionen abgelenkt werden. Je kleiner die Masse und je größer die Ladung des Ions ist, umso größer ist die Ablenkung. Das Ausmaß der Ablenkung wird registriert, indem die Ionen einen Kollektorspalt durchtreten und auf einen Auffänger treffen, an dem sie entladen werden. Die dadurch entstehenden Ströme werden verstärkt und registriert. Das Massenspektrum wird daraufhin in Form eines Strichspektrums aufgezeichnet (s. Abb. 4) (BUBZIKIEWICZ 1998).
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 0
50 100
m/z-->
Intensität
464
73
337
241 595
45 100131 169 215 272298 362392424 492522 567
Abb. 4: Beispiel für ein Massenspektrum (Dembrexin tris-TMS)
Man kann entweder das vollständige Massenspektrum oder nur ein Ion aufzeichnen. Das gesamte Massenspektrum gibt alle Ionen mit ihren relativen Intensitäten an (s. Abb. 4). Das intensivste Ion kann dabei in der Regel gleich 100 gesetzt werden, so dass die übrigen Intensitäten in % davon angegeben werden. Die Registrierung nur eines Ions wird als „single ion detection“ (SID) oder „single ion monitoring“ (SIM) bezeichnet und wird angewendet, wenn man weiß, nach welcher Verbindung gesucht wird. Wie unter 3.2.4 erwähnt, wurde in der vorliegenden Arbeit GC/MS verwendet, wobei das Massenspektrometer als Detektor dient. Dieser Detektor zeichnet neben dem Massenspektrum auch das Intensitäts/Zeit- Chromatogramm auf.
4 Pathophysiologie der Atemwegserkrankungen beim Pferd
Da Dembrexin zur Behandlung von Atemwegserkrankungen beim Pferd eingesetzt wird, soll an dieser Stelle auf den physiologischen Zustand des Atmungstraktes und die Veränderungen bei der chronisch obstruktiven Bronchitis, einem wichtigen Indikationsgebiet der Substanz, eingegangen werden.
4.1 Physiologie des Atmungstraktes
Die primäre Funktion der Lunge ist die Aufnahme von Sauerstoff aus der Luft und die Ausscheidung von Kohlendioxid. Der Gasaustausch findet in dem respiratorischen System der Lunge, den Alveolen statt, während das luftleitende System (Nasenhöhle, Schlund, Kehlkopf, Luftröhre, Bronchien) dem Transport der Gase dient. Die Blut-Luft-Schranke, Ort des Gasaustausches, wird von dem Epithel der Alveolarwand und dem Endothel der anliegenden Blutgefäße gebildet (LIEBICH 1993).
Da neben Sauerstoff und Kohlendioxid mit der Außenluft auch Fremdstoffe in die Lunge gelangen können, ist diese mit zahlreichen Abwehrsystemen ausgestattet. Von größter Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die mukoziliäre Clearance. Ein sich auf der Oberfläche der luftleitenden Wege befindendes Flimmerepithel befördert mit einem oralwärts gerichteten Zilienschlag Fremdsubstanzen aus den Atemwegen. Der von den sogenannten Becherzellen und seromukösen Drüsen produzierte Schleim verbessert dabei die Haftung der Partikel an den Zilien. Desweiteren befinden sich Makrophagen, die Fremdkörper phagozytieren können, in den Alveolen und das bronchusassoziierte lymphatische System (Lymphozyten und Plasmazellen) in den oberen Luftwegen dient der Infektionsabwehr (SCHEID 1994).
Das Alveolarepithel ist von einer Substanz ausgekleidet, die durch Senkung der Oberflächenspannung, das Kollabieren der Lungenbläschen während der Exspiration verhindert (GÖRLITZ 2002). Diese als Surfactant bezeichnete Substanz besteht zu über 90%
aus Phospholipiden und zu weniger als 10% aus Proteinen. Sie wird in den
Alveolarepithelzellen II gebildet. Als Induktion der Surfactant - Synthese vermutet man einen Feedback-Mechanismus der alveolären Oberflächenspannung (GOERKE 1974).
4.2 Chronisch obstruktive Bronchitis (COB)
Bei dieser Erkrankung handelt es sich ätiologisch um ein multifaktorielles Geschehen. Neben Infektionserregern (Viren, Bakterien, Lungenwürmer), sind allergische Reaktionen (Pilzsporen, Pollen, Milben, Stroh- und Heustaub) und chemisch-physikalische Reize beteiligt (HAMANN 1999). HAJER (1980) geht davon aus, dass zu Beginn der Erkrankung vor allem Viruserreger eine Rolle spielen. Sie schädigen das Flimmerepithel und bilden damit die Wegbereiter für bakterielle Sekundärinfektionen. GERBER (1997) sieht die allergische Komponente als Hauptursache und unterscheidet zwischen einer Reaktion auf innerhalb und außerhalb des Stalles (Pollen) vorkommende Antigene. Letzteres beschreibt er als
„Sommerweide-Dämpfigkeit“.
Klinische Symptome der COB sind Dyspnoe, Husten, Nasenausfluss und verminderte Leistungsbereitschaft, die unterschiedlich stark ausgeprägt sein können. Bei massiver Allergenexposition kann es zu einer akuten Atemnot kommen (GERBER 1997). Die Symptome beruhen auf einer Obstruktion der Atemwege, als Folge von Bronchospasmen, Schleimhautödem und gestörter mukoziliärer Clearance. Die Bronchokonstriktion ist eine vagal induzierte Reaktion auf thermische, mechanische (Staub) und pharmakologische Reize (Histamin, Prostaglandine, Leukotriene u.a.) (ROBINSON 1978). Die Störung der mukoziliären Clearance zeichnet sich in einer Schädigung des Flimmerepithels und der vermehrten Bildung eines zähen Bronchialschleimes ab.
FISCHER und DEEGEN (1980) stellten mittels endoskopischer Untersuchungen bei an chronischer Bronchitis erkrankten Pferden einen Zusammenhang zwischen Schweregrad der Erkrankung und der Menge des Bronchialschleimes fest. Die vermehrte Produktion des Bronchialschleimes ist die Folge einer Hyperplasie der Becherzellen und des Ersatzes der serösen Mukus produzierenden Clarazellen durch schleimproduzierende Becherzellen (DIXON 1992). Ursache der erhöhten Schleimviskosität ist die aus zerstörten Leukozyten und Epithelzellen frei werdende DNA und der Anstieg des Glykoproteinanteils im
Bronchialschleim (DIXON 1992, GARRARD 1991). Eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide des Surfactantsystems von COB-Pferden ist nach JAHN (1984) ebenfalls an der gestörten mukoziliären Clearance beteiligt. Die Folge der Bronchialobstruktion ist die Insuffizienz des Gasaustausches in den Alveolen, was zu einer Sauerstoffunterversorgung des Körpers führt. NYMAN et al. (1994) haben bei einer Untersuchung von acht an chronischer Bronchitis erkrankten Pferden schon im Ruhezustand einen verminderten Sauerstoffpartialdruck festgestellt. Sie ermittelten bei den COB-Pferden im Vergleich zu gesunden Pferden einen höheren Ventilations-Perfusions-Quotienten.
Die Therapie der COB beruht in erster Linie auf einer Optimierung der Haltungsbedingungen (KELLER 1980, MAYER 1980, GERBER 1997, HAMANN 1999). Erkrankte Pferde sollten demnach möglichst in einem Offenstall auf Späne oder Torf gehalten werden und anstatt Heu Grassilage bekommen.
Als Therapeutikum kommt oft das ß2-Mimetikum Clenbuterol zum Einsatz. Neben seiner bronchospasmolytischen Wirkung, erhöht es auch die Flimmeraktivität der Bronchialschleimhaut und fördert so die mukoziliäre Clearance. Aminophyllin wird ebenfalls als Bronchospasmolytikum eingesetzt. Glucocorticosteroide mindern die Schleimhautschwellung und wirken entzündungshemmend. Als Mukolytika kommen Bromhexin und Dembrexin zum Einsatz. Sie sollen die Viskosität des Bronchialschleims senken, womit ein besserer Abfluss gegeben ist. GERBER (1997) bezweifelt die Wirksamkeit dieser Substanzen. DEEGEN et al. (1980) empfehlen eine massive Infusionstherapie bei Patienten, deren Zustand sich auf die oben angegebene Therapie nicht bessert. Die intravenöse Zufuhr von 30 Litern einer isotonischen Natriumchloridlösung an drei aufeinanderfolgenden Tagen führt nach ihren Untersuchungen zu einer vermehrten Sekretolyse. Es ist darauf zu verweisen, dass die COB in der Regel eine unheilbare Krankheit ist und es sich bei der oben angegebenen Therapie nur um symptomatische Maßnahmen handelt (HAMANN 1999).
5 Dembrexin
5.1 Physikalisch-chemische Eigenschaften
Dembrexin (N-A 1523) ist ein Benzylamin mit der chemischen Bezeichnung trans-4-[(3,5- Dibromosalicyl)amino]cyclohexanol. Sein Molekulargewicht beträgt 379,09. Die Strukturformel ist in Abbildung 5 dargestellt.
OH
Br Br
OH
NH
Abb. 5: Strukturformel von Dembrexin
Bei Dembrexinhydrochlorid handelt es sich um ein weißes Pulver mit einem Molekulargewicht von 415,09. Der Hersteller gibt einer Wasserlöslichkeit von 0,5% an.
5.2 Wirkungen und therapeutische Anwendungen
Dembrexin wird zur Behandlung katarrhalischer Entzündungen der Luftwege und akuter, subakuter und chronischer Bronchitiden beim Pferd eingesetzt. Seine Bedeutung liegt vor allem in dem Einsatz bei der chronisch obstruktiven Bronchitis (COB). Als Sputolysin® und in Kombination mit dem ß-Sympathomimetikum Clenbuterol als Venti-Plus® ist Dembrexin zur oralen Anwendung beim Pferd zugelassen. Die Dosierung beträgt zweimal täglich 0,3 mg/kg KM.
UNGEMACH (2003) unterteilt die Expektorantien in Sekretolytika, Mukolytika und Sekretomotorika und ordnet Dembrexin den Sekretolytika zu.
Sekretolytika führen zu vermehrter Bildung eines serösen Sekrets mit verringerter Viskosität und zu einer Zunahme der dünnflüssigen Solphase in den Bronchien (UNGEMACH 2003).
Im Gegensatz dazu beeinflussen Mukolytika nicht die Sekretion in den Bronchien, sondern verringern durch Veränderung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Bronchialschleims seine Viskosität (UNGEMACH 2003). Sekretomotorika steigern die Aktivität des Flimmerepithels und fördern so die mukoziliäre Clearance (UNGEMACH 2003).
Als Wirkungen von Dembrexin gelten eine Steigerung der tracheobronchialen Sekretion, eine Erhöhung der Surfactantproduktion und eine antitussive Wirkung (interner Bericht Boehringer Ingelheim). Da derzeit keine Angaben über die Wirkmechanismen vorliegen, sollen diese anhand der dem Dembrexin strukturell eng verwandten Substanzen Bromhexin und Ambroxol dargestellt werden (s. Abb. 6 und 7).
Br Br
NH2
NH
OH
Br Br
NH2
NH
OH
CH3
Abb: 6: Strukturformel von Ambroxol Abb. 7: Strukturformel von Bromhexin
Vor allem Ambroxol werden die gleichen Wirkungsweisen wie Dembrexin zugesprochen. Es ist ein wirksamer Metabolit von Bromhexin und ist im Gegensatz zu Bromhexin, das unter dem Handelsnamen Bisolvon® zur Anwendung bei Pferd, Rind, Schwein, Hund und Katze zugelassen ist, nur als Humanarzneimittel auf dem Markt (UNGEMACH 2003).
5.2.1 Wirkungen auf die tracheobronchiale Sekretion
Die expektorierende Wirkung von Dembrexin zeigt eine Studie, die an Meerschweinchen durchgeführt wurde. Die Ergebnisse wiesen eine dosisabhängige Steigerung der tracheobronchialen Sekretion auf. Im Vergleich mit Ambroxol und Bromhexin konnte für
Dembrexin eine steilere Dosis-Wirkungs-Beziehung dargestellt werden (interner Bericht Boehringer Ingelheim). Einen Hinweis, in welcher Weise Dembrexin auf den Bronchialschleim wirkt, gibt MATTHEWS (1988). Danach soll Dembrexin mit der Glykosylierung der im Bronchialschleim vorhandenen Glykoproteine interferieren. Die resultierende Veränderung in den Zuckerseitenketten des Glykoproteins führt zu einer Veränderung der viskoelastischen Eigenschaften des Bronchialsekrets, d.h. zu seiner Verflüssigung.
Eine Wirkung von Ambroxol auf die tracheobronchiale Sekretion zeigten IRAVANI und MELVILLE (1974) an Lungenpräparaten von Ratten. Sie konnten eine erhöhte Flimmerbewegung, einen Anstieg der Geschwindigkeit des Schleimtransportes und eine verminderte Schleimviskosität verzeichnen. NEMETSCHEK-GANSLER und SEEFELD (1975) stellten in einem Langzeitversuch mit Ambroxol an Ratten fest, dass der zentrale Angriffspunkt der Substanz die Becherzellen sind. Untersuchungen an Darm- und Bronchialepithel zeigten initial eine Entleerung reifer Becherzellen, mit anschließender Vermehrung unreifer Becherzellen. Die Autoren vermuten, dass dadurch der Mechanismus der Muzinsynthese und -sekretion gestört wird, mit der Folge verminderter Produktion eines viskösen Schleims. In jüngster Zeit konnten für Ambroxol elektrophysiologische Effekte am Atmungsepithel festgestellt werden. So soll Ambroxol über eine Veränderung der Natriumresorption den Ionenfluss durch das Epithel der Luftwege beeinflussen. Die Folge ist eine vermehrte Bereitstellung von Flüssigkeit aus Epithelien und Interstitium, wodurch das Bronchialsekret flüssiger wird (FISCHER 2003).
BÜRGI (1965) konnte in einem Versuch, in dem er von Asthmatikern gewonnenen Bronchialschleim mit Bromhexin inkubierte, innerhalb von zwei Stunden eine vollständige Auflösung der sauren Mukopolysaccharide zeigen. Mukopolysaccharide sind unter anderem Ursache für eine erhöhte Viskosität von Bronchialschleim.
5.2.2 Wirkungen auf das Surfactantsystem
Zahlreiche Untersuchungen befassten sich mit der Ermittlung der Wirkung von Bromhexin und Ambroxol auf das Surfactantsystem der Lunge. Für Dembrexin liegt dagegen nur das
Resultat einer unveröffentlichten Untersuchung von 1973 vor (interner Bericht Boehringer Ingelheim).
Die Beeinflussung der oberflächenaktiven Substanz durch Dembrexin wurde an 20 Ratten untersucht. Um verminderte Surfactant-Level zu induzieren, entzog man den Tieren für 5 Tage das Futter. Nach viertägiger Verabreichung von Dembrexin wurde die Oberflächenspannung in den Lungenspülflüssigkeiten der Ratten bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass es infolge eines Nahrungsentzugs zu einer Erhöhung der Oberflächenspannung kommt. Bei mit Dembrexin behandelten Tieren war eine verringerte Oberflächenspannung zu verzeichnen, die sich von der normal gefütterter Ratten nicht signifikant unterschied. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit Untersuchungsergebnissen über Ambroxol zeigte keinen Unterschied in der Wirkungsstärke beider Substanzen (interner Bericht Boehringer Ingelheim). Ein weiterer Versuch, in dem die Volumendehnbarkeit der Lunge bei Ratten mittels eines Pneumotachographen ermittelt wurde, gab ebenfalls Hinweise auf eine vermehrte Surfactant-Produktion durch Dembrexin. Mit Dembrexin behandelte Tiere wiesen hinsichtlich der Compliance bessere Werte auf als unbehandelte Kontrolltiere (interner Bericht Boehringer Ingelheim).
CURTI (1972) erstellte an den Lungen von zuvor mit Ambroxol bzw. Bromhexin behandelten Albinomäusen Druck-Volumen-Diagramme und beurteilte mittels histochemischer Untersuchungen die Anzahl an Pneumozyten Typ II und deren Gehalt an oberflächenaktiver Substanz. Die Ergebnisse zeigten, dass Ambroxol in der Lage ist, die Produktion des Surfactant in den Alveolen zu steigern. Für Bromhexin konnte dieses jedoch nicht dargestellt werden. BENZER et al. (1969) fanden ebenfalls keinen Hinweis auf die Beeinflussung des Surfactant-Systems durch Bromhexin. Sie verglichen die Oberflächenspannungsverhältnisse in Lungenpräparaten von mit Bromhexin behandelten Menschen mit einer unbehandelten Kontrollgruppe und konnten keine Unterschiede feststellen. Die Autoren sprachen jedoch der Aussagekraft ihrer Untersuchungsmethode gewisse Unsicherheiten zu.
Die Wirkung von Ambroxol auf das oberflächenaktive System untersuchten auch CERUTTI und KAPANCI (1979) an 50 Ratten. Mittels Elektronenmikroskopie ermittelten sie bei
