der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Detomidin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Severine Tobias (geb. Gerber) aus Stadthagen
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 25.November 2004
„Mit dem Doping ist es genauso wie mit der Liebe.
Jeder weiß, was es ist, aber niemand vermag es klar zu umschreiben.“
Anonym
Meiner Mutter & Christoph
in Liebe und Dankbarkeit
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Doping... 3
2.1.1 Definition und Geschichtliches ... 3
2.1.2 Notwendigkeit der Dopingbestimmungen... 4
2.1.3 Doping im Pferdesport... 5
2.1.3.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände ... 7
2.1.3.2 Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. (Stand 2004) ... 7
2.1.3.3 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (Stand Januar 2002) ... 8
2.1.3.4 Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –Rennen e. V. (HVT) vom 01. Februar 2003... 8
2.1.4 Dopingformen... 9
2.1.4.1 Positives Doping... 9
2.1.4.2 Negatives Doping oder Doping auf Niederlage ... 11
2.1.4.3 Unabsichtliches Doping ... 11
2.1.4.4 Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises... 12
2.1.5 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in Deutschland ... 13
2.1.6 Beurteilung von Analyseergebnissen ... 13
2.1.6.1 Null-Lösung und Grenzwerte... 13
2.2 Physiologie und Pharmakologie von α2-Rezeptoren ... 16
2.2.1 Rezeptorklassifizierung ... 17
2.2.2 α2-Agonisten und Antagonisten beim Pferd... 17
2.2.3 Wirkungsmechanismus ... 18
2.2.4 α2-Antagonisten... 19
2.3 Detomidin ... 20
2.3.1 Chemie... 20
2.3.2 Pharmakokinetik... 21
2.3.3 Pharmakodynamische Wirkung... 22
2.3.4 Applikationsformen... 27
2.3.5 Klinische Anwendung von Detomidin ... 27
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.6 Einsatz von Detomidin im Pferdesport zur Beeinflussung der
Leistung... 27
2.4 Analytik... 28
2.5 Analytischer Nachweis von Detomidin ... 29
2.5.1 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem- Massenspektrometer (MS/MS)... 29
2.6 Pharmakokinetik... 32
2.6.1 Allgemeine Pharmakokinetik ... 32
2.6.2 Eliminationskinetische Parameter ... 36
3 Material und Methoden... 38
3.1 Versuchsplanung ... 38
3.2 Versuchsdurchführung ... 38
3.2.1 Versuchstiere ... 38
3.2.2 Konditionierungsphase und Vorbereitung des Versuches... 40
3.2.2.1 Substanz und Dosierung ... 42
3.2.3 Applikation des Medikamentes (Vor- und Hauptversuch)... 42
3.2.4 Erhebung der Messdaten ... 43
3.2.4.1 Abnahme, Verarbeitung und Aufbewahrung der Blutproben ... 43
3.2.4.2 Herzfrequenz... 44
3.2.4.3 Atemfrequenz ... 45
3.2.4.4 Körpertemperatur ... 45
3.2.4.5 Feststellung des Sedationsgrades ... 45
3.2.4.6 Überprüfung der Analgesie... 47
3.2.4.7 Andere Beobachtungen... 51
3.2.4.8 Gewinnung, Messung und Aufbewahrung von Urinproben ... 51
3.2.4.9 Transport der Plasma- und Urinproben ... 52
3.3 Analytik... 52
3.3.1 Methodenentwicklung Plasma und Urin ... 52
3.3.1.1 Herstellung der Standardlösungen im Plasma ... 53
3.3.1.2 Herstellung der Standardlösungen im Urin... 54
3.3.1.3 Variation der Messmethode... 55
3.3.1.4 Variation der Aufarbeitung und Extraktionsmethode ... 56
3.3.2 Validierung der Methode in Plasma und Urin ... 59
3.3.2.1 Selektivität und Spezifität ... 59
3.3.2.2 Überprüfung auf Linearität... 60
3.3.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection = LOD) ... 61
3.3.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification = LOQ oder Sensitivität)... 62
3.3.2.5 Richtigkeit (Accuracy)... 62
3.3.2.6 Präzision... 63
3.3.2.7 Stabilität... 64
3.3.2.8 Wiederfindung (Recovery)... 65
3.3.3 Chromatographische Trennung und Detektion von Detomidin und seinen Metaboliten ... 66
3.3.3.1 Gerät und Gerätebedingungen... 66
3.3.3.2 Reagenzien und Lösungsmittel ... 68
3.3.4 Messung der Proben aus dem Hauptversuch ... 69
3.3.4.1 Erstellung der Kalibrationskurven im Plasma des Hauptversuches ... 69
3.3.4.2 Erstellung der Kalibrationskurven im Urin... 71
3.3.4.3 Aufarbeitung der Plasmaproben... 73
3.3.4.4 Aufarbeitung der Urinproben ohne und mit Hydrolyse... 74
3.4 Pharmakokinetische Auswertung (Methode und Software)... 80
3.5 Statistische Auswertung ... 81
4 Ergebnisse ... 82
4.1 Massenspektren und Strukturformeln der zu analysierenden Substanzen und der internen Standards... 82
4.1.1 Detomidin ... 82
4.1.2 3-Hydroxydetomidin ... 83
4.1.3 Medetomidin... 83
4.1.4 Carboxydetomidin ... 84
4.1.5 Imidazolylbenzoesäure... 85
4.2 Ergebnisse der Validierung ... 85
4.2.1 Selektivität und Spezifität ... 85
4.2.2 Überprüfung auf Linearität... 87
4.2.3 Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD) ... 90
4.2.4 Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) ... 90
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.5 Richtigkeit (Accuracy)... 91
4.2.6 Präzision ... 92
4.2.7 Stabilität ... 94
4.2.8 Wiederfindung (Recovery)... 95
4.3 Ergebnisse des Hauptversuchs... 96
4.3.1 Konzentration von Detomidin im Plasma... 96
4.3.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma ... 100
4.3.3 Detomidin im Urin... 102
4.3.4 3-Hydroxydetomidin im Urin ... 102
4.3.4.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergleichend ... 104
4.3.5 Carboxydetomidin im Urin ... 105
4.3.5.1 Aufarbeitung mit und ohne Hydrolyse vergeichend ... 107
4.4 Berechnung der irrelevanten Plasma- und Urin-konzentrationen... 108
4.5 Berechnung von Ausscheidungszeiten ... 110
4.6 Pharmakodynamik von Detomidin... 113
4.6.1 Herzfrequenz... 113
4.6.2 Atemfrequenz... 115
4.6.3 Körperinnentemperatur ... 116
4.6.4 Grad der Sedation ... 117
4.6.4.1 Ptosis... 118
4.6.4.2 Akustischer Reiz... 120
4.6.4.3 Visueller Reiz ... 121
4.6.4.4 Individueller Sedationsgrad der einzelnen Pferde ... 122
4.6.5 Grad der Reaktion auf einen definierten Stromreiz ... 123
4.6.6 Andere Beobachtungen... 125
5 Diskussion ... 126
5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Detomidin und seinen Metaboliten in Plasma und Urin... 126
5.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma ... 129
5.3 Pharmakokinetik von Detomidin im Urin... 131
5.4 Effektive und irrelevante Plasmakonzentration, irrelevante Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002), Ausscheidungszeit ... 134
5.5 Vergleich der pharmakodynamischen Daten mit den Ergebnissen der
pharmakokinetischen Berechnungen ... 137
5.6 Bewertung der Ergebnisse ... 142
6 Zusammenfassung ... 144
7 Summary ... 146
8 Literaturverzeichnis... 148
9 Anhang ... 163
Danksagung ... 173
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb. Abbildung
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation AUC Area under the curve
b1 Geschwindigkeitskonstante der Elimination
C Konzentration
Cl Clearance
Cmax(gem) maximale gemessene Plasmakonzentration
CPlasmaØ durchschnittlichePlasmakonzentration CUrinØ durchschnittlicheUrinkonzentration
D Dosierung
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen
EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee EPC effektive Plasmakonzentration
FEI Fédération Équestre International
FN Fédération National, Deutsche Reiterliche Vereinigung e.
V., Warendorf g Gramm
GC Gaschromatographie
h Stunde
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HQC High Quality Control Standard
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V.
HWZ Halbwertszeit
i. m. intramuskulär
IPC irrelevante Plasmakonzentration
ISTD interner Standard
IUC irrelevante Urinkonzentration
i.v. intravenös
kg Kilogramm
KM Körpermasse
l Liter
ln natürlicher Logarithmus
LOD Limit of detection
LOQ Limit of quantification
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Lower Quality Control Standard
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
m Meter
max. maximal
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mmol Millimol
MM Molekülmasse
MQC Midrange Quality Control Standard
MRT Mean Residence Time, mittlere Verweildauer
MS Massenspektrometrie
m/z Quotient aus Masse und Ladung
ng Nanogramm
p. a. post applikationem
PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch
QC Qualitätskontrolle
R2 Regressionskoeffizient
RE relativer Fehler, relative Abweichung
RO Rennordnung des DIR
Rss Urin/Plasmaverhältnis im steady state
S Standardabweichung
SIM single ion monitoring t Zeit
t50(b1) Halbwertszeit für die Eliminationsphase
tA(IPC) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC tA(LOD) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOD tA(LOQ) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOQ
Tab. Tabelle
tmax(gem) Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration Vc Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment
Vss Verteilungsvolumen im steady state
1 EINLEITUNG
Detomidin ist ein potenter α2-Agonist mit starken sedativen und analgetischen Eigenschaften (JÖCHLE u. HAMM, 1986). Es hat weite klinische Anwendung in Europa und den USA gefunden. Durch die komplikationslose therapeutische Anwendbarkeit steht Detomidin im Verdacht, nicht nur nach tierärztlicher Indikation, sondern auch illegal vor Wettkämpfen verabreicht zu werden. Dabei ist besonders an nervöse und ängstliche Tiere sowie den Einsatz beim Doping auf Niederlage zu denken (WOOD et al., 1989; SEYMOR et al., 1990B).
Der Einsatz von Detomidin unmittelbar vor einem Wettkampf ist durch die Bestimmungen der großen deutschen Pferdesportverbände und des Tierschutzgesetzes verboten. Die Deutsche Reiterliche Vereinigung, das Direktorium für Vollblutzucht und der Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen verbieten nahezu jede Anwendung pharmakologisch wirksamer Stoffe in einem Wettkampf, auch wenn eine therapeutische Indikation besteht. Nur für einige wenige Substanzen, für die Grenzwerte festgelegt wurden, gelten Ausnahmen. Die Problematik besteht in der Unterscheidung zwischen der Verabreichung von Arzneimitteln im Rahmen der tierärztlichen Therapie und einem vorsätzlichen Einsatz dieser Substanzen im Sinne des Dopings. Auch wenn keine bewusste Leistungsbeeinflussung vorliegt, ist der Nachweis eines verbotenen Stoffes dopingrelevant. Aufgrund der fast unüberschaubaren Vielfalt des Arzneimittelmarktes und wegen des häufig noch lückenhaften Wissens über Pharmakokinetik und Pharmakodynamik ist es für Tierärzte, die Sportpferde behandeln, häufig schwierig, alle möglichen Folgewirkungen einer Arzneimittelanwendung im Hinblick auf die Dopingbestimmungen zu überblicken (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
Aufgrund dieser Problematik wurde im Rahmen dieser Arbeit das Ausscheidungsverhalten der Wirkstoffes Detomidin bei der Spezies Pferd untersucht.
Die Studie ist Teil eines europaweiten Vorhabens, an dem insgesamt fünf Länder (Irland, Frankreich, Italien, Großbritannien, Deutschland) teilnehmen. Neben der Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für Detomidin ist die internationale
2 EINLEITUNG
Harmonisierung der Analysemethoden ein zusätzlicher Kernpunkt des Projekts. Das Ziel dieser Untersuchung war die Erarbeitung einer geeigneten Analysemethode und die Gewinnung validen Datenmaterials zur Abschätzung der Ausscheidungszeit von Muttersubstanz und Metaboliten. Grundlage für die Entwicklung der HPLC/MS/MS- Analysemethode waren Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln. Die pharmakokinetische Studie wurde begleitet von der zeitabhängigen Erfassung der pharmakodynamischen Wirkung anhand geeigneter Parameter (PK/PD-Modell). Diese Kombination ermöglichte einen direkten Vergleich von Detomidinkonzentration in Plasma und Urin zur pharmakologischen Wirkung am Pferd.
Einen theoretischen Ansatz zum Vergleich verfolgt das pharmako- kinetische/pharmakodynamische Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002). Die durch diese Arbeit ermittelten pharmakokinetischen Daten wurden verwendet, um Plasma- und Urinkonzentrationen zu errechnen, bei denen keine relevante pharmakologische Wirkung mehr zu erwarten ist.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Doping
2.1.1 Definition und Geschichtliches
UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) definierten den Begriff des Dopings als „die Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel einer Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen“. Dopingfälle bei Tieren stellen vor allen Dingen ein Problem bei den Tierarten Pferden, Hunden und Reisetauben dar.
Das Wort „Doping“ stammt aus dem Niederländischen, wo das Verb „doopen“
eintauchen beziehungsweise tauchen bedeutet (DEBACKERE, 1989). Von dort aus gelangte der Begriff durch die Buren nach Südafrika und bezeichnete einen hochprozentigen, dickflüssigen Likör (Dop), der von den Bantus in Südostafrika als Stimulans bei religiösen Feierlichkeiten getrunken wurde (BERSCHNEIDER u.
RICHTER, 1980). Erst später wurde der Begriff auf andere stimulierende Getränke ausgedehnt (PROKOP, 1965). In den amerikanischen Sprachgebrauch übergegangen, beschrieb „to dope“ später das trickreiche Betäuben und anschließende Ausrauben von Reisenden (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980).
Durch den Bezug zum Rauschgift erschien der Begriff „Doping“ 1899 das erste Mal in einem englischen Wörterbuch, wo es als ein Gemisch aus Opium und Narkotika zur Verabreichung an Pferde bezeichnet wurde (HERMLE, 1996). Damit hatte sich das Wort Doping im internationalen Sprachgebrauch als Begriff für die missbräuchliche Einnahme von Mitteln zur Leistungssteigerung und damit Wettbewerbsbeinflussung durchgesetzt.
Die ersten Hinweise auf den Gebrauch solcher Mittel gehen bis in das Altertum zurück. Damals versuchten Krieger durch Drogen und zusätzliche Nährstoffe ihren Gegnern überlegen zu sein (CROISIER, 1948), und auch Pferde wurden dem Einfluss leistungssteigernder Mittel ausgesetzt. Aus dem alten Rom ist bekannt, dass eine als „Hydromel“ bezeichnete wässrige Honiglösung zur Verbesserung der
4 LITERATURÜBERSICHT
Geschwindigkeit und Ausdauer bei Rennpferden verabreicht wurde (MORGAN, 1957; PICK, 1993). Um vermeintliche Konkurrenten aus dem Weg zu schaffen, wurden Wagenrennpferde vergiftet (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980), was im kaiserlichen Rom mit der Strafe der Kreuzigung belegt wurde. UNGEMACH (1985) beschreibt, dass 1881 in Preußen alkoholische Lösungen an „feige“ Pferde verabreicht wurden.
Die ersten Dopingreglementierungen wurden am 14. Juni 1666 in England verabschiedet. In dieser ersten „Anti-Doping-Bestimmung“ wurde die Anwendung anregender Stoffe bei Pferden verboten, wobei diese aber nicht näher definiert wurden (CROISIER, 1948). Eine zielgerichtete Bekämpfung des Dopings setzte erst im 20. Jahrhundert ein, da es einerseits durch die Entwicklungen im Arzneimittelbereich möglich war, immer gezielter zu manipulieren und andererseits die Analytikmethoden für den Nachweis unerlaubter Substanzen stetig verbessert wurden (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
2.1.2 Notwendigkeit der Dopingbestimmungen
Es ist unumgänglich, Tiere, die in der Obhut des Menschen leben und in allen Hinsichten von ihm abhängig sind, vor Schmerzen, Leiden und Schäden zu bewahren. Die gesetzliche Grundlage hierfür bilden das Grundgesetz und das Tierschutzgesetz in seiner Fassung von Juni 2001.
Artikel 20a des Grundgesetzes wurde am 17.Mai 2002 nach langen Diskussionen erweitert und lautet nun: „Der Staat schützt auch in Verantwortung für die künftigen Generationen die natürlichen Lebensgrundlagen und die Tiere im Rahmen der verfassungsmäßigen Ordnung durch die Gesetzgebung und nach Maßgabe von Gesetz und Recht durch die vollziehende Kraft und Gewalt und die Rechtsprechung.“
Dadurch garantiert das Grundgesetz nun nicht mehr nur die Rechte der Menschen, sondern auch den Schutz der Tiere und steht damit im Synergismus zum Tierschutzgesetz.
Dort ist es nach § 3, Absatz 1 „verboten, einem Tier außer in Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen es wegen seines Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist oder die offensichtlich seine Kräfte übersteigen“. Absatz 1a verbietet es, einem Tier Leistungen abzuverlangen, wenn an ihm Eingriffe oder Behandlungen vorgenommen worden sind, die einen leistungsmindernden körperlichen Zustand verdecken.
Absatz 1b untersagt klar, „an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen [...]
Dopingmittel anzuwenden“. Absatz 11 nimmt Bezug auf das physikalische Doping und verbietet sogar „ein Gerät anzuwenden, das durch elektrische Reize das artgerechte Verhalten des Pferdes beeinflusst und insbesondere [...]
außergewöhnliche Bewegungen erzwingt, die dem Tier Schmerzen, Leiden oder Schäden zufügen können“. Nach § 17 Tierschutzgesetz kann die Anwendung von Dopingmitteln als Straftat gewertet werden, wenn einem Wirbeltier länger anhaltende und sich wiederholende Schmerzen zugefügt werden. Dem Berufsstand der Tierärzte kommt hierbei eine besondere Bedeutung zu, da sie schon laut ihrer Berufsordnung die „berufenen Schützer der Tiere“ sind. Somit stellen sie ein Bindeglied zwischen Sport und Tierschutz dar.
Neben dem Aspekt des Tierschutzes ist es Sinn und Zweck der Anti-Doping–
Bestimmungen zu gewährleisten, dass der sportliche Vergleich unter gleichen Bedingungen für alle Teilnehmer abläuft und somit der ethische Sportgedanke erhalten bleibt (PICK, 1993). Weitere Gesichtspunkte sind der Schutz vor einer Gefährdung anderer Teilnehmer oder Pferde durch gedopte Tiere (UNGEMACH, 1985), der Schutz der Interessen des wettenden Publikums (KLAUS u. HAPKE, 1994), die Vermeidung einer falschen Zuchtauslese (PICK, 1993) und der Schutz des Ansehens der Sportart (PICK 1993).
2.1.3 Doping im Pferdesport
Doping im Pferdesport ist ein internationales Problem. Bereits 1977 definierte die internationale Konferenz der westlichen Pferdesportverbände in Rom, dass alle Substanzen äußeren Ursprunges, auch wenn sie im Pferd natürlicherweise
6 LITERATURÜBERSICHT
vorkommen können, verboten sind, wenn sie zu den in einer Dopingliste veröffentlichten unerlaubten Mitteln zu rechnen sind (UNGEMACH, 1985).
Auf einem Kongress in Kentucky 1994 wurden spezifische Fragestellungen zur Analytik von Dopingproben im Bereich des Pferdesports diskutiert und speziell die Zusammenarbeit aller Pferdesportverbände gefordert. Die Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI) stellt dabei einen internationalen Pferdesportverband dar, dem mit Deutschland 111 Nationen angeschlossen sind (DÜE, 1998). So wird ausgeführt, dass es „der Sinn aller FEI-Wettkämpfe ist, die Talente von Pferden und Reitern im Vergleich unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten durchzuführen. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung beeinflussen oder ein vorliegendes Gesundheitsproblem überdecken und zusätzlich das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen. Daher ist die Liste der verbotenen Substanzen so zusammengesetzt worden, dass sie alle Kategorien pharmakologischer Wirksamkeit umfasst“. Als verbotene Substanzen gelten die Substanz selbst, ihre Metaboliten, ihre Isomere oder die Isomere der Metaboliten, unabhängig davon, ob die Substanz auch endogen im Pferd vorkommt. Damit ist praktisch jede Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit der Teilnahme am Wettkampf nicht statthaft, unabhängig davon, ob dadurch eine Leistungsbeeinflussung möglich ist oder nicht (KLAUS u. HAPKE, 1994).
In Deutschland wird die Verabreichung von Substanzen über die Leistungsprüfungsordnungen der drei großen deutschen Pferdesportverbände (Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V. [FN], Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. [DVR] und Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e. V. [HVT]) geregelt. Besonders seitens der FN wird eine möglichst große Übereinstimmung mit den Bestimmungen der FEI angestrebt, aber auch DVR und HVT stimmen hinsichtlich des generellen Verbots jeglicher körperfremder Substanzen mit der FN überein.
Nachfolgend werden Ausschnitte aus den Dopingbestimmungen der einzelnen deutschen Pferdesportverbände dargestellt.
2.1.3.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände
2.1.3.2 Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. (Stand 2004)
Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt A VIII, §§ 66 – 67a.
§ 66 verbietet die Teilnahme von Pferden und Ponys nach zum Beispiel Neurektomie, lokaler Schmerzausschaltung, implantiertem Tracheotubus oder sonstigen Eingriffen beziehungsweise Manipulationen, die zur Beeinflussung der Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft geeignet sind.
In § 67 werden Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferdekontrollen in Prüfungen geregelt, wobei sich detaillierte Anweisungen zu deren Ablauf in den angehängten Durchführungsbestimmungen finden. Ebenfalls in den Durchführungsbestimmungen geregelt ist die Ahndung bei Nachweis einer gemäß § 67a LPO verbotenen Substanz. Platzierte, positiv getestete Teilnehmer werden disqualifiziert, der Verstoß nach den Bestimmungen der Rechtsordnung der LPO geahndet und es besteht die Möglichkeit, die Tat als Verstoß gegen das Tierschutzgesetz der zuständigen Behörde zu melden.
§ 67a enthält die Liste der kontrollierten Substanzen. Dabei wird zwischen „Punkt 1 Dopingsubstanzen“ und „Punkt 2 Verbotene Arzneimittel“ unterschieden, sowie unter Punkt 3 die Ausnahmen hiervon geregelt.
Hierbei werden Dopingsubstanzen als Substanzen bezeichnet, die geeignet sind, die Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Dabei werden nicht einzelne Arzneimittel, sondern Stoffgruppen wie zum Beispiel Sedativa und Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder Anabolika aufgeführt. Lediglich für einzelne Substanzen (Testosteron, Nandrolon, Theobromin und Cortisol) gelten Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt 2.1.7.1) .
8 LITERATURÜBERSICHT
Auch die verbotenen Arzneimittel sind nicht einzeln, sondern als ganze Stoffgruppen reglementiert. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die zwar als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind (zum Beispiel solche mit Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System, auf das Atmungssystem, auf die Haut, gegen Infektionserreger). Auch hier gibt es nur für wenige Mittel (Salizylsäure, Arsen, Dimethylsulfoxyd und verfügbares CO2) Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt 2.1.7.1).
Ausnahmen von oben genannten Bestimmungen bilden Substanzen zur Pflege und Vorbeugung wie zum Beispiel Impfstoffe, die bis spätestens 14 Tage vor der Prüfung appliziert werden oder Insektenschutzmittel.
2.1.3.3 Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (Stand Januar 2002)
Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt XIV der Rennordnung unter Unerlaubte Mittel - Doping. Die Punkte 529 bis 561 regeln das allgemeine Verbot der Anwendung unerlaubter Mittel, definieren Gruppen erlaubter und unerlaubter Mittel, Substanzen mit Grenzwerten, sowie die Entnahme, Vorbereitung und Auswertung von Dopingproben. Im Unterschied zur LPO behält sich das Direktorium vor, Kontrollen nicht nur während Prüfungen durchzuführen, sondern auch Trainingsproben entnehmen zu lassen.
2.1.3.4 Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –Rennen e. V. (HVT) vom 01. Februar 2003
Die Dopingbestimmungen dieses Pferdesportverbandes werden im Teil B II § 93 und den Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping geregelt. Entsprechend der oben genannten Rennordnung darf ein Pferd von Beginn
bis zum Ende des Rennens keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen in seinen Geweben, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen aufweisen.
Entgegen der LPO oder RO werden keine Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt 2.1.7.1) für einzelne Mittel angegeben, so dass jeglicher Nachweis verbotener Stoffe positiv berichtet wird. In den Durchführungsbestimmungen finden sich die Dopingliste mit Verboten von Substanzen beziehungsweise Stoffgruppen (Diuretika, Herz- Kreislaufwirksame Mittel, Substanzen, die auf das zentrale oder periphere Nervensystem wirken usw.) und detaillierten Bestimmungen zur Entnahme, dem Versand und Auswertung von Proben.
Allen drei Pferdesportverbänden ist in der Reglementierung des Dopings gemein, dass hauptsächlich Stoffgruppen auf den Verbotslisten aufgeführt werden. Eine Auflistung einzelner Stoffe oder sogar Warennamen wäre bei der Vielfalt der zur Verfügung stehenden Medikamente nicht möglich und könnte niemals vollständig sein.
2.1.4 Dopingformen
UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999) unterscheiden verschiedene Formen der unerlaubten Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit für den Pferdesport. Die Manipulationen teilen sich in positives, negatives und unabsichtliches Doping, sowie in Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises.
2.1.4.1 Positives Doping Doping auf Sieg
Es werden verbotene Substanzen zum Zwecke der Leistungssteigerung und Überwindung der natürlichen und autonom geschützten Leistungsbarrieren,
10 LITERATURÜBERSICHT
entweder über Tage und Wochen (chronisches Doping) oder kurz vor dem Rennen/der Prüfung (akutes Doping), verabreicht. Eine paradoxe Form des Doping stellt die Verabreichung geringer Mengen Sedativa dar, um übererregte Pferde startfähig zu machen (UNGEMACH, 1985). Mit den modernen Psychopharmaka ist es möglich, Angst und Erregungszustände zu lindern, ohne eine wesentliche Änderung des Wachzustandes oder der Leistungsfähigkeit zu provozieren.
Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit
Diese Form des Dopings zielt darauf ab, die genetisch determinierte Leistungsfähigkeit des Tieres, die durch den aktuellen Gesundheitszustand eingeschränkt wird, durch medikamentelle, therapeutische Maßnahmen wiederherzustellen (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Das hat zur Folge, dass kranke oder nicht voll belastungsfähige Pferde den extremen physischen Belastungen einer Prüfung ausgesetzt werden. Dabei ist in erster Linie an den Einsatz von Schmerzmitteln oder antibakteriell wirksamen Substanzen zu denken.
Doping mit körpereigenen Substanzen
Unter diese Form des Dopings fällt unter anderem die Verabreichung von Eigenblut beziehungsweise dessen Bestandteilen, wie zum Beispiel Erythrozyten oder Erythropoetin. Dieses in der Niere gebildete Hormon reguliert die Erythropoese (BERGLUND et al. 1988; Müller, 1999), was genau wie die Verabreichung von Erythrozytenkonzentrat eine Erhöhung des Anteils der roten Blutkörperchen im Körper und damit verbesserte Sauerstofftransportkapazität des Blutes zur Folge hat.
Physikalisch-technisches Doping
Darunter versteht man alle Maßnahmen zur Manipulation der Leistungsfähigkeit, die nicht durch die Applikation chemischer Substanzen, sondern in Form von zum Beispiel elektrischen Reizen, Akupunktur, Ultraschall oder UV-Strahlen vorgenommen werden (LOEFFLER, 2000). Die invasivste Form des Dopings sind Eingriffe, wie der Einsatz eines ständigen Tracheotubus zur Überwindung von Atemwegsobstruktionen oder Neurektomien im Bereich der distalen Gliedmaßen zur Desensibilisierung insbesondere des Hufs (SCHOENE, 1996).
2.1.4.2 Negatives Doping oder Doping auf Niederlage
Bei negativem Doping handelt es sich um eine Form der Leistungsminderung, bei der davon auszugehen ist, dass sie meistens von Außenstehenden, beziehungsweise Konkurrenten, durchgeführt wird. Sie wird deshalb auch als
„outside job“ bezeichnet (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980). Häufig wird dabei auf die Wirkung von Sedativa oder Tranquilizern zurückgegriffen, die nur in niedriger Dosierung und bei nervösen Pferden einen positiven Effekt hervorrufen. Eine normale therapeutische Dosierung führt zu lokomotorischen Hemmungen sowie dem Ausfall bedingter Reflexe, wie dem Fluchtreflex bei Rennpferden, und damit zur Leistungsminderung (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
2.1.4.3 Unabsichtliches Doping
Durch unzureichende Kenntnis der Pharmakokinetik und -dynamik in der Masse der Arzneimittel, die bei der Therapie erkrankter Pferde zum Einsatz kommen, kann es zu positiven Dopingbefunden ohne konkreten Vorsatz kommen. Dabei stehen die behandelnden Tierärzte häufig vor dem Problem, therapeutisch notwendige Arzneimittelgaben mit der Forderung „kein Nachweis von therapeutisch wirksamen/leistungsbeeinflussenden Substanzen zum Rennzeitpunkt in Blut
12 LITERATURÜBERSICHT
oder/und Urin“ vereinbaren zu müssen (KLAUS u. HAPKE, 1994). Dabei können und dürfen sie sich nicht an den Wartezeiten für Medikamente für lebensmittelliefernde Tiere orientieren, da nach Ablauf dieser keine Rückstandsfreiheit gewährleistet wird (LOEFFLER, 2000). Zusätzlich hängt die Dauer der Nachweisbarkeit von Medikamenten im Körper des Pferdes neben der Dosis und dem pharmakokinetischen Verhalten des Arzneimittels von der Sensitivität des Nachweisverfahrens und von der biologischen Variabilität der Eliminations- geschwindigkeit des Individuums ab (TOBIN et al., 1989). Ein weiteres Problem können Wirkstoffkombinationen beziehungsweise -verbindungen wie zum Beispiel Procain-Penicillin darstellen, da das Lokalanästhetikum in dieser Formulierung über einen viel längeren Zeitraum verfügbar bleibt als als Monopräparat (UNGEMACH, 1988). Auch bei Einreibungen zum Beispiel mit Kampfer kann es über perkutane Resorption (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999) zu positiven Blutspiegeln kommen. Weiterhin tragen pharmazeutische Hilfsstoffe, wie zum Beispiel Kakaopulver als Trägerstoff eines oral zu verabreichenden Aufbaumittels zu dieser Problematik bei. Kakao als Bestandteil von Industriefutter enthält Theobromin und in geringer Menge auch Coffein, was in England bei Kontrollen mehrfach zu positiven Dopingbefunden führte (TOBIN, 1981).
2.1.4.4 Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises
Hierbei wird versucht, den analytischen Nachweis der verabreichten Substanz durch sogenannte Maskierungsmittel zu erschweren. Die verwendeten Stoffe führen nicht zu einer Leistungssteigerung, besitzen aber die Fähigkeit, die verbotene Substanz in der Analyse zu überlagern. So wird durch den Einsatz von Diuretika versucht, die Konzentration eines verbotenerweise applizierten Arzneimittels oder Stoffes durch Verdünnung des Urins zu senken (TOBIN u. WOOD, 1989). Urikostatika (zum Beispiel Probenicid) auf der anderen Seite hemmen den Sekretionsprozess zum Beispiel von Benzylpenicillin in den Nierentubuli, da sie eine Affinität zum selben Carriersystem besitzen (FREY, 1996). Dadurch kann eine Urinprobe trotz Verabreichung von Benzylpenicillin ein negatives Analyseergebnis bringen.
2.1.5 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in Deutschland
Systematische Dopingkontrollen der großen deutschen Pferdesportverbände werden etwa seit Anfang der 1970er Jahre durchgeführt. Die Auswahl der Pferde, von denen Urin oder Blut auf das Vorhandensein verbotener Substanzen untersucht wird, erfolgt nach dem Zufallsprinzip und aufgrund von Verdachtsfällen. Laut DÜE (1998) werden jährlich etwa 380 000 Analysen von Medikationskontrollen weltweit unter dem Dach der Association of Official Racing Chemists durchgeführt. Davon entfallen ungefähr 3300 Medikationskontrollen auf den Galopp-, Trab-, Reit- und Fahrsport in Deutschland, wobei die FN etwa 1000 Proben zur Untersuchung an Laboratorien sendete. Der Hauptanteil der Proben wird im Institut für Biochemie der deutschen Sporthochschule Köln analysiert. Eine Übersicht über die Jahre 2000 bis 2003 gibt Tabelle 1:
Jahr Verband Gesamtzahl der Proben positiv getestete Proben [absolut]
positiv gestestete Proben [%]
FN 707 16 2,26
DIR 1011 20 1,98
FN 469 8 1,70
DIR 1166 8 0,69
FN 456 7 1,54
DIR 1070 15 1,40
FN 358 3 0,83
DIR 883 8 0,91
2000
2001
2002
2003
Tabelle 1: Übersicht der im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln in den Jahren 2000 bis 2003 zur Untersuchung gelangten Pferdeproben
2.1.6 Beurteilung von Analyseergebnissen
2.1.6.1 Null-Lösung und Grenzwerte
Für praktizierende Tierärzte ist die Maxime, Doping im Pferdesport nicht zu dulden, in einigen Fällen therapeutisch unbefriedigend (KLAUS u. HAPKE, 1994), da bei Sportpferden von einer hohen Behandlungshäufigkeit auszugehen ist. Dieses
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untersuchten ROBINSON und GORDON (1988) in der Rennsaison 1987 an 100 Pferden, die mindestens einmal in Rennen starteten. Von diesen Tieren fielen 47 wegen muskuloskeletaler Verletzungen im Training oder Rennen aus und mussten sogar teilweise aufgrund der Schwere der Verletzung euthanasiert werden. Der Therapiebedarf bei Sportpferden ist also offensichtlich. Für die meisten Wirkstoffe gilt derzeit, dass ihr Nachweis unabhängig von der gefundenen Konzentration als Doping gewertet wird (vergleiche Punkt 2.1.4). Dies wird auch als sogenannte Null- Lösung bezeichnet (UNGEMACH, 1988).
Lediglich für einige endogene oder im Futter vorkommende Substanzen sind Grenzwerte in den Listen der Pferdesportverbände aufgeführt (siehe Tabelle 2).
Verband Grenzwert für
Testosteron Nandrolon Theobromin
Cortisol Salizylsäure
Arsen Dimethylsulfoxyd verfügbares CO2
Arsen Salicylsäure
Nandrolon Theobromin Dimethylsulfoxyd
Cortisol
Peptidhormone u. Analoga Hordenin
Testosteron verfügbares CO2
Methoxytyramin Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V.
Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V.
Tabelle 2: Auflistung von Stoffen, für die in den Bestimmungen der Pferdesportverbände Grenzwerte gelten (Stand Juni 2004)
Sowohl die Null- als auch die Grenzwert-Lösung stellen behandelnde Tierärzte vor die Frage, ab welchem Zeitpunkt vor einer Prüfung ein Medikament nicht mehr eingesetzt werden darf, um nicht einen Dopingfall (unabsichtliches Doping) im Sinne der Bestimmungen zu provozieren. Bis heute liegen diesbezüglich über Ausscheidungszeiten von Substanzen nur unzureichende Daten vor. Zur Sicherung der notwendigen medikamentellen Behandlung von Sportpferden halten es KLAUS und HAPKE (1994) für sinnvoll, für jedes anzuwendende Arzneimittel Karenzzeiten festzulegen. Dabei ist die Karenzzeit definiert als Zeitraum zwischen dem letzten Tag der Arzneimittelgabe und dem Tag der Prüfung, nach dessen Ablauf nicht mehr mit einem positiven Ergebnis einer Dopinganalyse zu rechnen ist. Problematisch ist die Abhängigkeit der Anwesenheit von Medikamenten von der verabreichten Dosis, der Pharmakokinetik der Substanz, der Sensitivität der Nachweismethode und der biologischen Variabilität der Individuen (TOBIN u. WOODS, 1989). Zusätzlich sind individuelle Eliminationszeiten abhängig vom ausgeschiedenen Urinvolumen, dem pH-Wert des Urins, der Stoffwechselkapazität der Leber, dem Gesundheitszustand der Pferde und der Form der Anwendung (zum Beispiel peroral, parenteral, äußerlich) (PICK, 1993; DYKE u. SAMS, 1994B).
Nach UNGEMACH (1985) erscheint es sinnvoll, für Arzneimittel maximal zulässige Blutspiegel (Grenzwerte) festzulegen, um zu verhindern, dass der Nachweis minimaler, mit Sicherheit unwirksamer Mengen als dopingrelevant bezeichnet werden muss und notwendige Therapien verhindert werden. Allerdings liegen über den Zusammenhang von Nachweis und Wirkkonzentration bis heute ebenfalls nur sehr wenige oder unterschiedliche Daten vor (DÜE, 1998; SAMS, 1996).
Blutspiegelverlaufskurven für Dopingmittel gelten nur unter den bei den Messungen vorherrschenden Bedingungen (UNGEMACH, 1985), was für die quantitative Analyse eine gleiche Behandlung aller Proben bei ihrer Entnahme, ihrem Transport, ihrer Aufbewahrung, Aufarbeitung und Messmethode voraussetzt (BEYER, 1998).
TOBIN und WOOD (1989) sowie SAMS (1996) sind der Meinung, dass die quantitative Analyse im Zuge der Grenzwert-Lösung keinen Vorteil bietet, weil der individuellen und intraindividuellen Variabilität in Bezug auf Wirkung und
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Verstoffwechselung, die beim Pferd sehr groß ist, keine Rechnung getragen wird.
Nach DYKE und SAMS (1994A) steht auch die Harnkonzentration (durch zum Beispiel starke Belastung in einem Wettkampf) in keinem konstanten Verhältnis zur Blutkonzentration, so dass Urin schlecht für quantitative Analysen geeignet ist.
Diese Problematik und der Umstand, dass immer sensiblere Analysemethoden entwickelt werden, veranlasste TOUTAIN und LASSOURD (2002) dazu, ein neues Modell zu entwickeln. Durch ein Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Modell (PK/PD- Modell) setzen sie die Konzentration einer Substanz und ihre Wirkung mathematisch miteinander in Beziehung und ermitteln so effektive und irrelevante Plasma- (IPC) und Urinkonzentrationen (IUC). Hierbei soll bestimmt werden, ab welcher Konzentration einer Substanz in Blut und Urin keine pharmakodynamischen Wirkungen mehr im Tier vorliegen, obwohl eventuell ein analytischer Nachweis möglich ist. Um diese Berechnungen durchzuführen, müssen von der jeweiligen Substanz genügend pharmakologische und pharmakokinetische Daten vorliegen (siehe auch Punkt 4.4).
2.2 Physiologie und Pharmakologie von α
2-Rezeptoren
Das autonome Nervensystem besteht funktionell aus sympathischen und parasympathischen Fasern. Das sympatho-adrenale System ermöglicht dem Organismus eine graduelle Anpassung an wechselnde äußere oder innere Erfordernisse. Hierbei vermitteln die körpereigenen Transmitter Noradenalin und Adrenalin die physiologischen Wirkungen an den Adrenorezeptoren und wirken als direkte Sympathomimetika (STARKE, 1981). α2-Rezeptoren findet man im Organismus sowohl zentral als auch peripher; dabei sind sie sowohl prä- als auch postsynaptisch lokalisiert (CLARKE u. TAYLOR, 1986).
2.2.1 Rezeptorklassifizierung
Im Jahre 1948 klassifizierte AHLQUIST Adrenorezeptoren anhand hämodynamischer Effekte verschiedener Katecholamine in α und ß-Typen. Die ß-Adrenorezeptoren wurden mit Hilfe selektiver Agonisten und Antagonisten in ß1- und ß2-Rezeptoren unterteilt (LANDS et al., 1967). Auch die α-Adrenozeptoren lassen sich weiter unterteilen. Nach anatomischen Gesichtspunkten gliedern sie sich in postsynaptische α1- und präsynaptische α2-Rezeptoren (LANGER, 1974). Die pharmakologische Unterteilung wurde notwendig, als BERTHELSEN und PETTINGER (1977) auch postsynaptisch lokalisierte α2-Rezeptoren fanden. Daraufhin wurde die Bezeichnung α1 oder α2-Adrenozeptor auf die Präferenz von Agonist oder Antagonist für den Rezeptor bezogen und nicht mehr auf die Lokalisation (MACDONALD u. VIRTANEN, 1992). Für α2-Rezeptoren werden zusätzlich vier Subtypen unterschieden: α2a, α2b, α2c und α2d (RUFFOLO et al., 1994; VAINIO, 1997).
2.2.2 α2-Agonisten und Antagonisten beim Pferd
α2-Agonisten werden seit vielen Jahren aufgrund ihrer sedativen und analgetischen Eigenschaften beim Pferd eingesetzt (VIRTANEN, 1986). Durch die pharmakologische Einteilung der α-Rezeptoren wurden die Entwicklung spezifischer Pharmaka und der gezielte Einsatz der bisher verfügbaren α-Adrenozeptoragonisten möglich (SCHEININ u. MACDONALD, 1989). Im Gegensatz zu einigen anderen Sympathomimetika besitzen die im Folgenden aufgeführten Substanzen die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren (LÖSCHER, 2002), was zu vielfältigen und komplexen Reaktionen im Bereich des zentralen Nervensystems führt.
Clonidin war 1977 der erste Vertreter dieser Gruppe. Es wird als Prototyp der α2- Agonisten mit Wirkung auf das zentrale Nervensystem angesehen (BISCHOFF u.
KOCHS, 1993). Seine Selektivität gegenüber den α2-Rezeptoren war allerdings nicht so ausgeprägt wie die moderner Pharmaka (SHORT, 1992). Im Laufe der Zeit
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wurden Substanzen wie Romifidin oder Detomidin mit einer höheren Selektivität entwickelt.
1962 wurde Xylazin als Antihypertensivum entwickelt. Da man während der klinischen Studien jedoch eine stark depressive Wirkung auf das zentrale Nervensystem feststellte, wurde es 1968 als Sedativum, Analgetikum und Muskelrelaxans in die Veterinärmedizin eingeführt (GREENE u. THURMON, 1988).
Bei Romifidin handelt es sich um einen neueren Vertreter der Gruppe der α2- Agonisten. Dabei ist es in den sedativen Wirkungen vergleichbar mit Xylazin (BROWNING u. COLLINS, 1994); über seine analgetischen Eigenschaften wird kontrovers diskutiert (HAMM et al., 1995; MOENS et al., 2003).
Medetomidin ist als Sedativum für Hunde und Katzen zugelassen. Durch seine lipophilen Eigenschaften diffundiert es schneller ins Gehirn als Xylazin und führt zu einer ausgeprägteren zentralen Wirkung (VIRTANEN, 1986). Es besitzt ähnliche analgetische Potenz wie Xylazin und Detomidin, jedoch können mit Medetomidin vergleichbare Wirkungen schon in geringeren Dosen erzielt werden.
Detomidin ist ein potenter und selektiver α2-Agonist mit geringer Wirkung auf α1- Rezeptoren (VAINIO, 1985; VIRTANEN et al., 1985). Es ist als Sedativum und Analgetikum für Pferde und Rinder zugelassen. Es wird als Testsubstanz der in dieser Arbeit beschriebenen Studie unter Punkt 2.3 eingehender besprochen.
2.2.3 Wirkungsmechanismus
α2-Sympathomimetika wie Clonidin, Xylazin, Romifidin und Detomidin entfalten ihre Wirkung vornehmlich im zentralen Nervensystem. Die α2-Rezeptoren im Gehirn befinden sich hauptsächlich im Gebiet des Locus coerulus (Hirnstammkern) und des Nucleus tractus solitarius. Sie kontrollieren dort den Noradrenalinhaushalt. Als Ursprung aufsteigender und absteigender noradrenerger Bahnen nimmt der Locus coerulus in der Regulation der Vigilanz eine zentrale Stellung ein (STENBERG,
1986), während der Nucleus tractus solitarius an der Kontrolle des Blutdrucks beteiligt ist (STARKE u. PALM, 1996). α2-Agonisten greifen an peripheren und zentralen α2-Rezeptoren an und hemmen dort die noradrenalingesteuerte Übertragung von Nervenimpulsen.
Auf molekularbiologischer Ebene handelt es sich bei α2-Adrenozeptoren um G- Protein-gekoppelte Rezeptoren in der zytoplasmatischen Membran (MAZE u.
TRANQUILLI, 1991; AANTAA u. SCHEININ, 1993). Durch ein die Synapse erreichendes Aktionspotential kommt es über einen Ca2+-Einstrom zur Freisetzung von Noradrenalin in den synaptischen Spalt. Die Aktivierung der Rezeptoren durch endogene Transmitter oder die oben genannten Substanzen führt zu einer G-Protein vermittelten Hemmung der Ca2+-Kanäle (LAMMINTAUSTA, 1986; DAUNT u. MAZE, 1992). Einerseits wird dadurch die weitere Freisetzung von Noradrenalin im Sinne eines negativen Feed-Back-Mechanismus gehemmt (LANGER et al., 1977; Starke, 1977). Andererseits wird durch die Hyperpolarisation der Membran eine Desensibilisierung erreicht (MAZE u. TRANQUILLI, 1991). Zentral führt die Aktivitätsabnahme dieser Neurone zur Sedation der Tiere (STENBERG, 1986), Bradykardie und Hypotension (SHORT et al., 1986). Peripher bedingt die postsynaptische Stimulation eine initiale Vasokonstriktion mit daraus resultierendem transientem peripheren Bluthochdruck (CLARKE u. TAYLOR, 1986). Die analgetischen Effekte von α2-Agonisten nehmen ihren Ursprung sowohl im Hirnstamm als auch im Rückenmark (STENBERG, 1986; ALITALO u. VAINIO, 1982).
Es wird eine synergistische Wirkung von α2-adrenergen und opioidergen Rezeptormechanismen angenommen (AANTAA u. SCHEININ, 1993).
2.2.4 α2-Antagonisten
Die Wirkung der α2-Sympathomimetika kann durch α2-Rezeptorblocker wie Idazoxan, Tolazolin, Yohimbin und Atipamezol aufgehoben werden (VIRTANEN, 1986;
VIRTANEN et al., 1985). Dabei verdrängen diese endogene (Adrenalin, Noradrenalin) oder exogene (Xylazin, Romifidin, Detomidin) Agonisten vom Rezeptor
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(STARKE u. PALM, 1996). Die Wirkung von Detomidin lässt sich beim Pferd durch den spezifischen α2-Antagonisten Atipamezol aufheben (RAMSEYER et al., 1998;
RAEKALLIO et al., 1990). Atipamezol hat eine Bindungsaffinität α2/α1-Rezeptoren von 8526:1 (ZIEGLER, 2003). Allerdings ist eine Antagonisierung beim Pferd kaum notwendig, da die Wirkungsdauer der α2-Agonisten nur kurz ist und beim Pferd in der Regel nicht zum Niedergehen führt. Auch beim Kleintier wird Atipamezol als Antagonist eingesetzt (SCHATZMANN, 1995).
2.3 Detomidin
2.3.1 ChemieBei Detomidin handelt es sich chemisch um das schwach basische, lipophile 4-[(2,3- Dimethylphenyl)-methyl]-Imidazol (SALONEN, 1986). Es gehört zur Gruppe der 4 (5)-substituierten Arylalkylimidazole (RUSKOAHO, 1986). Detomidin ist ein weißes, kristallines und geruchloses Pulver, mit einem Molekulargewicht von 186,25. Es ist gut wasserlöslich, frei von Isomeren und weitgehend stabil (SALONEN, 1986). Sein Schmelzpunkt liegt bei 156 – 161°C. Es ist seit 1983 als wässrige Detomidin- Hydrochlorid-Lösung (Domosedan®, Orion Pharma, Espoo, Finnland, vertrieben durch Pfizer, Karlsruhe) in Deutschland beim Pferd und Rind zur intravenösen, intramuskulären und epiduralen Injektion zugelassen. 1 ml Domosedan® Injektionslösung enthält 10 mg Detomidin-Hydrochlorid. Abbildung 1 zeigt die Strukturformel, die Summenformel und die Molekülmasse von Detomidin.
CH3 CH3
HN N Detomidin
C12H14N2 186.25
Abbildung 1: Strukturformel, Summenformel und Molekülmasse von Detomidin
2.3.2 Pharmakokinetik
Um seine zentralen α2-agonistischen Wirkungen an präsynaptischen, in höheren Konzentrationen auch an den postsynaptischen α2-Adrenorezeptoren zu entfalten (VIRTANEN, 1986), wird Detomidin nach der Applikation schnell und vollständig resorbiert (JÖCHLE, 1986; SALONEN, 1986). Nach der intravenösen Applikation werden innerhalb der ersten Minuten die höchsten Plasmakonzentrationen erreicht (SALONEN, 1986). Beim Pferd werden annähernd 85 % (SALONEN, 1986) beziehungsweise 68 % (SINGH et al., 1987) an Plasmaproteine gebunden. Durch seinen lipophilen Charakter verteilt sich Detomidin schnell in die gut durchbluteten Gewebe (Leber und Niere); es passiert rasch die Blut-Hirn-Schranke (SALONEN, 1992; JÖCHLE, 1986). Die Eliminationshalbwertszeit liegt beim Pferd nach intravenöser Injektion zwischen einer und zwei Stunden (SALONEN, 1992, DYKE, 1993; Orion Pharma, 2003). Eine Metabolisierung (Hydroxylierung, Dehydro- genierung, Oxidation und Glukoronidierung) findet in der Leber statt (SALONEN u.
SUOLINNA, 1988; GEISER, 1990). Beim Pferd entstehen bei der Verstoffwechselung die Metaboliten Carboxydetomidin, 3-3-Hydroxydetomidin und 4- Hydroxydetomidin (CHUI et al., 1991), die pharmakologisch unwirksam sind (MAC DONALD u. VIRTANEN, 1992; SALONEN, 1992). Dabei stellen das freie
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Carboxydetomidin und das sowohl glukoronidiert als auch frei vorliegende 3- Hydroxydetomidin die Hauptmetaboliten dar (SEYMOR et al., 1990A; SALONEN et al., 1992). Da die Metaboliten weniger lipophil sind als Detomidin, werden sie schneller als die ursprüngliche Substanz ausgeschieden. Detomidin selbst wird im Urin nur in sehr kleinen Mengen gefunden (VAKKURI et al., 1987; SALONEN, 1988).
Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich renal, ein geringer Teil wird als Glukoronid über die Faeces ausgeschieden (SALONEN, 1992). Beim Pferd sind nach einer einmaligen intravenösen Applikation von 80 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM nach 24 Stunden nur in Leber und Lunge noch geringe Mengen Detomidin nachweisbar (VAKKURI et al., 1987; SALONEN et al., 1989). Nach der Applikation von 20 mg Detomidin-Hydrochlorid wird 3-Hydroxydetomidin über 48 Stunden im Urin detektiert (CHUI et al., 1991). Carboxydetomidin hingegen wird nach einer Dosierung von 5 µg/kg KM i. m. bis 23 Stunden p. a. im Urin gefunden (SEYMOR et al., 1991).
2.3.3 Pharmakodynamische Wirkung
Die Applikation von Detomidin bedingt eine Vielzahl von zu beobachtenden Effekten.
Sedation und Analgesie: Detomidin verfügt über potente sedative und analgetische Eigenschaften (VAINIO, 1985). Sowohl Sedation als auch Analgesie sind beim Pferd dosisabhängig (LOWE u. HILFIGER, 1984; JÖCHLE u. HAMM, 1986). Die niedrigste angewendete Dosierung für die intravenöse Applikation liegt bei 5 µg/kg KM. LOWE und HILFIGER (1984) und GEISER (1990) empfehlen eine Dosis von 10 – 40 µg/kg KM, um eine ausreichende Sedation und Analgesie zu erreichen. Für eine tiefere Sedation und bessere Analgesie wird eine Dosierung von 40 bis 80 µg/kg KM empfohlen (Orion Pharma, 2003). 20 µg/kg KM ergaben in den Studien von HAMM u.
JÖCHLE (1986) eine sehr tiefe und zufriedenstellende Sedation in der ersten Stunde nach Applikation mit deutlicher Sedation bis 3 zu Stunden Dauer. Zwischen 5 und 20 µg/kg KM wird eine dosisabhängige Verstärkung der Sedation beobachtet; bei höheren Dosierungen steigt nur noch die Dauer der Sedation, nicht mehr die Tiefe (JÖCHLE u. HAMM, 1986; ENGLAND u. CLARKE, 1996). Nach der intravenösen
Applikation tritt die Wirkung zwischen 0,5 und 5 Minuten später ein (LOWE u.
HILFIGER, 1984; CLARKE u. TAYLOR, 1986; OHNESORGE, 1991). Maximale Effekte werden 15 Minuten nach der Applikation beobachtet (JÖCHLE u. HAMM, 1986). Nach der intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM berichten CLARKE u. TAYLOR (1986) von einer tiefen Sedation über eine Dauer von 50 bis 60 Minuten, die Studien von HAMM u. JÖCHLE (1986) ergaben sogar eine deutliche Sedation mit einer Dauer von bis zu drei Stunden. Nach oraler Verabreichung von 60 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM war nach 30 Minuten eine signifikante Tiefhaltung des Kopfes über eine Dauer von 45 Minuten zu beobachten (RAMSEY et al., 2002). Die Sedation äußert sich durch Hängenlassen des Kopfes, der Lippen und der Augenlider, verminderte Reaktion auf akustische und visuelle Reize sowie Ataxie (FEDDERN, 1986; SHORT et al., 1986, ALITALO, 1986;
OHNESORGE, 1991).
Die spontane Bewegungsaktivität geht nach der Applikation von Detomidin- Hydrochlorid für 4 bis 6 Stunden deutlich zurück (KAMERLING et al., 1988;
HARKINS et al., 1997). VIRTANEN et al. (1985) stellten fest, dass die sedative Potenz von Detomidin der von Clonidin sehr ähnlich ist. Im Vergleich zu den Wirkungen von Xylazin ist sowohl der Grad der Sedation als auch die Analgesie, bedingt durch eine höhere α2-Rezeptorselektivität, bei Detomidin ausgeprägter (HAMM et al., 1995), so dass 100 µg Detomidin/kg KM eine vergleichbare Wirkung wie 1200 µg Xylazin/kg KM haben (VAINIO, 1985) Trotz starker Sedationsanzeichen kann es, bedingt durch äußere Reize, leicht zu einem Durchbrechen der Sedation in Form plötzlicher Abwehrbewegungen kommen (ROHR et al., 1986; ALITALO, 1986).
Anschließend fallen die Tiere wieder in einen somnolenten Zustand.
Die analgetische Wirksamkeit von Detomidin ist in verschiedenen Studien bewiesen worden. Trotz der Verwendung unterschiedlicher Schmerzmodelle stimmen die Ergebnisse der Untersuchungen im wesentlichen überein. VAINIO (1985) überprüfte die Reaktion auf Nadelstiche an den Gliedmaßen, JÖCHLE und HAMM (1986), ermittelten die Schmerzschwelle mittels Stromapplikation über Hautelektroden und CHAMBERS et al. (1990) arbeiteten mit einem druckgasbetriebenen Zylinder, der am
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Bein von Pferden montiert wurde. Die analgetische Wirkung von Detomidin war 5 bis 15 Minuten nach der Applikation voll ausgeprägt (ALITALO u. VAINIO, 1982). Die Dauer der Analgesie richtete sich nach der Dosierung, hält jedoch kürzer an als die Sedation (VAINIO, 1985). Bei 20 µg/kg KM waren die Gliedmaßen mit etwa 15 bis 60 Minuten am Längsten von der analgetischen Wirkung betroffen (JÖCHLE und HAMM, 1986). LOWE u. HILFIGER (1984) bescheinigten Detomidin eine dosisabhängige, analgetische Wirksamkeit bei viszeralen Schmerzen. Sie stellten mittels ins Zaekum implantierten, luftgefüllten Gummiballons eine analgetische Wirkung von Detomidin fest, die annähernd gleichzeitig mit der Sedierung einsetzte, aber früher wieder abklang. CLARKE u. TAYLOR (1986) ermittelten hingegen bei Dosierungen von 10-20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM keine signifikante Analgesie.
Laut SCHATZMANN (1995) kann es ein Problem darstellen, die Analgesie von der Sedation zu unterscheiden. Durch eine Sedation wird die Spontanaktivität und die Reaktion auf äußere Reize gesenkt, so dass fraglich ist, ob die Tiere bei schmerzhaften Manipulationen tatsächlich eine verlangsamte Schmerzleitung oder nur eine verlangsamte Reaktion auf den Schmerz zeigen. Die Studien von HAMM et al. (1995) hingegen weisen keinen Zusammenhang zwischen Sedation und Analgesie nach.
Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System: Nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid führt die Stimulation peripherer postsynaptischer α- Adrenozeptoren zu einer vaskulären Vasokonstriktion. Dies bedingt einen initialen Blutdruckanstieg, mit einem Maximum eine Minute nach Applikation (CLARKE u.
TAYLOR, 1986; SHORT et al., 1986). Die Stimulation zentraler α-Rezeptoren im Bereich des Nucleus tractus solitarii führt jedoch zu einer Senkung des Sympathikotonus (Überwiegen des Vagotonus) und Hypotension (GASTHUYS et al., 1990; ENGLAND u. CLARKE, 1996; LÖSCHER, 2002). Der resultierende Blutdruck ist also eine Mischung aus peripheren und zentralen Effekten (RUSKOAHA, 1986).
Die Herzfrequenz fällt kurz nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid deutlich ab (VAINIO, 1985; SHORT et al., 1986). Bei einer Dosis von 20 µg/kg KM ist diese Herzfrequenzabnahme bereits innerhalb der ersten 5 Minuten (SHORT et al., 1986;
BENSON u. THURMON, 1990) und über einen Zeitraum von 70 Minuten (FEDDERN, 1986) beziehungsweise 120 Minuten (SRAZAN et al., 1989) zu beobachten. Diese ist bedingt durch einen Baroceptorreflex, ausgelöst durch den transienten Hypertonus nach Detomidingabe, die zentrale Dämpfung des Sympathikotonus und die Verstärkung der vagalen Reflexe (KAMERLING et al., 1988).
Zusätzlich werden im Elektrokardiogramm Arrhythmien ab der ersten Minute p. a. für die Dauer von ein bis drei Stunden registriert (CLARKE et al., 1986; FEDDERN, 1986; DAUNT et al., 1991). Dabei handelt es sich in der Mehrzahl der Fälle um Atrioventrikularblöcke (AV-Blöcke) 2. Grades, seltener um sinuatriale Leitungs- störungen (CLARK u. TAYLOR, 1986; FEDDERN, 1986; JÖCHLE, 1986). Im Vergleich zu Xylazin ist bei der Anwendung von Detomidin eher mit dem Auftreten kardialer Reizleitungsstörungen in Form von AV- und Sinusblöcken zu rechnen (DYSON et al., 1987).
Auswirkungen auf die Atmung: Über die Veränderung der Atemfrequenz nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
SHORT et al. (1986) und WAGNER et al. (1991) stellten einen Abfall der Atemfrequenz innerhalb einiger Sekunden fest. Dieser dauerte einige Minuten an, bevor wieder die Ruhewerte erreicht wurden. In anderen Studien (REITMEYER et al., 1986; DAUNT et al., 1993) wurde keine signifikante Veränderung der Atemfrequenz gemessen. VAINIO (1985) und JÖCHLE (1986) berichteten über einen kurzen initialen Abfall der Atemfrequenz, gefolgt von einem geringgradigen Anstieg über die Ruhewerte hinaus. Beide Autoren beschrieben allerdings starke Schwankungen der Atemfrequenz während der Messungen. Nach einer einmaligen intravenösen Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM stellte FEDDERN (1986) einen signifikanten Anstieg der Atemfrequenz über eine Dauer von 10
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Minuten fest. In den folgenden 70 Minuten erfolgte eine graduelle Anpassung zurück auf das Ruheniveau.
Nach der Applikation von Detomidin-Hydrochlorid sinkt der Sauerstoffpartialdruck (pO2) ab, während der Kohlendioxidpartialdruck (pCO2) geringgradig ansteigt (ROHR et al., 1986; REITMEYER et al., 1986). FEDDERN (1986) und SHORT et al. (1986) berichteten nach der intravenösen Injektion von 20 µg/kg KM über einen nicht signifikanten Abfall des pO2 in einem Zeitraum von 15 Minuten p. a. Gleichzeitig steigt der pCO2 über 45 Minuten p. a. an (FEDDERN, 1986). In einer weiteren Studie wurden keine signifikanten Veränderungen des pO2, allerdings ein Anstieg des pCO2
beobachtet (DAUNT et al., 1991). Weiterhin berichtete FEDDERN (1986) über das Auftreten von in- und expiratorischen Geräuschen während der ersten Stunde nach der Detomidinapplikation. Ein inspiratorisches Atemgeräusch kann durch eine Entspannung des Larynx bei sedierten, mit gesenktem Kopf stehenden Pferden auftreten (REITEMEYER et al., 1986).
Auswirkungen auf die Körpertemperatur: VIRTANEN und MACDONALD (1985) und VIRTANEN (1986) zeigten in Versuchen mit Ratten eine Detomidin-induzierte Hypothermie, während FEDDERN (1986) bei Pferden keine signifikanten Veränderungen feststellen konnte. Dosen von 20 und 40 µg Detomidin- Hydrochlorid/kg KM führen zu einer Hyperthermie 45 Minuten p. a. (KAMERLING et al., 1988).
Andere Wirkungen: Als weitere Wirkungen von Detomidin wird über das Auftreten von reversiblen Penisvorfällen (ALITALO, 1986; JÖCHLE, 1986; DYSON et al., 1987;
HAMM et al., 1995) und verstärktem Schwitzen der Tiere (CLARKE u. TAYLOR, 1986; JÖCHLE, 1986; JÖCHLE u. HAMM, 1986; SHORT et al., 1986) berichtet.
Detomidin führte in der Mehrzahl der Studien zu einem diuretischen Effekt (FEDDERN, 1986; JÖCHLE, 1986; JÖCHLE u. HAMM, 1986; LOWE u. HILFIGER,
1986; SHORT, 1992). SHORT et al. (1986) beschrieb beim Pferd eine deutlich verstärkte Diurese ab etwa 60 Minuten nach der Applikation von Detomidin- Hydrochlorid. Diskutiert wird eine Verringerung von zirkulierendem Antidiuretischen Hormon, was zu einer vermehrten Harnproduktion führt (ENGLAND et al., 1992). Die Harndichte sinkt signifikant mit Beginn der verstärkten Diurese ab (GASTHUYS et al., 1987). CLARKE und TAYLOR (1986) hingegen konnten keine erhöhte Harnproduktion feststellen.
2.3.4 Applikationsformen
Domosedan® ist in Deutschland wegen guter Gewebeverträglichkeit (SALONEN, 1986) zur intravenösen, intramuskulären und epiduralen Applikation zugelassen.
2.3.5 Klinische Anwendung von Detomidin
Detomidin ist als Sedativum und Analgetikum sowie zur Prämedikation von Injektions- und Inhalationsnarkosen für Pferde und Rinder im Handel und zugelassen. Es eignet sich sowohl zur Erleichterung von klinischen Untersuchungen und Behandlungen (Laryngoskopie, Zahnbehandlungen) als auch für kleinere chirurgische Eingriffe (Wundnähte). Bei sehr schmerzhaften Eingriffen wird eine zusätzliche Analgesie empfohlen. Die angeratene Dosierung liegt zwischen 20 und 40 µg/kg Körpermasse. Die Wirksamkeit von Detomidin ist auch bei jungen (OIJALA u. KATILA, 1988) oder aufgeregten Tieren (MARTIN et al., 1995) nachgewiesen.
2.3.6 Einsatz von Detomidin im Pferdesport zur Beeinflussung der Leistung
Die pharmakologischen Eigenschaften von Detomidin machen seine klinischen Einsatzmöglichkeiten deutlich. Durch den großflächigen Einsatz in den USA und
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Europa steht Detomidin im Verdacht, auch illegal an Pferde verabreicht zu werden (WOOD et al., 1989), um nervöse und ängstliche Tiere kurz vor einem Wettkampf zu beruhigen. Subklinische Dosen von 1 mg/Tier oder weniger können geringgradige sedative Effekte auf die Tiere haben (WOOD et al., 1989), wodurch der Umgang mit ihnen im Wettkampf erleichtert sein kann. Aufgrund seiner analgetischen Wirkung bei viszeralen Schmerzen ist sein Einsatz zur Maskierung von Koliksymptomen (JÖCHLE et al., 1989) oder im Sinne des negativen Dopings als „stopping drug“
möglich (SEYMOR et al., 1990B).
Da die geringen Mengen Detomidin nur schwer nachzuweisen sind, wurden im Laufe der Zeit verschiedene analytische Methoden entwickelt, um den illegalen Einsatz von Domosedan® aufzudecken.
2.4 Analytik
Für den Analytiker ist die enorme Zahl an Arzneimitteln beziehungsweise chemischen Substanzen, die dopingrelevant sind, problematisch (TOBIN, 1989).
Deshalb werden Urin- und Plasmaproben zuerst Screeningprozeduren unterzogen, die einen Hinweis auf das Vorhandensein bestimmter Substanzgruppen geben (DÜE, 1998). Der spezifische Nachweis einer körperfremden und/oder verbotenen Substanz erfolgt dann in einem zweiten Schritt. Der Nachweis und die Identifizierung einer pharmakologisch wirksamen Substanz und/oder ihrer Metaboliten erfolgt anhand physikalischer Messmethoden (SCHÄNZER u. SEINSCH, 1997). In der modernen Dopinganalytik werden hierbei hauptsächlich chromatographische Analysemethoden verwendet (DYKE u. SAMS, 1994A), die dazu dienen, die gesuchten Substanzen aus den biologischen Matrices Urin und Plasma herauszutrennen und von anderen Substanzen zu unterscheiden.
2.5 Analytischer Nachweis von Detomidin
Für den Nachweis von Detomidin werden verschiedene Verfahren in der Literatur beschrieben.
Der Nachweis von Detomidin im Plasma erfolgte erstmals mittels Radioimmunassay (RIA) (SALONEN et al., 1989). Eine weitere Möglichkeit für den Nachweis von Detomidin im Plasma bietet ein ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay), (CHUI et al., 1991).
Die Detektion von Domosedan® im Urin beschränkt sich in allen Studien auf den Nachweis der Metaboliten. Um genauere pharmakokinetische Daten zu erhalten, quantifizierten SINGH et al. (1987) Detomidin mittlels Gaschromatographie (GC/MS), während SEYMOR et al. (1991) radioaktiv markiertes Detomidin benutzten. Ebenfalls zum Einsatz kamen HPLC/MS/MS-Verfahren (CHUI et al., 1991), in denen teilweise ebenfalls radioaktiv markiertes Material verwendet wurde (SALONEN u. SUOLINNA, 1988). SEYMOR et al. (1990B) benutzten ein GC/MS/MS-System, um den Hauptmetaboliten Carboxydetomidin nach Anwendung von Domosedan® zu identifizieren.
2.5.1 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem- Massenspektrometer (MS/MS)
Die Analytik erfolgte in der vorliegenden Studie mittels Hochdruck-Flüssigkeits- chromatographie in Kombination mit einem Tandem-Massenspektrometer-System.
Als Chromatographie bezeichnet man eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase, die nicht miteinander mischbar sind. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ist eine besonders schnelle und leistungsfähige Chromatographiemethode und trennt innerhalb von Minuten einen umfassenden Bereich von Stoffgruppen (SCHWEDT, 1986). Dazu gehören stark polare und ionische Substanzen, Substanzen mit hoher
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Molmasse sowie thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen (UNGER et al., 1995). Jede HPLC-Apparatur besteht aus einer Serie von Bausteinen, die miteinander gekoppelt sind. Ein sogenanntes chromatographisches System enthält folgende Bausteine:
Die stationäre Phase wird von einer sogenannten „Säule“, als langgestrecktes Trennbrett in einem Rohr gebildet. Das Innere der Trennsäule wird aus einem stabilen und dichten Verband aus kleinen, porösen Teilchen gebildet (Säulenbett), was eine große Oberfläche und hohe Druckstabilität garantiert (UNGER et al., 1995).
Die Trennsäule ist charakteristisch durch ihre Länge, ihren Innendurchmesser und durch den mittleren Teilchendurchmesser des Packungsmaterials. Sie besteht aus einem Probenaufgabeteil, durch den auch die Zufuhr der mobilen Phase erfolgt, der chromatographischen Trennstrecke und dem Säulenende, das in den Detektor übergeht. Die Trennung der einzelnen Substanzen ist aufgrund ihrer unterschiedlichen Polaritäten mit unterschiedlichen Sorptions- und Desorptions- vorgängen auf der Säule möglich.
Die mobile Phase entspricht einem Lösungsmittelgemisch. Es wird infolge der Schwerkraft oder mittels einer Pumpe unter Überdruck aus dem Fließmittelreservoir in die Säule eingebracht. Möchte man ein Substanzgemisch mit verschiedenen polaren Substanzen trennen, so verwendet man zur Trennung die Gradientenelution.
Bei dieser Arbeitsweise wird die Fließmittelstärke kontinuierlich erhöht und damit die Empfindlichkeit der Detektion im hinteren Teil der Zeitachse erhöht (siehe Punkt 3.3.3.1).
Die Pumpe dient der Erzeugung eines konstanten und regelbaren Flusses des Lösungsmittels. Für analytische Säulen werden Volumina von 0,5 bis 5 ml/min angegeben.
Die Dosiervorrichtung oder das Einspritzsystem gibt reproduzierbar ein im Volumen wählbares, definiertes Aliquot des zu trennenden Gemisches (Probe) aus dem Probenröhrchen direkt in den Strom der mobilen Phase. So gelangen Probe und
Lösungsmittel über das Probenaufgabeende in die thermostatierte Säule und werden durch sie hindurch geleitet (SCHWEDT, 1986).
Das Detektionssystem schließt sich der Säule direkt an und macht das chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Dabei ist das Signal proportional zur Menge der Substanz und wird in Abhängigkeit zur Zeit in Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm zeigt die Retentionszeit der Substanz sowie Höhe und Fläche des Peaks an. Die Retentionszeit entspricht der Zeitspanne von der Injektion bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Über den Vergleich der Fläche der Substanz zur Fläche des internen Standards kann auf die Konzentration der Probe geschlossen werden (MASSMANN, 2004).
In der vorliegenden Studie wurde das HPLC-System direkt mit einem Tandem- Massenspektrometer als Detektionssystem gekoppelt. Es ist sensibler und spezifischer als alle anderen flüssigkeitschromatographischen Detektoren und dient der Darstellung und Identifizierung von Substanzen. Die substanzspezifischen Fragmentierungsmuster lassen Rückschlüsse auf die Strukturformeln der zu identifizierenden Substanzen zu, denn unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Das Massenspektrometer erzeugt nach der Trennung der Substanzen im Flüssigkeitschromatographen einen Strahl gasförmiger Ionen. Hierfür werden die Substanzmoleküle unter atmosphärischem Druck in für die Substanz charakteristische Ionen zerlegt und von den Molekülen des Lösungsmittels getrennt. Die in der Zeiteinheit gebildeten Mengen an Ionen bezeichnet man als Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt- ionenstrom (BUDZIKIEWICZ, 1998).
In dieser Studie wurde als Ionisationsverfahren die chemische Ionisation unter atmosphärischem Druck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) verwendet. Dabei wird der aus der HPLC-Säule austretende flüssige Eluent bei einer Temperatur von 350 bis 550°C in einer evakuierten Verdampfungskammer vernebelt.
An einer Glühkathode werden die gasförmigen Teilchen ionisiert und dem Massenspektrometer zugeleitet. In dem verwendeten Triple-Quadrupole- Massenspektrometer werden die Ionen dreimal hintereinander mittels
