2 MATERIAL UND METHODE
4.3 Bewertung der Ergebnisse
Eine illegale Verwendung von THG als Dopingmittel ist aufgrund der einfachen Herstellung und der Verwendung dieser Substanz im Humanbereich durchaus denkbar. Mit dieser Arbeit wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von THG in Plasma und Urin entwickelt und validiert. Die Etablierung dieser Methode in die internationale Routinediagnostik kann zum vereinheitlichten Nachweis von THG in Dopingproben genutzt werden.
Bei der hier durchgeführten Studie sind die Nachweiszeiten als sehr kurz einzustufen. So war bei keinem der Pferde ein Urinnachweis von THG nach 2 Tagen möglich. Problematisch an dieser Aussage ist, dass aufgrund der relativ zur Gesamtpopulation noch immer geringen Anzahl von Versuchstieren, die ermittelten Daten nicht auf alle Pferde übertragen werden können. Es ist mit individuellen Schwankungen zu rechnen, die die dieser Studie noch deutlich übertreffen können.
Die Dosierung von THG ist in dieser Studie der des Gestrinons angelehnt. Es ist aber auch eine deutlich höhere Konzentration vorstellbar, da im Dopingbereich die therapeutische Dosis um bis zum 12-fachen überschritten wird (DE MARRES, 1996).
Hier muss mit längeren Ausscheidungszeiten gerechnet werden. Weiter gibt es keine Daten zur Dosierung von THG.
Da es bis zu diesem Zeitpunkt nur zwei Studien über die Wirkung von THG gibt, sind Folgestudien zur Wirkung am Pferd hierzu anzuraten. Hier bleibt vor allem die anabole Wirkung beim Pferd zu überprüfen. Nur so kann ein besserer Eindruck über die leistungssteigernde Wirkung von THG bekommen werden. Es gibt ebenfalls keine Erfahrungen über Nebenwirkungen und Langzeitschäden.
Genauso regen diese Ergebnisse dazu an, auch im Pferdesport über Trainingskontrollen nachzudenken. Da so kurze Nachweiszeiten es ermöglichen, bis kurz vor einem Wettkampf ein Präparat zu verabreichen, dem zum
Wettkampfzeitpunkt sehr wohl noch eine Wirkung zugerechnet werden muss, die Substanz selber aber nicht mehr nachweisbar ist.
Da THG keine Zulassung als Medikament besitzt, sondern gezielt zu Dopingzwecken synthetesiert wird, ist jeder positive Befund als Doping zu bewerten und eine verbotene Medikation ist auszuschließen. Dies ist unabhängig von der nachgewiesenen Konzentration.
5 ZUSAMMENFASSUNG
Markus Gerlach (2005):
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Stoffes Tetrahydrogestrinon hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer geeigneten Analysemethode für THG in Pferdeplasma und –urinproben. Basierend hierauf sollte das pharmakokinetische Verhalten von THG im Pferd untersucht werden.
Grundlage für die Entwicklung der Methode waren Vorarbeiten des Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln. Hier wurde THG in mit THG versetztem Blankurin nachgewiesen. Durch in einem Vorversuch gewonnene Proben wurde die Routinemethode zum Nachweis speziell modifiziert.
Sowohl im Vor- als auch im Hauptversuch wurde Pferden THG in einer Dosierung von 0,025 mg/kg KM einmalig oral verabreicht. Der Nachweis von THG im Plasma erfolgte über eine Festphasenextraktion. Für die Detektion im Urin wurde eine Aufarbeitung mit Solvolyse und Hydrolyse etabliert. Nach einer Einengung und Anlösen der Proben in Methanol wurden die gewonnenen Proben mittels einer HPLC/MS/MS-Methode gemessen und ausgewertet. Als interner Standard diente Gestrinon.
Die Validierung der Methode umfasste die Parameter Selektivität und Spezifität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Bestimmungsgrenze lag im Plasma bei 1,5 ng/ml und im Urin bei 15 ng/ml.
Maximale Konzentrationen von THG im Plasma wurden durchschnittlich nach 57 Minuten a. ermittelt und lagen zwischen 1,5 und 4,7 ng/ml. THG erreichte seine höchsten Konzentrationen von 38 bis 205 ng/ml im Urin 6 Stunden nach der Applikation. Die Nachweisgrenze wurde im Plasma nach 12 Stunden, im Urin nach 36 Stunden unterschritten.
Aufgrund der relativ zur Gasamtpopulation geringen Anzahl von Versuchstieren und beachtenswerter interindividueller Variabilität ist keine auf die Gesamtpopulation übertragbaren Aussage zu Ausscheidungszeiten zu treffen. Jeder Nachweis von THG muss daher als positiver Dopingbefund betrachtet werden.
Aufgrund der kurzen Ausscheidungszeiten sind hier Trainingskontrollen anzuraten.
6 SUMMARY
Markus Gerlach (2005):
Investigation of pharmacocinetic mechanisms of tetrahydrogestrinon with respect to ist relevance in horse-doping
The aim of this study was to develop and validate a suitabe method for the analysis of THG in equine plasma and urinesamples. Based on this facts the pharmacocinetic and pharmacodynamic parameters are examintanted.
The analytical method was based upon a study of the Institute of Biochemistry at the Deutsche Sporthochschule in Cologne, which were specially modified for THG using samples collected in a preliminary study. The horses in the preliminary experiment as well as in the main experiment received THG in a dose of 0,025 mg/kg body weight oral. The detection of detomidine in plasma was performed using a HPLC/MS/MS-method after extraction. The preparartion includes an hydrolysis and solvolysis.
Following evaporation of the liquid volume these samples were prepared for analysis in the HPLC/MS/MS. Gestrinon were used as internal standards.
The validation of the analytical method was performed on the parameters selectivity and specitivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of quantification was 1,5 ng/ml in plasma, 15 ng/ml for THG in urin samples.
Maximum concentrations of THG in plasma were detected 57 minutes p. a. within the range of 1,5 and 4,7 ng/ml plasma. THG in plasma samples was detectable for only 12 hours p. a..
Maximum concentrations of THG in urin were in a range between 38 and 208 ng/ml.
The maximum contratrations were detected after 6 hours. The concentration of THG were below the limit of detection after 36 hours.
Due to the fact that every animal experiment has to compromise in the number of animals included, therefore representing only a small part of the population, and with
regards to notable individual variation, no defined statement can be made for general excretion times. Every detection of THG must be counted as a positive doping result and should be punished according to the law.
7 LITERATURVERZEICHNIS
BAGGOT, J. D. (1978):
Some aspects of clinical pharmacocinetics in veterinary medicine I.
J. Vet. Pharmacol. Therap. 1, 5 – 18 BAGGOT, J. D. (1978):
Some aspects of clinical pharmacocinetics in veterinary medicine II.
J. Vet. Pharmacol. Therap. 1, 111 – 118
BERSCHNEIDER, F., u. W. RICHTER (1980):
Zur Geschichte und zum Begriff des Dopings im Pferdesport.
Mh. Vet.-Med. 35, 739 – 742 BUDZIKIEWICZ, H. (1998):
Massenspektrometrie – eine Einführung.
4. Auflage, Verlag Wiley-VCH, Weinheim,9 – 55 BUZBY, G., WALK, C., SMITH, H. (1966):
Anabol Steriods Ind. J. MED. CHEM., 9, 782
CATLIN, D., SEKERA, H., AHRENS, B., STARCEVIC, B., CHANG, Y.
u. HATTON, C. (2004)
Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine.
Rapid Commun. Mass Spectrom., 18 1245-1249 CROISIER, R. (1948):
Essay de defintion de doping.
Méd. Vétérin. Alfort, Diss
DE MAREES, H. (1996)
Sportphysiologie, Köln, Dissertation
DEATH, K., MCGRATH, K., KAZLAUSKAS, R. U. HANDELSMAN, D. (2004) Tetrahydrogestinone is a potent androgen and progestin.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 89:2498-2500 DEBACKERE, M. (1989):
Doping in race horses.
J. S. Afr. Vet. Ass. 60, 4 - 6
DERENDORF, H., T. GRAMATTE u. H. G. SCHÄFER (Hrsg.) (2002):
Pharmakokinetik: Einführung in die Theorie und Relevanz für die Arzneimitteltherapie.
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart
DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG e.V. (FN) (1994):
Leistungsprüfungsordnung (LPO).
Verlag FN, Warendorf, 55 - 59, 226 - 227
DIREKTORIUM FÜR VOLLBLUTZUCHT UND RENNEN E.V. (DVR) (2002):
Rennordnung (RO).
DVR, Köln, 127 - 136, 226 – 227 DOST, F. H. (1968):
Grundlagen der Pharmakokinetik.
2. Auflage, Verlag Georg Thieme, Stuttgart DUCHAINE, D. (1989)
Underground steroid handbook.
Technical books, Venice USA DÜE, M. (1998):
Doping bei Pferden.
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 105, 114 – 117
DYKE, T. M. (1993):
Pharmacocinetic values of drugs frequently used in performance horses.
Vet. Clin. N. Am.: Equine Pract. 9, 481 – 491 DYKE, T. M. u. R. A. SAMS (1994A):
Analytical methods used by racing laboratories: an international survey.
in: Proceedings of the 10th International Conference of Racing Analysts and Veterinarians, Stockholm, Schweden, 344 - 347
DYKE, T. M. u. R. A. SAMS (1994B):
Myths and realities in pharmacocinetic experiments.
in: Proceedings of the 10th International Conference of Racing Analysts Eisenber, S., BUIE, R. U. TOBIAN, L. (1950):
Adrenal cortical function in essential hypertension; a study of sweet sodium concentration.
American Journal of Medical Sciences 220, 287-289
EUROPEAN HORSERACE SCIENTIFIC LIAISON COMMITTEE – EHSLC (2002):
Guidelines for analysis of samples from pharmacocinetic studies – method validation.
in: Guidelines of EHSLC, 03. September 2002, The Jockey Club, Portman Square, London
FICHTL, B. (2001):
Arzneistoffkonzentration im Organismus in Abhängigkeit von der Zeit:
Pharmakokinetik im engeren Sinn.
in: Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxokologie, FORTH, W., D.
HENSCHLER, W. RUMMEL, U. FÖRSTERMANN u. K. STARKE (Hrsg.) 8. Auflage, Urban und Fischer Verlag, München
GLADTKE, E. u. H. M. VON HATTINGBERG (1977):
Pharmakokinetik.
2. Auflage, Verlag Springer, Berlin, Heidelberg, New York
GREENBLATT, R., JUNGCK, E. KING G. (1964):
Trenbolone.
Am. J. Med. Sci., 248, 317
HAUPTVERBAND FÜR TRABER-ZUCHT UND -RENNEN e.V. - HVT (2003):
Satzungen und Ordnungen des Hauptverbandes für TraberZucht und -Rennen e.V.
HVT, Kaarst, 45, 71 - 73
HEINZEL, G. u. P. TRANSWELL (1993):
Compartmental analysis methods manual.
in: HEINZEL, G., R. WOLOSZCAK u P. THOMANN (Hrsg.): Pharmacocinetic and pharmacodynamic data analysis system for the PC.
Verlag Fischer, Stuttgart, Jena, New York, 6 - 139 HERMLE, B. (1996):
Höchstleistungen durch Arzneimittel?
PTA heute 10, 1105 - 1110 KIETZMANN, M. (1983):
Einführung in die Kinetik für die Praxis.
Prakt. Tierarzt 7, 577 – 584 KLAUS, A.-M. u. H.J. HAPKE (1994):
Die Dopingproblematik im Pferdesport – Pharmakokinetik ausgewählter dopingrelevanter Antiphlogistika/Analgetika.
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 101, 331 – 338 KLOTZ, U. (1988):
Einführung in die Pharmakokinetik.
Govi Verlag, Frankfurt
KOCH, H. P. u. W. A. RITSCHEL (Hrsg.) (1986):
Synopsis der Biopharmazie und Pharmakokinetik.
Ecomed Verlagsgesellschaft mbH, Landsberg, München
LABRIE, F., LUU-THE, V., CALVO, E., MARTEL, C., CLOUTIER, J., GAUTHIER, S., BELLEAU, P., MORISSETTE, J., LEVESQUE, M. u. LABRIE, C. (2005)
Tetrahydrogestinone induces a genomic signature typical of a potent anabolic Steroid.
Journal of Endocrinology, 184, 427-433
LEVESQUE,J-F., TEMPELTON, E., TRIMPLE, L., BERTHELETTE, C.
U. CHAURET N. (2005) :
Discovery,Bbiosynthesis, and Structure Elucidation of Metabolites of a Doping Agent and a Direct Analogue, Tetrahydrogestrinone and Gestinone, Using Human Hepatocytes.
Anal. Chem. 77, 3164-3172 LÖSCHER, W. (2002):
Pharmakologie des vegetativen (autonomen) Nervensystems.
in: FREY, H. H. u. W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin.
MASSMANN, S. (2004):
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Dembrexin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation MORGAN, C. E. (1957):
Drug administration to racing animals.
J. Amer. veterin. med. Assoc. 130, 240 MÜLLER, R. K. (1999):
Doping und Toxikologie.
Naturw. Rdsch. 52, 259 – 263
PICK, M. (1993):
Doping im Pferdesport und die Problematik für den behandelnden Tierarzt.
Prakt. Tierarzt 7, 613 - 620 PROKOP, L. (1965):
The problem of doping.
J. sport. reed. 5, 88
ROBINSON, R.A. u. B. GORDON (1988):
American Association of Equine Practioners track break down studies – horse results.
in: Proceedings of the 7th International Conference of Racing Analysts and Veterinarians, Louisville, Kentucky, 385 – 395
SAMS, R. (1996):
Pharmacocinetic studies of drugs in racehorses.
in: Proceedings of the 11th International Conference of Racing Analysts and Veterinarians, Queensland, Australia, 345 – 354
SCHÄNZER, W. u. I. SEINSCH (1997):
Die Problematik der Medikamentenanwendung bei Sportpferden aus der Sicht des untersuchenden Labors.
Prakt. Tierarzt, coll. Vet: XXVI, 51 - 55 SCHOENE, C. (1996):
Doping beim Pferd.
Verlag Enke, Stuttgart SCHWEDT, G. (1986):
Chromatographische Trennmethoden.
Verlag Thieme, Stuttgart, New York, 52 – 94
THEWIS, M., BOMMERICH, U., OPFERMANN, G. u. SCHÄNZER, W. (2005)
Characterizaation of chemicaly modified steroids for control purposes by electrospray ionization tandem mass spectrometry.
J. Mass Spectrom., 40, 494-502
THEWIS, M., GEYER, H., MARECK, U. u. SCHÄNZER, W. (2005)
Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectromety.
J. Mass Spectrom., 40, 955-962 TOBIAS, S. (2004):
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation TOBIN, T. (1981):
Drugs and the performance horse.
Verlag Thomas, Springfield, Illinois TOBIN, T. u. T. WOOD (1989):
The effects of drugs on race horse performance.
in: Proceedings of the Annual Convent of the American Association of Equine Practioners 34, 639 – 650
UNGEMACH, F. R. (1985):
Dopingkontrolle bei Rennpferden.
Tierärztl. Praxis 13, 35 – 53 UNGEMACH, F.R. (1988):
Doping im Pferdesport.
in: Handbuch Pferd, Fachredaktion P. THEIN Verlag BLV, München, Wien, Zürich, S. 869 – 884
UNGEMACH, F. R. u. M. CH. NÜRNBERGER (1999):
Doping im Pferdesport.
in: DIETZ, O. u. B. HUSKAMP (Hrsg.): Handbuch Pferdepraxis.
Verlag Enke, Stuttgart, S. 65 – 80 UNGER, K. K. u. E. WEBER (1995):
Handbuch der HPLC Teil 1: Leitfaden für Anfänger und Praktiker.
Verlag GIT, Darmstadt, 2 – 10
WATERSON, R., LINDBLAD-TOH, K., BIRNEY, E., ROGERS, J.
u. AGARWAL, P. (2002):
Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.
Nature 420, 520-562
8 ANHANG
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 17: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 1 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Zeit in Stunden
Konz in ng/ml
Abbildung 18: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 2 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 19: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 3 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 20: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 4 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in tTd.
Konz. in ng/ml
Abbildung 21: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 5 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
0 2 4 6 8 10 12
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 22: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 6 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 23: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 7 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 24: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 8 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
0 1 2 3 4 5 6
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 25: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 9 nach einmaliger oraler Gabe von
0,025 mg/kg KM
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
0 10 20 30 40 50 60
Zeit in Std
Konz in ng/ml
Abbildung 26: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 10 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM
Pferd Entnahmezeitpunkt in Stunden Kreatininwerte in Umol/l
Tabelle 17: Kreatininwerte der Pferde 1-10 nach einmaliger oraler Dosis von 0,025 mg/kg KM THG zum Zeitpunkt 0; 44; 144 Stunden
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für das Überlassen des Themas, die stete Unterstützung und die außerordentlich gute Betreuung zu jedem Zeitpunkt.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln, wo insbesondere Herr Prof. Dr. W.
Schänzer, Dr. Marc Machnik, Dr. Mario Thevis, Herrn Opfermann und Sven Guddert durch ihren fachlichen Beistand und die freundliche Aufnahme und Unterstützung im Labor zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein Dank gilt weiterhin der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. in Warendorf, im Besonderen Herrn Dr. Michael Düe für die Organisation der Versuchspferde und die Finanzierung.
Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff der FAL Mariensee für die freundliche und bereitwillige Überlassung der Versuchspferde und Einrichtungen der FAL, sowie Herrn Jonny Meyer für seine unersetzliche Hilfe mit den Pferden und Allem was dazugehörte.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinen Großeltern, durch die ich große Unterstützung in mein Studium, dieser Arbeit und unzählige andere Dinge in meinem Leben erhalten habe. Dies alles wäre ohne Euch nicht möglich gewesen.
Für die liebevolle und moralische Unterstützung und besonders für die Tatsache, dass Du mit mir in dieser stressigen Phase meines Lebens eine so tolle Partnerin bist, möchte ich mich besonders herzlich bei Tanja bedanken.
Schließlich danke ich auch allen Freunden, Bekannten und Verwandten, die immer an meiner Seite waren, auch wenn ich zeitlich sehr eingespannt war. An dieser Stelle danke ich auch Inga für die gute und zuverlässige Zusammenarbeit.