High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Als Chromatographie bezeichnet man eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase, die nicht miteinander mischbar sind. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ist eine besonders schnelle und leistungsfähige Chromatographiemethode und trennt innerhalb von Minuten einen umfassenden Bereich von Stoffgruppen (SCHWEDT, 1986). Dazu gehören stark polare und ionische Substanzen, Substanzen mit hoher Molmasse sowie thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen (UNGER et al., 1995).

Es gibt verschiede Arten nach der die Flüssigkeitschromatographie arbeitet. Nach dem Prinzip der Adsorptionschromatographie funktioniert die klassische Säulen-

oder Dünnschichtchromatographie. Als stationäre Phase dient hier ein relativ polares Material mit hoher spezifischer Oberfläche, meist Kieselgel oder ähnliches. Die mobile Phase ist relativ apolar, z.B. Pentan. Die Trennung erfolgt durch unterschiedliche Adsorbtion der verschiedenen Molekülsorten im Gemisch an der stationären Phase. Polare Stoffe werden hierbei später eluiert als apolare. Bei der Umkehrphasenchromatographie ist das Prinzip genau ungekehrt. Die stationäre Phase ist sehr apolar und die mobile Phase ist polar, wie z.B. Wasser. Ein polares Lösungsmittel eluiert hier langsamer. Bei der Chromatographie an chemisch gebundene Phasen ist die stationäre Phase kovalent an das Trägermaterial gebunden. Durch die geeignete Wahl der Reaktionspartner lässt sich eine Vielzahl von stationären Phasen herstellen. Die oben genannte Umkehrphasenchromatographie ist der wichtigste Spezialfall der Chromatographie an chemisch gebundene Phasen.

Bei der Ionenaustauschchromatographie enthält die stationäre Phase eine ionische Gruppe. Diese tritt mit den Probenmolekülen in Wechselwirkung. Diese Methode ist z.B. für die Trennung von Stoffwechselprodukten und Aminosäuren geeignet. Für die Trennung von Ionen starker Säuren und Basen wurde die Ionenchromatographie entwickelt. Sie ist ein Spezialfall der Ionenaustauschchromatographie. Eine weitere Form ist die Gelchromatographie.

Man unterteilt sie in Gelpermeationschromatographie, geeignet für organische Lösungsmittel, und Gelfiltrationschromatographie für wässrige Lösungen. Diese Form der Chromatographie trennt die Substanzen nach Molekülmasse. Die größten Moleküle werden am schnellsten eluiert. Die Affinitätschromatographie basiert auf einer hochspezifischen biochemischen Wechselwirkung. Die Bindung kommt hier zu Stande, wenn räumliche und ladungsmäßige Voraussetzungen erfüllt sind. Dies ist bei einer Antigen-Antikörperreation der Fall.

Jede HPLC-Apparatur besteht aus einer Serie von Bausteinen, die miteinander gekoppelt sind. Ein sogenanntes chromatographisches System enthält folgende Bausteine:

Die stationäre Phase wird von einer sogenannten „Säule“, als langgestrecktes Trennbrett in einem Rohr gebildet. Das Innere der Trennsäule wird aus einem stabilen und dichten Verband aus kleinen, porösen Teilchen gebildet (Säulenbett), was eine große Oberfläche und hohe Druckstabilität garantiert (UNGER et al., 1995).

Die Trennsäule ist charakteristisch durch ihre Länge, ihren Innendurchmesser und

durch den mittleren Teilchendurchmesser des Packungsmaterials. Sie besteht aus einem Probenaufgabeteil, durch den auch die Zufuhr der mobilen Phase erfolgt, der chromatographischen Trennstrecke und dem Säulenende, das in den Detektor übergeht. Die Trennung der einzelnen Substanzen ist aufgrund ihrer unterschiedlichen Polaritäten mit unterschiedlichen Sorptions- und Desorptions-vorgängen auf der Säule möglich.

Die mobile Phase entspricht einem Lösungsmittelgemisch. Es wird infolge der Schwerkraft oder mittels einer Pumpe unter Überdruck aus dem Fließmittelreservoir in die Säule eingebracht. Möchte man ein Substanzgemisch mit verschiedenen polaren Substanzen trennen, so verwendet man zur Trennung die Gradientenelution.

Bei dieser Arbeitsweise wird die Fließmittelstärke kontinuierlich erhöht und damit die Empfindlichkeit der Detektion im hinteren Teil der Zeitachse erhöht (siehe Punkt 3.3.3.1).

Die Pumpe dient der Erzeugung eines konstanten und regelbaren Flusses des Lösungsmittels. Für analytische Säulen werden Volumina von 0,5 bis 5 ml/min angegeben.

Die Dosiervorrichtung oder das Einspritzsystem gibt reproduzierbar ein im Volumen wählbares, definiertes Aliquot des zu trennenden Gemisches (Probe) aus dem Probenröhrchen direkt in den Strom der mobilen Phase. So gelangen Probe und Lösungsmittel über das Probenaufgabeende in die thermostatierte Säule und werden durch sie hindurch geleitet (SCHWEDT, 1986).

Das Detektionssystem schließt sich der Säule direkt an und macht das chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Dabei ist das Signal proportional zur Menge der Substanz und wird in Abhängigkeit zur Zeit in Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm zeigt die Retentionszeit der Substanz sowie Höhe und Fläche des Peaks an. Die Retentionszeit entspricht der Zeitspanne von der Injektion bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Über den Vergleich der Fläche der Substanz zur Fläche des internen Standards kann auf die Konzentration der Probe geschlossen werden (MASSMANN, 2004).

In der vorliegenden Studie wurde das HPLC-System direkt mit einem Tandem-Massenspektrometer als Detektionssystem gekoppelt. Es ist sensibler und spezifischer als alle anderen flüssigkeitschromatographischen Detektoren und dient der Darstellung und Identifizierung von Substanzen. Die substanzspezifischen Fragmentierungsmuster lassen Rückschlüsse auf die Strukturformeln der zu

identifizierenden Substanzen zu, denn unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Das Massenspektrometer erzeugt nach der Trennung der Substanzen im Flüssigkeitschromatographen einen Strahl gasförmiger Ionen. Hierfür werden die Substanzmoleküle unter atmosphärischem Druck in für die Substanz charakteristische Ionen zerlegt und von den Molekülen des Lösungsmittels getrennt. Die in der Zeiteinheit gebildeten Mengen an Ionen bezeichnet man als Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt-ionenstrom (BUDZIKIEWICZ, 1998).

In dieser Studie wurde als Ionisationsverfahren die chemische Ionisation unter atmosphärischem Druck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) verwendet. Dabei wird der aus der HPLC-Säule austretende flüssige Eluent bei einer Temperatur von 350 bis 550°C in einer evakuierten Verdampfungskammer vernebelt.

An einer Glühkathode werden die gasförmigen Teilchen ionisiert und dem Massenspektrometer zugeleitet. In dem verwendeten Triple-Quadrupole-Massenspektrometer werden die Ionen dreimal hintereinander mittels Beschleunigung im elektrischen Feld nach Masse und Ladung getrennt und durch Kollision mit Stickstoffmolekülen in typische Fragmente zersprengt. Andere Ionen werden aus dem Feld hinaus in die Umgebung abgeleitet, was eine Aufreinigung und Konzentration der gesuchten Ionen bedeutet. Diese werden schließlich durch einen Kollektorspalt in einen Detektor geleitet und dort entladen. Die Ströme führen zur Aufzeichnung des Massenspektrums (BUDZIKIEWICZ, 1998). Dabei gibt das Massenspektrum alle Ionen eines Substanzgemisches, das „single ion monitoring“

(SIM) hingegen nur das ausgewählte Spektrum eines Ions an.

Die Analytik erfolgte in der vorliegenden Studie mittels Hochdruck-Flüssigkeits-chromatographie in Kombination mit einem Tandem-Massenspektrometer-System.