Untersuchung zur Pharmakokinetik des Stoffes Tetrahydrogestrinon hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Stoffes

Tetrahydrogestrinon hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION

Doktor der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Markus Gerlach

aus Duisburg

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung:

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Deegen Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2005

Tanja & meiner Familie in Liebe und Dankbarkeit

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abb. Abbildung

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation AUC Area under the curve

b1 Geschwindigkeitskonstante der Elimination

C Konzentration

Cl Clearance

Cmax(gem) maximale gemessene Plasmakonzentration

DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen

EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee EPC effektive Plasmakonzentration

FEI Fédération Équestre International

FN Fédération National, Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V., Warendorf

g Gramm

h Stunde

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HQC High Quality Control Standard

HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.

HWZ Halbwertszeit

i. m. intramuskulär

ISTD interner Standard

i.v. intravenös

kg Kilogramm

KM Körpermasse

l Liter

ln natürlicher Logarithmus LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantification

LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Lower Quality Control Standard

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

m Meter

max. maximal

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

mmol Millimol

MM Molekülmasse

MQC Midrange Quality Control Standard

MRT Mean Residence Time, mittlere Verweildauer

MS Massenspektrometrie

m/z Quotient aus Masse und Ladung

ng Nanogramm

p. a. post applikationem

PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch

QC Qualitätskontrolle

R² Regressionskoeffizient

RE relativer Fehler, relative Abweichung

RO Rennordnung des DIR

S Standardabweichung

SIM single ion monitoring

t Zeit

Tab. Tabelle

tmax(gem) Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration

1 EINLEITUNG

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Doping

2.1.1 Definition und Geschichtliches 2 2.1.2 Doping im Pferdesport 2

2.1.2.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände 4 2.1.2.2 Leistungsprüfungsordnung LPO 4 2.1.2.3 Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. [DVR] 6 2.1.2.4 HVT Traberverband 6 2.1.3 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in BRD 7

2.2 Steroidhormone

2.3 Anabolika

2.4 „Designersteroide“

2.4.1 Jüngere Geschichte 9

2.4.2 THG 11

2.4.2.1 Struktur 11 2.4.2.2 Herstellung 12 2.4.2.3 Wirkung THG 13

2.5 Pharmakokinetische Grundprinzipien

2.6 Analytik

3 MATERIAL UND METHODE

3.1

Versuchsplanung

3.2

Versuchstiere

3.3

Vorbereitung des Versuches Versuchsdurchführung

3.3.1 Substanz und Dosierung 26

3.3.2 Applikation 27

3.3.3 Abnahme und Verarbeitung der Proben 27

3.4 Analytik

3.4.1 Methodenentwicklung 30

3.4.1.1 Standardlösungen und Chemikalien 30 3.4.1.2 Aufarbeitung der Plasmaproben 32 3.4.1.3 Aufarbeitung der Urinproben 33

3.4.1.4 HPLC/MS/MS 36

3.4.2 Validierung 37

3.4.2.1 Selektivität und Spezifität 37 3.4.2.2 Linearität 38

3.4.2.3 Nachweisgrenze (Limit of Detection = LOD) 38 3.4.2.4 Wiederfindung 39 3.4.2.5 Richtigkeit der Methode 39 3.4.2.6 Präzision 40 3.4.2.7 Stabilität 40

3.5 Pharmakokinetische Auswertung

4 ERGEBNISSE

4.1 Massenspektrometrische Bestimmung

4.1.1 THG 42

4.1.2 Gestrinon

4.2 Ergebnisse Validierung

4.2.1 Selektivität 43

4.2.2 Linearität 45

4.2.3 Nachweisgrenze (Limit of Detection = LOD) 46

4.2.4 Wiederfindung 47

4.2.5 Richtigkeit der Methode 47

4.2.6 Präzision 49

4.2.7 Stabilität 50

4.3 Ergebnisse zur Überprüfung der Urinaufarbeitung

4.4 Ergebnisse Variation Aufarbeitung

4.5 Ergebnisse Hauptversuch

4.5.1 Plasma 53

4.5.2 Pharmakokinetik von THG im Plasma 55

4.5.3 Urin 57

5 DISKUSSION

5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Tetrahydrogestrinon in Plasma und Urin

5.2 Pharmakokinetik von THG

5.3 Bewertung der Ergebnisse

6 ZUSAMMENFASSUNG

7 SUMMARY

8 LITERATURVERZEICHNIS

9 ANHANG

1 EINLEITUNG

Doping ist ein Gebiet mit vielen Facetten. Aufgrund des komplexen Themas gibt es viele Ansätze Doping zu definieren und zu klassifizieren. So regeln die verschiedenen Sportverbände und auch Pferdesportverbände in ihren Dopingbestimmungen, was unter den Bereich des Dopings fällt. Hier unterstreicht der Umfang dieser Reglementarien die Komplexität der Thematik. Zusammenfassend enthalten sie aber alle eine Grundaussage. Doping ist ethisch verwerflich und rechtlich verboten. Als Dopingfall wird die nachgewiesene Anwendung von Substanzen, die auf der Dopingliste stehen oder verwandte Substanzen definiert.

Ausgenommen sind einige wenige Therapeutika, für die Grenzwerte bestehen oder ausgenommen sind.

Verschiedene Studien beschäftigten sich damit, den Wissensstand über Ausscheidungszeiten und Nachweiszeiten von zugelassenem Arzneimittel zu verbessern, Analysemethoden zu verfeinern oder Standards für Analysen festzulegen.

Mit Tetrahydrogestrinon (THG) wurde eine Substanz gezielt für Dopingzwecke hergestellt, die keine Zulassung als Therapeutikum hat und auch nie als solches zugelassen werden sollte. Es war ein Ziel, einen Stoff zu synthetisieren, der in Dopingnachweisverfahren schwer detektierbar ist. Mit Tetrahydrogestrinon wurde das erste Designersteroid (THEWIS, 2005) entwickelt. Es wurden an Gestrinon vier Wasserstoffatome angehängt und damit die Masse so verändert, dass ein Nachweis mit bekannten Verfahren nicht mehr möglich war.

Ziel dieser Arbeit ist es, eine geeignete Nachweismethode für THG in den Pferdematrices Plasma und Urin zu entwickeln und klinisch zu unterprüfen.

1 LITERATURÜBERSICHT

1.1 Doping

1.1.1 Definition und Geschichtliches

Unter Doping versteht man nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999), die Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel einer Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen.

Der sprachliche Ursprung des Wortes „Doping“ stammt aus dem Niederländischen, wo das Verb „doopen“ eintauchen, tauchen bedeutet (DEBACKERE, 1989). Über die Kolonien der Niederländer gelangte der Begriff nach Südafrika und bezeichnete dort einen hochprozentigen, dickflüssigen Likör (Dop), der von den Bantus in Südostafrika als Stimulans bei religiösen Feierlichkeiten getrunken wurde (BERSCHNEIDER u.

RICHTER, 1980). Erst später wurde der Begriff auf andere stimulierende Getränke ausgedehnt (PROKOP, 1965). In den amerikanischen Sprachgebrauch übergegangen, beschrieb „to dope“ später das trickreiche Betäuben und anschließende Ausrauben von Reisenden (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980). Im Jahre 1899 stand der Begriff des Doping erstmals in einem englischen Wörterbuch, womit ein Gemisch aus Opium und Narkotika zur Verabreichung an Pferde bezeichnet wurde (HERMLE, 1996). Damit hatte sich das Wort Doping im internationalen Sprachgebrauch als Begriff für die missbräuchliche Einnahme von Mitteln zur Leistungssteigerung durchgesetzt.

1.1.2 Doping im Pferdesport

Schon in der Antike war der Gebrauch von leistungssteigernden Mitteln bekannt. Aus dem alten Rom ist bekannt, dass eine als „Hydromel“ bezeichnete wässrige Honiglösung zur Verbesserung der Geschwindigkeit und Ausdauer bei Rennpferden verabreicht wurde (MORGAN, 1957), was mit der Todesstrafe geahndet wurde.

UNGEMACH (1985) beschreibt, dass schon 1881 in Preußen alkoholische Lösungen an „feige“ Pferde verabreicht wurden. Erste Dopingkontrollen ordnete der Australische Jockey Klub 1910 an. Die ersten Dopingreglementierungen wurden am 14. Juni 1666 in England verabschiedet. In dieser ersten „Anti-Doping-Bestimmung“

wurde die Anwendung anregender Stoffe bei Pferden verboten, wobei diese aber nicht näher definiert wurden (CROISIER, 1948). Erst im 20. Jahrhundert wurde die Bekämpfung von Doping stärker vorangetrieben, da die Wirkstoffanzahl pharmakologischer Mittel stark zunahmen und somit auch die Möglichkeit zu dopen.

Dies machte eine Entwicklung geeigneter Analysemethoden unabdingbar (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Wie das Beispiel oben darlegt, wurden Pferden schon Mittel verabreicht, bevor sich Menschen Dopingsubstanzen zu eigen machten. Aber auch in jüngerer Vergangenheit bis heute ist Doping im Pferdesport ein internationales Problem. So legte 1977 die internationale Konferenz der westlichen Pferdesportverbände in Rom allgemein fest, dass alle Substanzen äußeren Ursprunges, auch wenn sie im Pferd natürlicherweise vorkommen können, verboten sind, wenn sie zu den in einer Dopingliste veröffentlichten unerlaubten Mitteln zu rechnen sind (UNGEMACH, 1985).

Auf einem Kongress in Kentucky 1994 wurden dann spezifische Fragestellungen zur Analytik von Dopingproben im Bereich des Pferdesports diskutiert und speziell die Zusammenarbeit aller Pferdesportverbände gefordert. Die Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI) stellt dabei einen internationalen Pferdesportverband dar, dem mit Deutschland 111 Nationen angeschlossen sind (DÜE, 1998). So wird ausgeführt, dass es „der Sinn aller FEI-Wettkämpfe ist, die Talente von Pferden und Reitern im Vergleich unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten durchzuführen. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung beeinflussen oder ein vorliegendes Gesundheitsproblem überdecken und zusätzlich das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen. Daher ist die Liste der verbotenen Substanzen so zusammengesetzt worden, dass sie alle Kategorien pharmakologischer Wirksamkeit umfasst“. Als verbotene Substanzen gelten die Substanz selbst, aber auch Verwandte der Substanz. Damit ist praktisch jede Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit der Teilnahme am Wettkampf nicht statthaft, unabhängig davon, ob dadurch eine Leistungsbeeinflussung möglich ist oder nicht (KLAUS u. HAPKE, 1994). TOBIN et al. (1985) wiesen nach, dass

durch Dopingkontrollen und Sanktionierung ein deutlicher Rückgang der positiven Dopingfälle verzeichnet werden kann.

1.1.2.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände

Die Dopingbestimmungen im Pferdesport dienen vor allem dazu, dem Tier bzw. dem Tierschutz zu dienen. Grundlage hierfür ist § 3 des Tierschutzgesetzes. Die Dopingreglementarien im Humanbereich basieren hingegen auf dem Arzneimittelgesetz (AMG §6).

In Deutschland wird die Verabreichung von Substanzen über die Leistungsprüfungsordnungen der drei großen deutschen Pferdesportverbände, Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V. [FN], Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. [DVR] und Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e. V. [HVT]

geregelt. Besonders seitens der FN wird eine möglichst große Übereinstimmung mit den Bestimmungen der FEI angestrebt, aber auch DVR und HVT stimmen hinsichtlich des generellen Verbots jeglicher körperfremder Substanzen mit der FN überein. Nachfolgend werden Ausschnitte aus den Dopingbestimmungen der einzelnen deutschen Pferdesportverbände dargestellt.

1.1.2.2 Leistungsprüfungsordnung LPO

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich in der LPO der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. (Stand 2004) im Abschnitt A VIII, §§ 66 – 67a.

So verbietet § 66 die Teilnahme von Pferden und Ponys nach zum Beispiel Neurektomie, lokaler Schmerzausschaltung, implantiertem Tracheotubus oder sonstigen Eingriffen beziehungsweise Manipulationen, die zur Beeinflussung der Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft geeignet sind.

In § 67 werden Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferdekontrollen in Prüfungen geregelt, wobei sich detaillierte Anweisungen zu deren Ablauf in den

angehängten Durchführungsbestimmungen finden. Ebenfalls in den Durchführungsbestimmungen geregelt ist die Ahndung bei Nachweis einer gemäß

§ 67a LPO verbotenen Substanz. Positiv getestete Teilnehmer werden disqualifiziert und der Verstoß nach den Bestimmungen der Rechtsordnung der LPO geahndet.

Zusätzlich besteht die Möglichkeit, die Tat als Verstoß gegen das Tierschutzgesetz der zuständigen Behörde zu melden.

§ 67a enthält die Liste der kontrollierten Substanzgruppen. Dabei wird zwischen

„Punkt 1 Dopingsubstanzen“ und „Punkt 2 Verbotene Arzneimittel“ unterschieden, sowie unter Punkt 3 die Ausnahmen hiervon geregelt.

Hierbei werden Dopingsubstanzen als Substanzen bezeichnet, die geeignet sind, die Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Dabei werden nicht einzelne Arzneimittel, sondern Stoffgruppen wie zum Beispiel Sedativa und Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder Anabolika aufgeführt. Lediglich für einzelne Substanzen, die auch körpereigen vorkommen, wie z.B. Testosteron, Nandrolon, Theobromin und Cortisol gelten Grenzwerte.

Auch die verbotenen Arzneimittel sind nicht einzeln, sondern als Stoffgruppen reglementiert. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die zwar als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind (zum Beispiel solche mit Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System, auf das Atmungssystem, auf die Haut, gegen Infektionserreger). Auch hier gelten für wenige Mittel, wie Salizylsäure, Arsen, Dimethylsulfoxyd und verfügbares CO2 Grenzwerte.

Ausnahmen von oben genannten Bestimmungen bilden Substanzen zur Pflege und Vorbeugung wie zum Beispiel Impfstoffe, die bis spätestens 14 Tage vor der Prüfung appliziert werden, oder Insektenschutzmittel.

1.1.2.3 Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. [DVR]

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt XIV der Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (Stand Januar 2002) unter Unerlaubte Mittel / Doping. Die Punkte 529 bis 561 regeln das allgemeine Verbot der Anwendung unerlaubter Mittel, definieren Gruppen erlaubter und unerlaubter

Mittel, Substanzen mit Grenzwerten, sowie die Entnahme, Vorbereitung und Auswertung von Dopingproben. Im Unterschied zur LPO behält sich das Direktorium vor, Kontrollen nicht nur während Prüfungen durchzuführen, sondern auch Trainingsproben entnehmen zu lassen.

1.1.2.4 HVT Traberverband

Die Dopingbestimmungen dieses Pferdesportverbandes werden im Teil B II § 93 und den Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping geregelt. Entsprechend der oben genannten Rennordnung darf ein Pferd von Beginn bis zum Ende des Rennens keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen in seinen Geweben, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen aufweisen.

Entgegen der LPO oder RO werden keine Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt 2.1.7.1) für einzelne Mittel angegeben, so dass jeglicher Nachweis verbotener Stoffe positiv berichtet wird. In den Durchführungsbestimmungen finden sich die Dopingliste mit Verboten von Substanzen beziehungsweise Stoffgruppen (Diuretika, Herz- Kreislaufwirksame Mittel, Substanzen, die auf das zentrale oder periphere Nervensystem wirken usw.) und detaillierten Bestimmungen zur Entnahme, dem Versand und Auswertung von Proben.

Allen drei Pferdesportverbänden ist in der Reglementierung des Dopings gemein, dass hauptsächlich Stoffgruppen auf den Verbotslisten aufgeführt werden. Eine Auflistung einzelner Stoffe oder sogar Warennamen wäre bei der Vielfalt der zur Verfügung stehenden Medikamente nicht möglich und könnte niemals vollständig sein.

1.1.3 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in BRD

Seit Anfang der 1970er Jahre werden systematische Dopingkontrollen der großen deutschen Pferdesportverbände durchgeführt. Die Auswahl der Pferde, von denen Urin oder Blut auf das Vorhandensein verbotener Substanzen untersucht wird, erfolgt nach dem Zufallsprinzip und aufgrund von Verdachtsfällen. Medikationskontrollen führt der Galopp-, Trab-, Reit- und Fahrsport in Deutschland durch, wobei die FN etwa 1000 Proben zur Untersuchung an Laboratorien sendet. Der Hauptanteil der

Proben wird im Institut für Biochemie der deutschen Sporthochschule Köln analysiert.

Eine Übersicht über die Jahre 2000 bis 2004 gibt die nachfolgende Tabelle 1.

Jahr Anzahl der Proben Positiv getestete Proben (Anzahl)

Positiv getestete Proben (%)

2000 1718 36 2,01 2001 1635 16 0,98 2002 1526 22 1,44 2003 1241 11 0,88 2004 1601 21 1,31

Tabelle 1: Untersuchte Pferdeproben in den Jahren 2000 bis 2004 der Sporthochschule Köln

1.2 Steroidhormone

Zu den Steroidhormonen zählen die Glucocorticoide, Mineralocorticoide und die Sexualhormone. Steroidhormone haben alle die gleiche Grundstruktur. Basis ist ein trans verknüpftes Sterangerüst. Die Synthese erfolgt aus Cholesterin. Die für die Arbeit interessante Gruppe sind die Sexualhormone. Eine Einteilung der Sexualhormone erfolgt in drei Klassen. Die männlichen Sexualhormone werden als Androgene, die weiblichen als Gestagene und Östrogene bezeichnet.

Estrogene sind Abkömmlinge des C18- Grundgerüst Estran und besitzen einen aromatischen A-Ring. Die körpereigenen Estrogene sind Estradiol, Estron und Estriol. Sie werden in den Granulosazellen der Ovarfollikel, in der Plazenta, in den Nebennierenrinden und in den Hoden gebildet. Sie können aber auch durch Aromatisierung von Androgenen im Fettgewebe entstehen. Bei Verabreichung rufen sie beim weiblichen Tier Brunstsymptome hervor. Östrogen wirksame Stoffe gibt es auch pflanzlichen Ursprungs: die Phytoöstrogene. Sie haben auch die Östrogene Wirkung inne.

Gestagene, das natürliche Progesteron und synthetische Derivate, teilen sich, ihrer chemischen Struktur nach in zwei Gruppen ein. Die Struktur von C21-Gestagenen, die sich vom Progesteron ableiten, und die Gestagene, die sich von 19-Nor- Testosteron ableiten. Sie sind für die Implantation und Entwicklung des Embryos

verantwortlich. Die Bildung findet speziesabhängig im Corpus luteum und in der Plazenta statt. Ihre Wirkung beruht hauptsächlich in dem Zusammenwirken mit Östrogenen.

Bei den Androgenen ist Testosteron das wichtigste im Körper gebildete Hormon. Es ist ein C19-Steroid und stammt zum überwiegendem Teil aus den Leydig´schen Zwischenzellen des Hoden. Den Rest produziert die Nebennierenrinde. Weitere im Organismus produzierte Androgene sind Androstendion und Dehydroepiandrosteron.

Sie sind etwa 5 - 10-fach geringer wirksam wie Testosteron. Die Wirkungen sind wie folgt zusammenzufassen: Entwicklung und Funktion der männlichen Geschlechtsorgane, Regulation der Spermienproduktion, Förderung des Eiweißaufbaus und Hemmung der Gonadotropinfreisetzung (LÖSCHER, 2002).

1.3 Anabolika

Anabolika im engeren Sinne sind synthetische Abkömmlinge der Androgene, die eine stärkere anabole Wirkung als androgene Wirkung hat. Sie leiten sich zum größten Teil vom 19-Nor-Testosteron ab, aber auch andere Modifikationen des Steroidgerüstes führen zu Hormonen mit anabolen Effekten. Im weiteren Sinne zählen auch die körpereigene Stoffe, wie vor allem Testosteron dazu (SCHÄNZER,1997). Eine entscheidende Frage bei dem Einsatz dieser Stoffe ist die Wirksamkeit. Hierfür hat sich der Herschberg-Test durchgesetzt. Hierbei erfolgt die biologische Überprüfung von Androgenen und Anabolika an infantilen, kastrierten männlichen Ratten. Es werden die Massenzunahmen von Samenblase, Prostata und musculus levator ani überprüft. Als Ausdruck der androgenen Komponente gilt die Zunahme von Samenblase und Prostata, als Maß für die Anabolität die Massenzunahme des musculus levator ani.

Nebenwirkungen von Anabolika treten hauptsächlich bei längerfristiger Einnahme auf. Eine Veränderung des Blutbildes und des Blutdruckes kann jedoch schon bei einmaliger Einnahme festgestellt werden. Bei einigen Präparaten kommt es zu Herzrhythmusstörungen, starkem Schwitzen und Muskelzittern. Nach längerfristigem Konsum von Sterioden kann es zu einer psychischen und physischen Abhängigkeit kommen. Es können starke Stimmungsschwankungen, aggressive Tendenzen, Depressionen und psychotische Phasen auftreten. Zu den Langzeitfolgen zählen Schilddrüsenüberfunktion, Hautverunreinigungen, Veränderung des Skelett- und

Bewegungsapparates und Wasseransammlung in Geweben. Bei einer längerfristigen Einnahme erhöht sich das Herzinfarkt- und Schlaganfallrisiko. Die orale Einnahme von Steroiden kann zu schweren Leberschädigungen führen. Weiter haben sie einen starken Einfluss auf die Sexualität und die Geschlechtsmerkmale. So führt die Einnahme von anabolen Sterioden beim Mann zu einer gestörten Spermienproduktion, zu einer Atrophie der Hoden bis hin zur Unfruchtbarkeit. Bei Frauen können anabole Steroide eine Veränderung des Menstruationszyklus, eine Vergrößerung der Klitoris, starker Körperbehaarung und Bartwuchs, als auch einer tiefen Stimme führen (DUCHAINE, 1989).

1.4 „Designersteroide“

1.4.1 Jüngere Geschichte

Neben der langen Geschichte des Dopings, ist auch der Missbrauch von Steroidhormonen seit einiger Zeit bekannt. Seit den 60er Jahren wurde diese Handhabung vom Internationalen Olympischen Komitee beobachtet, konnte aber erst 1974 verboten werden, da bis zu diesem Zeitpunkt kein ausreichend sicheres Verfahren zum Nachweis zur Verfügung stand. Ab diesem Zeitpunkt war die Anwendung von exogenen anabolen Steroiden verboten. Erste Kontrollen erfolgten bei Wettkämpfen ab 1976 (SCHÄNZER, 1997). Die frühen Nachweismethoden für exogene Steroide erfolgte in zwei Schritten. Dem Screening mittels Radioimmunoassay und der Bestätigung mittels Gaschromatographie/

Massenspektrometrie. Dies erfolgte für die weit verbreiteten Steroide Nandrolon und Methandienon. Erst nach 1980 wurde auch das Screening mittels Gaschromatographie/ Massenspektrometrie durchgeführt, was es ermöglichte eine große Anzahl an androgen anabolen Steroiden zu überprüfen, wie Medikamente, die keine Zulassung im Humanbereich hatten, wie z.B. Boldenon. Boldenon ist ein synthetisches Anabolikum, das in den USA zur Rindermast zugelassen ist. Der Nachweis endogener Steroide, wie Testosteron und seiner Prohormone, erwies sich als deutlich schwerer, da hier neben der eindeutigen Identifizierung, eine Unterscheidung zwischen Körpersynthese und äußerlich zugeführt erfolgen musste.

Hierfür wurde seit 1983 die Überprüfung von dem Verhältnis von Testosteron zu

Epitestosteron eingeführt. Ab einem Verhältnis von über 6:1 wurde eine weitere Untersuchung zum Kohlenstoffisotopenverhältnis durchgeführt. Die Bestimmung erfolgte per Kohlenstoffisotopen-Verhältnismassen-Spektrometrie. Das C13/C12 Isotopenverhältnis von äußerlich zugeführtem Testosteron unterscheidet sich deutlich von dem körpereigenem Testosteron und dessen Metaboliten. Das liegt daran, dass sie zum Teil aus pflanzlichen Vorläufern isoliert und verändert werden (SCHÄNZER, 1997).

Die Entwicklung ab den 60er Jahren zeigt eine Entwicklung ganz deutlich: den Wettlauf zwischen Doping und dessen Nachweis.

So wurden zwei Proben im August 2001 und März 2002 von Frauen kontrolliert und im nachhinein positiv auf Norbolethon getestet. Bei Norbolethon handelt es sich um ein 19-Nor-Steroid, dessen Synthese 1966 beschrieben wurde (BUZBY,1966).

Norbolethon wurde vor 30 Jahren in Studien bei Kleingewachsenen und Untergewichtigen getestet (GREENBLATT,1964) und zeigte im Tierversuch eine deutlich höhere anabole als androgene Wirkung. Aufgrund seiner Nebenwirkungen wurde Norbolethon nie vermarktet und geriet in Vergessenheit. Ob ein Einsatz dieser Substanz schon früher stattfand, ist nicht zu beweisen.

Am 1. Januar 2004 trat die neue Verbotsliste der World Anti Doping Association (WADA) in Kraft. Hier werden zwei Substanzgruppen aufgeführt: die androgen

anabolen Steroide und andere anabole Wirkstoffe; worunter z.B. bestimmte β-Mimetika fallen. Die Gruppe der anabolen Steroide wird in endogene und exogene

Steroide unterteilt. Es werden weiter Prohormone, die im Körper teilweise zu anabolen Steroiden umgewandelt werden verboten.

1.4.2 THG

Bis zum Auffinden des sogenannten Designersteroides Tetrahydrogestrinon (THG) war kein missbräuchlich eingesetztes Steroid bekannt, das nicht von Pharmafirmen zum therapeutischen Einsatz entwickelt wurde. Ziel war es von Victor Conte ein anabol wirksames Steroid zu entwickeln, das bei den Dopingkontrollen nicht auffällt.

Entwickler und Hersteller war das Balco Laboratorium in der Bay Area in Californien.

Verantwortlich hierfür zeigte sich Victor Conte, wie die Neue Züricher Zeitung 2003 berichtete.

1.4.2.1 Struktur

Bei Tetrahydrogestrinon handelt es sich um ein C21-Steroid. Es handelt sich um eine Substanz, die enge Verwandtschaft zu den Stoffen Trenbolon, Altrenogest und Gestrinon zeigt. Sie basieren auf einem Sterangerüst.

Gestrinon THG

Altrenogest Trenbolon

Abbildung 1: Strukturformeln der Stoffe THG, Gestrinon, Altrenogest und Trenbolon O

C CH CH₃CH₂ OH

O

CH₃CH₂ OH

CH₂ CH₃

O

CH₂CH OH

CH₂ CH₃

O

CH₃OH

1.4.2.2 Herstellung

Ausgangsmaterial für die Herstellung von Tetrahydrogestrinon ist Gestrinon.

Gestrinon hat unter dem Handelsnamen Nemestran eine Zulassung in der Schweiz zur Endometriosebehandlung der Frau. Gestrinon ist ein 19-Nor-Steroid und wurde ursprünglich zur oralen Empfangnisverhütung hergestellt. Es wirkt androgen, antiöstrogen und antigestagen. Eine anabole Wirkung wird vermutet. Das internationale Olympische Komitee hat Gestrinon deshalb auf die Liste der verbotenen Substanzen gesetzt.

Tetrahydrogestrinon unterscheidet sich von Gestrinon um 4 Wasserstoffatome.

Diese werden unter Verwendung eines geeigneteten Katalysators an die Ethinylgruppe an C17-Position des Steriodes addiert (CATLIN, 2004).

Abbildung 2: Herstellung von THG aus Gestrinon mit Strukturformeln

1.4.2.3 Wirkung THG

Die Wirkung von THG ist in zwei verschiedenen Systemen kontrolliert worden. Eine Australische Arbeitsgruppe hat die Wirkung von THG an einer Hefezelllinie überprüft (DEATH et al, 2004). Hierfür bauten sie in eine Hefezelllinie Androgen-, Progesteron- und Östrogenrezeptoren ein und überprüften die Bindung und Wirkung von THG.

THG musste hierfür eine Bindung mit einem Rezeptor eingehen und eine Galaktosidaseaktivität induzieren, die eine Zuckerreaktion hervorruft. Diese Zuckerreaktion wird in Form einer Verfärbung sichtbar, was beweisend für die Bindung und Wirkung von THG ist. Die Wirkung von THG wurde mit den Stoffen Nandrolon, Gestrinon und Trenbolon verglichen. Hier stellte sich THG als die wirksamste Substanz im Vergleich heraus. THG zeigte in dieser Studie auch Aktivität am Progesteron-Rezeptor. Diese Aktivität übertraf neben der Wirkung Gestrinon und Trenbolon, sogar die des Progesterons. Zusammenfassend ist zu sagen, dass THG in dieser Studie ein hochpotenter androgen und gestagen wirksamer Stoff ist. Es hat keine Wirkung auf den Östrogenrezeptor gezeigt. Weiter war THG kein Antagonist zu einem anderen Sexualsteroid. Bei keinem der Steriode wurde eine Zelltoxizität in der Hefezellkultur beobachtet. Nach Einschätzung der Autoren muss THG in seiner biologischen Wirkung mit denen des Gestrinons verglichen werden (DEATH et al, 2004). Zu den zu erwartenden Nebenwirkungen sollen beim Mann reduzierte Spermiogenese, Hodenatrophie und Unfruchtbarkeit zählen. Bei der Frau seien Vermännlichung, Stimmbruch und Zyklusstörungen zu erwarten.

LABRIE et al (2004) hat die Wirkung von THG am lebenden Organismus getestet.

Überprüft werden sollte in dieser Studie die Rezeptoraffinität, die Genregulation und die anabole Wirkung. Für diese Studie wurden 11-12 Wochen alte männliche Mäuse genommen und kastriert. Mäuse wurden für diese Studie gewählt, da sie nach WATERSON (2002) in ihrem androgen genetischen Profil zu 99% dem menschlichen Organismus entsprechen. Jede Gruppe hatte eine Größe von 10 Tieren. Sieben Tage nach der Kastration wurden die Gruppen mit 0,1 mg oder 0,5 mg Dihydrotestosteron bzw. THG pro Tier sub cutan behandelt. Die Mäuse wurden anschließend unter Isoflurannarkose euthanasiert. Von den euthanasierten Tieren wurden die Prostata, die Samenblase, sowie die M. gastrocnemius and M. levator ani gewonnen.

Bei der Rezeptoraffinität zeigte THG eine die stärksten Bindungseigenschaften an den Androgenrezeptor. Die relative Bindungsfähigkeit von Dihydrotestosteron, Testosteron und Methyltrienolon gegenüber THG betrugen 72, 58 bzw. 7 %.

Weiter wurde die Wirkung von THG und Dihydrotestosteron auf den M. levator ani als androgen-sensiblen Muskel (BOISSONNEAULT, 1989) überprüft, der nach EISENBERG (1950) als Muskelindikator für eine anabol-androgene Aktivität von Steroiden gilt. Hier zeigten sich THG und Dihydrotestosteron gleich wirksam. Bei der kastrierten Kontrollgruppe ging das Muskelgewicht um 26% zurück, wobei die Ursprungsmasse bei der Gabe beider Substanzen unverändert blieb.

LABRIE et al. stellte als die eindruckvollste anabole Aktivität von THG heraus, dass das Genexpressionsmuster, welches THG hervorruft, nahezu identisch dem des Dihydrotestosteron ist. Dies war bei dem m. levator ani, dem m. gastrocnemius und der Prostata über den gesamten Verlauf der Untersuchung der Fall.

1.5 Pharmakokinetische Grundprinzipien

Unter Pharmakokinetik versteht man die Lehre von der quantitativen Auseinandersetzung zwischen Organismus und Pharmakon (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Als Teilgebiet der Pharmakologie befasst sie sich mit der Wirkung des Organismus auf den Arzneistoff. Dabei wird die Konzentration einer Substanz im Körper von den Faktoren Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und Ausscheidung in Abhängigkeit von der Zeit beeinflusst (KOCH u. RITSCHEL, 1986).

Das Merkwort „LADME“ (siehe Abbildung 4) macht den Weg eines Arzneistoffes im Organismus deutlich (KOCH u. RITSCHEL, 1986):

Invasion (Anfluten) Liberation (Freisetzung) Absorption (Resorption) Distribution (Verteilung)

Elimination (Abfluten) Metabolismus (Biotransformation) Exkretion (Ausscheidung)

Abbildung 4: LADME – Das „Dogma der Pharmazie“ nach KOCH und RITSCHEL (1986)

Danach lässt sich der Verlauf einer Arzneimittelkonzentrationskurve in die Invasion und die Elimination einteilen. Die Anflutung des Arzneimittels beginnt mit der Liberation, also der Freigabe des Wirkstoffes aus seiner galenischen Arzneiform und Verteilung im resorptiven Kompartment. Es folgt die Aufnahme des Wirkstoffes durch biologische Membranen in die Blutbahn oder die Resorption. Im Falle der

intravenösen Applikation entfällt dieser Schritt, da bereits der gesamte Stoff im Blut vorliegt und verfügbar ist. Die Geschwindigkeit, mit der die Substanz im Blut erscheint, hängt lediglich von der Applikationsgeschwindigkeit ab. Daher kann der Vorgang der Resorption bei intravenöser Applikation aus den pharmakokinetischen Berechnungen ausgeklammert werden (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Im Fall einer nicht intravasalen Applikation hängt die Resorption von der Liberations- geschwindigkeit, der Applikationsform und -ort, den physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Stoffkonzentration am Applikationsort ab (KOCH u.

RITSCHEL, 1986). Auch die Distribution, also die weitere Verteilung der Substanz in den Körperflüssigkeiten, wird von den substanzspezifischen Eigenschaften bestimmt.

Dazu gehören zum Beispiel die Molekülgröße, die Lipidlöslichkeit, der pH-Wert oder die Bindung an Plasmaproteine. Nur der freie, ungebundene Teil des Wirkstoffes kann bis zum Rezeptor und damit dem Ort seiner Wirkung permeieren, während der an Plasmaproteine oder andere Blutbestandteile gebundene Anteil im Blutplasma fixiert ist. Die Plasmaproteinbindung ist zwar reversibel, kann jedoch die Aktivität eines Arzneistoffes deutlich beeinflussen. Weiterhin kann auch eine Bindung an Gewebsproteine stattfinden. Eine Anreicherung im Fettgewebe ist ebenfalls möglich.

Diese Ablagerung ist ebenfalls temporär, kann sich aber verzögernd auf die Ausscheidung, beziehungsweise verlängernd auf die Arzneimittelwirkung auswirken, weil der Wirkstoff nicht durch die Ausscheidungsorgane filtriert werden kann. Der Metabolisierung unterliegt ein großer Teil chemischen Verbindungen im Körper.

Schon beim Durchtritt durch die Darmschleimhaut und beim ersten Durchgang durch die Leber werden viele Arzneistoffe in ihrer Struktur verändert und büßen ihre Wirksamkeit teilweise oder völlig ein (englisch: first-pass-Effekt). Gleichzeitig stellt die Metabolisierung die Vorbereitung des Pharmakons auf die Exkretion dar. Dabei werden zum Beispiel aus lipophilen Substanzen gut wasserlösliche gebildet, um eine bessere Ausscheidung über die Nieren (mit dem Urin) oder die Galle (mit den Faeces) zu erreichen. Die Exkretion über Sekrete wie Speichel, Milch oder Schweiß,

sowie die Ausatmungsluft, spielt zumeist nur eine untergeordnete Rolle bei der Beseitigung eines Pharmakons aus dem Körper. Metabolisierung und Exkretion werden unter dem Begriff der Elimination zusammengefasst, weil beide Vorgänge Voraussetzung für die endgültige Entfernung von Arzneistoffen und Metaboliten aus dem Körper sind (KOCH u. RITSCHEL, 1986).

Die Vorgänge der Invasion und der Elimination verlaufen nebeneinander. Der zeitliche Verlauf der Konzentration eines Wirkstoffes, der durch die oben genannten komplexen Verteilungs- und Eliminationsvorgänge im Körper beeinflusst wird, lässt sich mathematisch unter Annahme sogenannter Kompartimente (imaginäre Verteilungsräume) beschreiben (DYKE u. SAMS, 1994). Als Kompartimente bezeichnet man Räume, die kinetisch einheitlich sind, wie zum Beispiel den Magen- Darm-Trakt, das Blut oder bestimmte Gewebe (DOST, 1968). Es werden verschiedene Kompartiment-Modelle für die pharmakokinetischen Berechnungen beschrieben.

Beim Ein-Kompartiment-Modell wird der gesamte Organismus als einheitlicher Verteilungsraum angesehen. Dabei stehen alle Organe und Gewebe mit dem Blutkreislauf in direktem Gleichgewicht. Die Verteilung des Wirkstoffes in einem solchen System erfolgt in einer vernachlässigbaren Zeit und die Ausscheidung folgt einer Kinetik 1. Ordnung (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Das bedeutet, das konzentrationsabhängig pro Zeiteinheit ein konstanter prozentualer Anteil der Stoffmenge transportiert wird (exponentieller Verlauf der Konzentrations-Zeit-Kurve).

Aus der Steigung der Geraden, nach logorhythmischer Transformation sind die Eliminations-konstanten und die Halbwertszeit zu ermitteln.

Mehr-Kompartiment-Systeme stellen die Vorgänge im Körper anhand von mindestens zwei Verteilungsräumen dar. Für viele Wirkstoffe ist das Zwei- Kompartiment-System für die Beschreibung der Kinetik am besten geeignet (BAGGOT, 1978). Dabei verteilt sich der Wirkstoff zuerst in einem zentralen Kompartiment, womit in der Regel das Plasma oder aufgrund ihrer starken Perfusion mit dem Blut in Gleichgewicht stehende Gewebe wie Lunge, Leber oder Nieren gemeint sind (BAGGOT, 1978). Von dort diffundiert das Arzneimittel in periphere Räume, wie zum Beispiel Haut, Unterhaut, Muskulatur und Fettgewebe (KLOTZ, 1988). Da jedoch die Ausscheidung der Stoffe ausschließlich über das zentrale Kompartiment stattfindet, erfolgt zeitgleich auch ein Austausch zurück von peripherem zu zentralem Kompartiment. Stofftransporte in, aus und zwischen den

verschiedenen Kompartimenten werden durch Geschwindigkeitskonstanten beschrieben. Die Konzentrations-Zeit-Kurve eines Zwei-Kompartiment-Modells zeigt in halblogarithmischer Darstellung einen biexponentiellen Verlauf. In der initialen Verteilungsphase fällt die Konzentration im zentralen Kompartiment schnell ab und geht nach Erreichen des Gleichgewichts in eine lineare Eliminationsphase über, die durch einen flacheren Verlauf gekennzeichnet ist (DERENDORF et al., 2002).

Nach welchem Modell die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter erfolgt, hängt von den Messwerten ab. Zeigen diese in halblogarithmischer Darstellung über einen genügend langen Zeitraum einen monoexponentiellen Verlauf, so ist das Ein- Kompartiment-Modell anzuwenden. Ist der Verlauf jedoch biexponentiell, findet das Zwei-Kompartiment-Modell Anwendung. Dabei sollten mindestens drei bis vier Messpunkte pro Kurvenanteil vorhanden sein (KLOTZ, 1984).

Pharmakokinetische Parameter beschreiben den zeitlichen Verlauf eines Arzneimittels im Organismus. Im Folgenden werden einige Parameter genauer beschrieben, die im Zuge dieser Arbeit bestimmt wurden.

Die Clearance (Cl) ist ein hypothetisches Volumen der Kreislaufflüssigkeit, welches pro Zeiteinheit durch die Funktion eines beziehungsweise aller Ausscheidungs- organe von einem Arzneistoff befreit wird. Die totale Clearance ist also ein Maß für die Eliminationsleistung des Organismus. Sie setzt sich Additiv aus den Ausscheidungsraten der einzelnen beteiligten Organe zusammen (SAMS, 1992).

Solange keine Sättigung der Prozesse der Elimination vorliegt, verhält sich die Clearance dosisunabhängig.

Als Halbwertszeit (HWZ) wird die Zeit bezeichnet, nach der die Konzentration um die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes abgenommen hat (DERENDORF et al., 2002).

Sie wird aus der Geschwindigkeitskonstanten, z.B. der Eliminationskonstanten errechnet und ist für jeden Stoff charakteristisch, unabhängig von der verabreichten Dosis. Sie ist ein wichtiger Parameter zur Berechnung von Dosierungsintervallen und der Berechnung der Ausscheidungszeit. Im allgemeinen werden etwa 4 Halbwertszeiten benötigt, um einen Stoff zu etwa 94% aus dem Organismus eliminiert zu haben (KAMERLING und OWENS, 1994).

Das Verteilungsvolumen (Vd) beschreibt als fiktive Größe das Flüssigkeitsvolumen, das erforderlich wäre, um die gesamte im Körper befindliche Arzneistoffmenge in gleicher Konzentration zu lösen, in der sie im Blut vorliegt. BAGGOT (1978)

beschreibt das Verteilungsvolumen als einen pharmakokinetischen Term, der dazu genutzt wird, die Dosis zu berechnen, die benötigt wird, um eine gewünschte Plasmakonzentration zu erhalten. Es ist ein Maß für die Gewebegängigkeit eines Arzneimittels. Die ist bei intravenöser Gabe initial gering, da sich die gesamte Arzneimittelmenge in der Blutbahn befindet. Mit anschließender Verteilung in die Körpergewebe vergrößert sich das Verteilungsvolumen. Wenn es dem Volumen des Gesamtkörperwasser entspricht, heißt das, dass die Substanz intra- und extrazellulär verteilt ist. SAMS (1996) stellte fest, dass Arzneimittel, die eine hohe Plasmaproteinbindung eingehen, ein geringes Verteilungsvolumen haben.

Unter der Bioverfügbarkeit versteht man das Ausmaß und die Geschwindigkeit, mit der der therapeutisch wirksame Bestandteil eines Arzneimittels in den systemischen Kreislauf gelangt (DERENDORF et al., 2002). Diese beträgt bei intravasaler Applikation 100 %, während nach zum Beispiel oraler Applikation die Bioverfügbarkeit vermindert ist, da durch Darm- und Leberpassage nur noch ein Teil der Dosis zur Verfügung steht (FICHTL et al., 2001). Zur Berechnung der Bioverfügbarkeit wird die Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve (AUC) herangezogen. Zusammen sind die Bioverfügbarkeit, die maximale Konzentration (Cmax) und der Zeitpunkt der maximalen Konzentration (tmax) bedeutende Größen, um die Bioäquivalenz einer Arzneiform zu bestimmen.

1.6 Analytik

1.6.1 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Als Chromatographie bezeichnet man eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase, die nicht miteinander mischbar sind. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ist eine besonders schnelle und leistungsfähige Chromatographiemethode und trennt innerhalb von Minuten einen umfassenden Bereich von Stoffgruppen (SCHWEDT, 1986). Dazu gehören stark polare und ionische Substanzen, Substanzen mit hoher Molmasse sowie thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen (UNGER et al., 1995).

Es gibt verschiede Arten nach der die Flüssigkeitschromatographie arbeitet. Nach dem Prinzip der Adsorptionschromatographie funktioniert die klassische Säulen-

oder Dünnschichtchromatographie. Als stationäre Phase dient hier ein relativ polares Material mit hoher spezifischer Oberfläche, meist Kieselgel oder ähnliches. Die mobile Phase ist relativ apolar, z.B. Pentan. Die Trennung erfolgt durch unterschiedliche Adsorbtion der verschiedenen Molekülsorten im Gemisch an der stationären Phase. Polare Stoffe werden hierbei später eluiert als apolare. Bei der Umkehrphasenchromatographie ist das Prinzip genau ungekehrt. Die stationäre Phase ist sehr apolar und die mobile Phase ist polar, wie z.B. Wasser. Ein polares Lösungsmittel eluiert hier langsamer. Bei der Chromatographie an chemisch gebundene Phasen ist die stationäre Phase kovalent an das Trägermaterial gebunden. Durch die geeignete Wahl der Reaktionspartner lässt sich eine Vielzahl von stationären Phasen herstellen. Die oben genannte Umkehrphasenchromatographie ist der wichtigste Spezialfall der Chromatographie an chemisch gebundene Phasen.

Bei der Ionenaustauschchromatographie enthält die stationäre Phase eine ionische Gruppe. Diese tritt mit den Probenmolekülen in Wechselwirkung. Diese Methode ist z.B. für die Trennung von Stoffwechselprodukten und Aminosäuren geeignet. Für die Trennung von Ionen starker Säuren und Basen wurde die Ionenchromatographie entwickelt. Sie ist ein Spezialfall der Ionenaustauschchromatographie. Eine weitere Form ist die Gelchromatographie.

Man unterteilt sie in Gelpermeationschromatographie, geeignet für organische Lösungsmittel, und Gelfiltrationschromatographie für wässrige Lösungen. Diese Form der Chromatographie trennt die Substanzen nach Molekülmasse. Die größten Moleküle werden am schnellsten eluiert. Die Affinitätschromatographie basiert auf einer hochspezifischen biochemischen Wechselwirkung. Die Bindung kommt hier zu Stande, wenn räumliche und ladungsmäßige Voraussetzungen erfüllt sind. Dies ist bei einer Antigen-Antikörperreation der Fall.

Jede HPLC-Apparatur besteht aus einer Serie von Bausteinen, die miteinander gekoppelt sind. Ein sogenanntes chromatographisches System enthält folgende Bausteine:

Die stationäre Phase wird von einer sogenannten „Säule“, als langgestrecktes Trennbrett in einem Rohr gebildet. Das Innere der Trennsäule wird aus einem stabilen und dichten Verband aus kleinen, porösen Teilchen gebildet (Säulenbett), was eine große Oberfläche und hohe Druckstabilität garantiert (UNGER et al., 1995).

Die Trennsäule ist charakteristisch durch ihre Länge, ihren Innendurchmesser und

durch den mittleren Teilchendurchmesser des Packungsmaterials. Sie besteht aus einem Probenaufgabeteil, durch den auch die Zufuhr der mobilen Phase erfolgt, der chromatographischen Trennstrecke und dem Säulenende, das in den Detektor übergeht. Die Trennung der einzelnen Substanzen ist aufgrund ihrer unterschiedlichen Polaritäten mit unterschiedlichen Sorptions- und Desorptions- vorgängen auf der Säule möglich.

Die mobile Phase entspricht einem Lösungsmittelgemisch. Es wird infolge der Schwerkraft oder mittels einer Pumpe unter Überdruck aus dem Fließmittelreservoir in die Säule eingebracht. Möchte man ein Substanzgemisch mit verschiedenen polaren Substanzen trennen, so verwendet man zur Trennung die Gradientenelution.

Bei dieser Arbeitsweise wird die Fließmittelstärke kontinuierlich erhöht und damit die Empfindlichkeit der Detektion im hinteren Teil der Zeitachse erhöht (siehe Punkt 3.3.3.1).

Die Pumpe dient der Erzeugung eines konstanten und regelbaren Flusses des Lösungsmittels. Für analytische Säulen werden Volumina von 0,5 bis 5 ml/min angegeben.

Die Dosiervorrichtung oder das Einspritzsystem gibt reproduzierbar ein im Volumen wählbares, definiertes Aliquot des zu trennenden Gemisches (Probe) aus dem Probenröhrchen direkt in den Strom der mobilen Phase. So gelangen Probe und Lösungsmittel über das Probenaufgabeende in die thermostatierte Säule und werden durch sie hindurch geleitet (SCHWEDT, 1986).

Das Detektionssystem schließt sich der Säule direkt an und macht das chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Dabei ist das Signal proportional zur Menge der Substanz und wird in Abhängigkeit zur Zeit in Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm zeigt die Retentionszeit der Substanz sowie Höhe und Fläche des Peaks an. Die Retentionszeit entspricht der Zeitspanne von der Injektion bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Über den Vergleich der Fläche der Substanz zur Fläche des internen Standards kann auf die Konzentration der Probe geschlossen werden (MASSMANN, 2004).

In der vorliegenden Studie wurde das HPLC-System direkt mit einem Tandem- Massenspektrometer als Detektionssystem gekoppelt. Es ist sensibler und spezifischer als alle anderen flüssigkeitschromatographischen Detektoren und dient der Darstellung und Identifizierung von Substanzen. Die substanzspezifischen Fragmentierungsmuster lassen Rückschlüsse auf die Strukturformeln der zu

identifizierenden Substanzen zu, denn unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Das Massenspektrometer erzeugt nach der Trennung der Substanzen im Flüssigkeitschromatographen einen Strahl gasförmiger Ionen. Hierfür werden die Substanzmoleküle unter atmosphärischem Druck in für die Substanz charakteristische Ionen zerlegt und von den Molekülen des Lösungsmittels getrennt. Die in der Zeiteinheit gebildeten Mengen an Ionen bezeichnet man als Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt- ionenstrom (BUDZIKIEWICZ, 1998).

In dieser Studie wurde als Ionisationsverfahren die chemische Ionisation unter atmosphärischem Druck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) verwendet. Dabei wird der aus der HPLC-Säule austretende flüssige Eluent bei einer Temperatur von 350 bis 550°C in einer evakuierten Verdampfungskammer vernebelt.

An einer Glühkathode werden die gasförmigen Teilchen ionisiert und dem Massenspektrometer zugeleitet. In dem verwendeten Triple-Quadrupole- Massenspektrometer werden die Ionen dreimal hintereinander mittels Beschleunigung im elektrischen Feld nach Masse und Ladung getrennt und durch Kollision mit Stickstoffmolekülen in typische Fragmente zersprengt. Andere Ionen werden aus dem Feld hinaus in die Umgebung abgeleitet, was eine Aufreinigung und Konzentration der gesuchten Ionen bedeutet. Diese werden schließlich durch einen Kollektorspalt in einen Detektor geleitet und dort entladen. Die Ströme führen zur Aufzeichnung des Massenspektrums (BUDZIKIEWICZ, 1998). Dabei gibt das Massenspektrum alle Ionen eines Substanzgemisches, das „single ion monitoring“

(SIM) hingegen nur das ausgewählte Spektrum eines Ions an.

Die Analytik erfolgte in der vorliegenden Studie mittels Hochdruck-Flüssigkeits- chromatographie in Kombination mit einem Tandem-Massenspektrometer-System.

2 MATERIAL UND METHODE

2.1 Versuchsplanung

Zur Untersuchung der Eliminationskinetik von Tetrahydrogestrinon (THG) im Pferdeblut und -urin wurde die Substanz einmalig in einer Dosis von 0,025 µg/kg KM oral appliziert. Die Dosis ist angelehnt an die therapeutische Dosis von Gestrinon,.

Die Studie teilte sich in einen Vorversuch und in einen Hauptversuch. Im Vorversuch erfolgte an Blut- und Urinproben eines Pferdes die Entwicklung und Validierung der Analysemethode. Im Hauptversuch wurde THG 10 Pferden appliziert. Während der Dauer der Versuche wurden den Pferden in festgelegten Zeitabständen Blutproben entnommen. Ebenfalls zeitlich kontrolliert wurde Spontanurin aufgefangen.

Die Plasma– und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Mittels High-Performance-Liquid- Chromatography/Tandem Mass Spectrometry (HPLC/MS/MS) wurden sie labortechnisch untersucht und die Ergebnisse pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen.

2.2 Versuchstiere

Für die Versuche wurde eine Gruppe von 10 Wallachen im Alter von 5 bis 9 Jahren verwendet. Es handelte sich dabei um 8 Warmblutpferde und 2 Vollblüter. Ihr mittleres Gewicht betrug 591 kg. Pferd 2 wurde sowohl im Vorversuch als auch im Hauptversuch eingesetzt, wobei zwischen diesen Versuchen ein zeitlicher Abstand von 4 Monaten lag. Rasse, Alter und Gewicht der einzelnen Tiere sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Pferd Rasse Gewicht (kg) Alter (Jahre)

1 Warmblut

586 9

2 Warmblut

614 9

3 Warmblut

670 9

4 Vollblut

449 5

5 Warmblut

568 9

6 Warmblut

630 9

7 Warmblut

568 9

8 Warmblut

620 9

9 Warmblut

638 9

10 Vollblut

564 9

Tabelle 2: Rasse, Alter und Gewicht der Versuchstiere

Die Pferde waren im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee in einem festen Herdenverband untergebracht. Die Gruppe wurde in einem Laufstall auf Stroh mit unbegrenztem Zugang auf ein Paddock sowie täglichem Weidegang gehalten. Morgens bekamen alle Tiere Hafer und Mineralfutter in Einzelfressständen. Die Menge der Ration richtete sich nach dem Ernährungs- und Trainingszustand des einzelnen Tieres. Tagsüber hatten alle Pferde ad libitum Zugang zu Grassilage und Wasser.

Alle Tiere waren entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Influenza geimpft. Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Zusätzlich wurden der Ernährungszustand, das Temperament und der klinische Gesamteindruck beurteilt. Alle Tiere waren klinisch unauffällig. Um zu gewährleisten, dass es nicht zu Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten kommt, wurde sichergestellt, dass den Tieren ab 4 Wochen vor Studienbeginn keine Medikamente mehr verabreicht worden waren.

2.3 Vorbereitung des Versuches

Im Zuge der Vorbereitung auf die Studie wurden alle Pferde darauf konditioniert, kurz nach dem Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles Spontanurin abzusetzen.

Dabei macht man sich das Phänomen zunutze, dass Pferde meist spontan „stallen“, sobald sie sich in mit Stroh eingestreuten Boxen befinden. Um dieses Verhalten zu verstärken, wurden die Tiere zuerst über mehrere Stunden ausgesperrt, dann in den Laufstall gelassen und für das Absetzen von Urin mit Futter belohnt. Im Laufe der Konditionierung konnten die Tiere so trainiert werden, dass ein Urinabsatz zeitgenau standfinden kann. Vor Beginn der Versuche wurde das Gewicht der Tiere mittels einer Zurich Tru-Test AG 500 Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) ermittelt. Nach der klinischen Allgemeinuntersuchung wurden den Pferden eine Braunüle MT^® (Braun, Melsungen) in die linke oder rechte Vena jugularis externa gelegt und mit einem Mandrin Vasofix^® (Braun, Melsungen) verschlossen.

Durch den Katheter in der Vena jugularis wurde vor der Applikation des THG mit fünf Monovetten^® (9 ml, Lithium heparinisiert, Sarstedt, Nümbrecht) eine Blutprobe von 45 ml entnommen. Zusätzlich wurde Spontanurin wurde aufgefangen. Beide Proben dienten als Nullproben.

2.4 Versuchsdurchführung

Die Substanz THG wurde von dem Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln hergestellt (Siehe Kapitel 2.4.2.2). Sie wurde in fester Form in einem verschlossenem Gefäß übergeben. Als Lösungsmittel diente Myglyol 812.

Da es für den Einsatz von THG keine Daten zur Dosierung gibt, diente als Berechnungsgrundlage Gestrinon, welches unter dem Handelsnamen Nemestran in der Schweiz als Humanarzneimittel zur Endometriosebehandlung zugelassen ist.

Hieraus ergab sich bei der Umrechnung auf das metabolische Körpergewicht des Pferdes eine Dosierung von 0,025 mg/kg KM. Hierbei wurde 1mg Gestrinon in 1ml Myglyol in Lösung gebracht. Dies geschah immer unmittelbar vor der Eingabe nach der Mengenangabe in Tabelle 3. Hierfür wurde zuerst die passend abgewogene

gleichmäßig auf die Gesamtmenge verteilt. Zur Applikation wurde die Lösung in eine sterile Einmalspritze überführt.

Pferd Dosis Applikationsvolumen (ml)

1 14,7 2 15,4 3 16,8 4 11,2 5 14,2 6 15,5 7 14,2 8 15,5 9 16,0 10

0,025 mg/kg KM

14,1

Tabelle 3: Dosierung von THG

2.4.1.2 Applikation

Die Applikation von THG erfolgte oral. Hierbei wurde die Substanz tief auf den Zungengrund oral eingebracht und das Abschlucken überprüft.

2.4.1.3 Abnahme und Verarbeitung der Proben

Über den Katheter in der linken Halsseite und ab Stunde 24 mittels Einmalkanülen wurden den Pferden Blutproben von je 45 ml entnommen Hierbei wurden Lithium- heparinisierte Monovetten^® benutzt.

Die Probenentnahmezeitpunkte sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Basierend auf den Ergebnissen des Vorversuches, unterscheiden sich die Probenzeitpunkte von Vor- und Hauptversuch.

Da die Blutentnahme pro Probe insgesamt etwa 30 Sekunden in Anspruch nahm, wurde 15 Sekunden vor der Probenentnahmezeit begonnen, so dass die Gesamtprobe die Konzentration zum exakten Zeitpunkt enthält.

In einem Zeitraum von 2 bis maximal 15 Minuten nach der Entnahme wurden die mit Vollblut gefüllten Monovetten^® bei 2500 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten zentrifugiert. Die Plasmafraktion wurde in Einmalspritzen (20 ml) mit aufgesetzter Kanüle gepoolt und nach mehrmaligem Schwenken in je drei Glasröhrchen (8 ml, Wheaton, Millvill) zu je 6 ml überführt. Um eine Verwechslung der Proben zu jedem Zeitpunkt zu verhindern, waren die Monovetten^® mit dem jeweiligen Pferdenamen

und der Probennummer beschriftet. Die Glasröhrchen zur Aufbewahrung des Plasmas wurden mit Etiketten gekennzeichnet, die mit den entsprechenden Codenummern bedruckt waren.

Nach der Überführung in die Plasmaröhrchen wurden alle Proben im Kühlschrank bei 8°C vorgekühlt, bevor sie am jeweiligen Versuchsabend in einen Kühlraum mit einer Temperatur von –20°C verbracht wurden.

Probenentnahmezeitpunkte Plasma Vorversuch (Std.)

Probenentnahmezeitpunkte Plasma Hauptversuch (Std.)

0,25 0,25 0,5 0,5 1 1 2 1,5 3 2 4 3 5 4 6 6 8 8 10 12 12 24 24 36 48 48

Tabelle 4: Probenentnahmezeiten Vorversuch und Hauptversuch Blut

Für die Gewinnung von Spontanurin wurden die Pferde von der Stallgasse oder dem Paddock mit Einzelhaltung in den Laufstall geführt.

Die Entnahmezeitpunkte im Vor- und Hauptversuch sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Probenentnahmezeitpunkte Urin Vorversuch (Std.)

Probenentnahmezeitpunkte Urin Hauptversuch (Std.)

4 3 8 6 12 9 24 12 36 24 48 48 72 72 96 96 120 120 144 144 168 192 192 240 240 288

Tabelle 5: Probenentnahmezeiten Vorversuch und Hauptversuch Urin

Für das Auffangen des Urins wurde eine Kunststoffhalterung verwendet, die an einem etwa ein Meter langen Stiel befestigt war und in die für jede Probe ein Einmalplastikbecher eingesetzt wurde. Dadurch konnte eine Kontamination der Proben verhindert werden. Nach Durchmischen durch Schwenken wurden 100 ml der Probe in ein etikettiertes Kunststoffgefäß überführt und verschlossen. Die Urinbehälter wurden im Kühlschrank auf 8°C heruntergekühlt und am jeweiligen Versuchsabend in einen Kühlraum mit –20°C eingelagert.

Der Transport der Plasma- und Urinproben in das Institut für Biochemie in Köln fand in gefrorenem Zustand statt, wobei eine Temperatur von –15°C nicht überschritten wurde.

Ergänzend wurden im Verlaufe der Probenzeitpunkte zu Zeitpunkt 0, 48, 144 Stunden Plasmaproben zur Bestimmung des Kreatininwertes entnommen, um die Nierenfunktion zu überprüfen. Sie wurden entsprechend den übrigen Plasmaproben aufgearbeitet und tiefgefroren. Die Analyse der Proben fanden in der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt.

2.5 Analytik

2.5.1 Methodenentwicklung

Da für die Untersuchung von Pferdeproben auf THG kein Analyseverfahren zur Verfügung stand, wurde im Rahmen dieser Studie eine Methode zur quantitativen Bestimmung von THG in Pferdeplasma und -urin entwickelt. Dafür wurden die Proben aus dem Vorversuch verwendet. Die Entwicklung und Validierung der Methode sowie die Messung der Proben aus dem Vor- und Hauptversuch erfolgte mit einem HPLC-System.

Zur Quantifizierung der Proben wurde mit einem HPLC/MS/MS-System (API 2000, Perkin Elmer Sciex Instruments, gekoppelt mit einem Agilent Series 1100 Liquid Chromatographen) gearbeitet.

2.5.1.1 Standardlösungen und Chemikalien

Für einen quantitativen Nachweis von THG in Plasma und Urin wurden Lösungen von THG und Gestrinon in unterschiedlichen Konzentrationen benötigt. Dazu wurde eine 0,01 ng/ml THG-Stammlösung in Methanol hergestellt. Weitere benötigte Verdünnungen wurden 1:10 mit Methanol hergestellt. Diese hatten Konzentrationen von 10 µg/ml und 1µg/ml. In gleicher Form wurde mit Gestrinon verfahren.

Abbildung 4: Strukturformel und Sollbruchstellen von Gestrinon und THG

O

C CH

CH₃CH₂ OH

262

241

CH₃CH₂ OH

CH₂ CH₃

241

266

Ebenso sind die bei der Analyse verwendeten Chemikalien in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Substanz Hersteller Tetrahydrogestrinon

Gestrinon

Institut für Biochemie, Köln Aventis Pharma AG

Nortestoteronglucuronidat D4-Androsteronsulfat

Institut für Biochemie, Köln Institut für Biochemie, Köln Aqua destilata

β-Glucuronidase von E.coli Ethylacetat

Kaliumcarbonat

Kaliumhydroxidplätzchen Methanol, destilliert

Natriumhydrogenphosphat Natriumdihydrogenphosphat N-Heptan

Phosphorpentoxid, Schwefelsäure

Tertiär-Butylmethylether, destilliert

Institut für Biochemie, Köln Boehringer Ingelheim, Ingelheim KMF,

Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt

Kraemer&Martin, ST. Augustin

THG liegt im Körper überwiegend nicht frei vor. Ein Nachweis mittels LC/MS/MS erfasst aber nur freies THG. Um die Gesamtfraktion von THG nachzuweisen, ist eine Aufarbeitung nötig. Hierbei werden Sulfate und Glucuronide, die an THG gebunden sind, abgespalten und die Gesamtfraktion frei. Um diese Arbeitsschritte (Solvolyse und Hydrolyse) zu überprüfen, wurde bei der Aufarbeitung im Urin, ein Standardgemisch aus Nortestoronglucuronidat und D4-Androsteronsulfat zugegeben.

Diese Substanzen zeigen nur nach erfolgreicher Aufarbeitung ein Signal im LC/MS/MS und stehen somit als Indikator für den Erfolg der Aufarbeitung. Zur Herstellung des Standardgemisches wurden 6,74 ng Nortestoteronglucoronid und 10,06 ng D4-Androsteronsulfat auf 10 ml Methanol aufgefüllt. Hiervon erfolgte eine weitere Verdünnung von 1:20 mit Methanol. Die entstandene Lösung wurde als Standardlösung verwendet und enthielt jeweils 50 µg/ml Nortestoronglucuronidat und D4-Androsteronsulfat.

2.5.1.2 Aufarbeitung der Plasmaproben

5 ml Plasma werden in ein Zentrifugenschliffgas gegeben. Der interne Standard wird hinzugegeben. Anschließend wird der pH-Wert auf 9,6 eingestellt. Dies geschieht gemäß dem Aufarbeitungsschema Abbildung 5.

Die Extraktion der Steroidfraktion erfolgt mit 5ml TBM-Ether für fünf Minuten auf einem Schüttler. Anschließend wird 5 Minuten bei 5619 g zentrifugiert und der Überstand, die organischen Phase, in Spitzgläser überführt. Nach Evaporation in der Vakuumzentrifuge zum Trocknen, erfolgt ein Anlösen und überführen der Substanz in Autosamplervials für die Messung mittels LC/MS/MS.

5ml Pferdeplasma

Zugabe 50 µl interner Standard Gestrinon

auf pH 9, 6 einstellen mit einer Spatelspitze K² CO³/NaHCO³ pH überprüfen mit Universalindikatorpapier

↓

Extraktion der Steroide mit 5 ml Tertiärmethylbutylether Schütteln für 5 Minuten

Zentrifugieren für 5 Minuten bei 5619 g

↓

Dekantieren der organischen Phase in Spitzgläser

↓

Evaporation in der Vakuumzentrifuge zum Trocknen

↓

Anlösen mit 100 µl Methanol Transfer in Autosamplervials

Messung mit LC/MS/MS

Abbildung 5: Prozedur zur Bestimmung THG im Pferdeplasma mittels LCMS/MS

2.5.1.3 Aufarbeitung der Urinproben

5 ml Urin werden in ein Zentrifugenschliffglas gegeben und interne Standardgemische werden zugegeben. Hierbei handelt es sich um Gestrinon, D4- Androsteronsulfat und Nortestoronglucoronidat. Zur Spaltung der Glukuronidkonjugate wird eine enzymatische Spaltung durchgeführt. Es werden 1ml Phosphatpuffer (0,8 mol/l) und 100 µl β-Glucuronidase (E.coli) zugegeben und der Urin für 180 min bei 50 °C im Wasserbad erwärmt.

Durch Zentrifugation bei 5619 g wird Sediment, welches den Adsorber verstopfen kann, abgetrennt. Der Überstand wird auf mit Methanol konditionierte und mit H2O gewaschene C18-Chromabond-Säulen gegeben. Nach der Absorbtion und einem Waschschritt mit 2 ml Wasser und 1,25 ml Methanol werden die Steroidsulfate und die hydrolysierten Steroide mit 1,25 ml Methanol von der Säule in Zentrifugenschliffgläser eluiert. Eine chemische Spaltung (Solvolyse) der Sulfate erfolgt nach Zugabe von 5 ml eines Gemischs von Ethylacetat mit H2SO4 60 Minuten bei 60 °C. Die Reaktion wird mit 0,75 ml 1 M KOH gestoppt und das Ethylacetat in der Vakuumzentrifuge abgedampft. Die Extraktion der gespaltenen Steroide erfolgt nach der Zugabe von 0,5 ml 1 M KOH gegen 5 ml TBM-Ether. Die Probe wird 5 min geschüttelt und bei 4619 g 5 min zentrifugiert. Die Steroide enthaltende organische Phase wird in Zentrifugenschliffgläser dekantiert und am Rotationsverdampfer (oder der Vakuumzentrifuge) bis zur Trocknung eingeengt. Der eingetrocknete Rückstand wird in 100µl Methanol gelöst, in Autosamplervials überführt und mittels LC/MS/MS gemessen. Im folgenden ist das Aufarbeitungsschema aufgeführt.

5ml Pferdeurin pH überprüfen

Auf pH 6.8 einstellen mit 1 ml Phosphatpuffer 0.8 M (17.3 g Na2HPO4 und 8.8 g NaH2PO4 in 203.9 g H2O)

pH überprüfen

↓ Zugabe

Interner Standard Gestrinon 50 µg

+D4-AndrosteronSulfat 1000 ng + Nortestoronglucoronidat 1000 µg

↓ Zugabe

100 µl ß-Glucuronidase von E.coli

↓

50°C für 180 min oder 37 °C über Nacht, Abkühlen lassen

↓

Zentrifugieren für 6 min bei 5619 g

Aufgabe des Überstandes auf gewaschene C18-Säule (Konditionierung : 1,25 ml MeOH, Waschen etwa 1 ml H2O)

Waschen mit 2 ml H2O (Unterdruck) (Waschen mit 0,25 ml MeOH!) Waschen mit 1,25 ml n-Heptan (Unterdruck)

↓

Übernacht Exsikator mit Phosphorpentoxid Elution mit 2 * 1 ml MeOH

Freie, Glukuronide und Sulfate : kombiniertes Eluat

↓ Zugabe

5 ml EtOAc/H2SO4 (250 ml/200µg = 10 Tropfen)

↓

60 ° C 60 min chemische Spaltung (Solvolyse)

↓ Zugabe 0.75 ml KOH 1M

20 min Evaporation bis nahe Trockne (Vakuumzentrifuge)

↓ Zugabe 0.5 ml KOH 1M

Extraktion der Steroide mit 5 ml TBM-Ether Schütteln für 5 min und Zentrifugieren für 5 min bei 5619 g

Dekantieren der organischen Phase Evaporation zu Trocknen Anlösen mit 100µl MeOH Transfer in Autosampler(spitz)vials

Messung mit LC/MS/MS

Abbildung 6: Prozedur zur Bestimmung THG im Pferdeurin mittels LCMS/MS

Bei der Aufarbeitung des Urins wurde ein weiteres Aufarbeitungsschema getestet und die Ergebnisse verglichen. Hierbei wurde die Extraktion der Steroide mit einer weniger polaren Substanz, als TBM-Ether, durchgeführt. Als Substanz diente hier N-Pentan. Hierfür wurde an einem Tag jeweils ein Kalibrationskurve mit den beiden Substanzen durchgeführt. Die Aufarbeitung bezüglich der Hydrolyse und Solvolyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.

2.5.1.4 HPLC/MS/MS

Bei der Messung der Proben wurde ein Flüssigkeitschromatograph verwendet. Es handelt sich um einen API 2000 triple-Quadropole von Applied Biosystems, gekoppelt an einen Agilent Series 1100 Liquid Chromatograph und Tandem- Massenspektrometer mit folgenden Parametern:

Flüssigkeitschromatograph:

Säule: Li Chro CART^® 55 x 4 Purospher^® STAR 18e, 3 µm (Merck, Darmstadt)

Eluenten: A = 5 mM Ammoniumacetat in H2O + 0,1% Eisessig

B = Acetonitril

Gradienten: 15 % B → 100 % B in 4 min., 2min bei 100 % B Reequilibrierung: 15 % B für 2,5 min.

Flussrate d. Gradienten: 500 µl/min.

Injektionsvolumen: 10 µl

Massenspektrometer:

Interface / Ionisierung: Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) Interface Temperatur: 400°C

Polarität: positiv

Mess-Modus: Multiple Reaction Monitoring (MRM)