Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den

Plasma und Urin

Vor Beginn dieser Studie stand im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln kein geeignetes Analyseverfahren zum Nachweis von Detomidin und seinen Metaboliten zur Verfügung. Die in dieser Arbeit entwickelte Aufarbeitungsprozedur im Plasma basiert auf einer Routinemethode zur Extraktion basischer Verbindungen. Ether stellt dabei ein geeignetes organisches Lösungsmittel für die apolaren, basischen Verbindungen Detomidin und Medetomidin dar. Im Vergleich von Festphasen- und Extraktion, ergab sich für die Flüssig-Flüssig-Methode ein besseres Extraktionsergebnis, vor allem bei pH 9,6 und 14.

Allerdings wiesen die Chromatogramme der bei pH 9,6 aufgearbeiteten Proben ein hohes Untergrundrauschen auf, was auf endogene Substanzen zurückzuführen war.

Diese sauren oder neutralen Verbindungen gehen überwiegend im neutralen bis schwach basischen pH-Bereich mit in die Etherphase über. Da die Störsignale im pH-Bereich 14 wesentlich geringer ausfielen, wurde dieser als optimaler pH-Wert für die Extraktionsmethode im Plasma angesehen.

In der Literatur wurde die Bildung von Metaboliten des Detomidins im Urin eingehend an Ratten und Pferden untersucht (SEYMOR et al., 1990; CHUI et al., 1991;

SALONEN, 1992; SALONEN et al., 1992). Aus diesen Studien ging ebenfalls hervor, dass Detomidin selbst im Urin nicht oder nur in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden kann (VAKKURI et al., 1987; SALONEN, 1988). In den eigenen Untersuchungen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Es ist deshalb davon auszugehen, dass Detomidin fast vollständig metabolisiert zur Ausscheidung gelangt. Da geplant ist, den analytischen Nachweis von Detomidin bei die Routineuntersuchungen von Pferdedopingproben im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln zu etablieren, war die Entwicklung einer Methode für den Nachweis von Detomidin im Urin somit nicht angezeigt. Stattdessen wurde anhand laborinterner Dokumente eine Aufarbeitungsmethode für die Metaboliten 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin entwickelt. Das von CHUI et al. (1991) erwähnte 4-Hydroxydetomidin wurde nicht in die Messungen mit einbezogen, da das Hauptaugenmerk auf Carboxydetomidin, den Hauptmetaboliten des Detomidin beim Pferd, gerichtet wurde. Bei Carboxydetomidin handelt es sich um eine saure Verbindung, so dass für dessen Analyse und Quantifizierung sowohl ein eigener interner Standard gefunden werden, als auch eine spezielle Extraktion erfolgen mussten. Erst Imidazolylbenzoesäure zeigte aufgrund ihrer Strukturverwandtheit ein ähnliches Extraktionsverhalten wie Carboxydetomidin und wurde deshalb als interner Standard eingesetzt. Obwohl Detomidin und 3-Hydroxydetomidin von ihren Extraktionseigenschaften auch in einer Flüssig-Flüssig-Extraktion hätten gewonnen werden können, wurden erst mit Hilfe einer Ionenaustauschermatrix für alle Substanzen (Detomidin, Medetomidin, 3-Hydroxydetomidin, Carboxydetomidin, Imidazolylbenzoesäure) akzeptabel hohe Ausbeuten erzielt. Mittels Oasis^®

MCX-128 DISKUSSION

Extraktionskartuschen (Waters, Deutschland) wurden Detomidin, Medetomidin und 3-Hydroxydetomidin in den ersten beiden und Carboxydetomidin sowie Imidazolylbenzoesäure im dritten Eluierschritt extrahiert (siehe Punkt 3.3.4.4) und mit einer HPLC/MS/MS-Methode detektiert.

In den an Pferden durchgeführten Studien von SEYMOR et al. (1990) und SALONEN et al. (1992) lagen Carboxydetomidin frei und 3-Hydroxydetomidin sowohl gluko-ronidiert, als auch frei vor. Aufgrund der eigenen Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass 3-Hydroxydetomidin im Urin sowohl glukoronidiert, als auch frei vorliegt. Allerdings wurde durch die Hydrolyse auch der Anteil von Carboxydetomidin im Vergleich zur Aufarbeitung ohne enzymatische Spaltung erhöht. Das bedeutet, dass beide Metaboliten im Urin sowohl frei als auch konjugiert vorliegen. 3-Hydroxydetomidin wird besonders in den ersten vier Stunden, Carboxydetomidin sechs Stunden p. a. glukoronidiert ausgeschieden, so dass eine enzymatische Hydrolyse mit ß-Glucoronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia die Extraktions-ausbeute beider Metaboliten deutlich erhöht. Aufgrunddessen wurden alle Urinausscheidungsproben mit Hydrolyse aufgearbeitet.

Die Wiederfindungsraten von Detomidin im Plasma und Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin im Urin zeigen, dass die Extraktionsprozedur mit Verlusten verbunden ist. Auffällig ist hierbei die geringere Wiederfindungsrate von etwa 50 % bei Detomidin im Plasma im Gegensatz zu 63 bis 69 % bei Detomidin und seinen Metaboliten im Urin. Die relativ gesehen einfachere Aufarbeitungsmethode von Plasma hätte ein umgekehrtes Verhältnis vermuten lassen.

Die Ergebnisse der Validierung belegen die Eignung der HPLC/MS/MS-Analysemethode für den Nachweis von Detomidin, 3-Hydroxydetomidin und Carboxydetomidin. Bei der Überprüfung der Selektivität konnten in Leermatrixproben keine Störpeaks zu den Retentionszeiten der Analyten oder internen Standards ermittelt werden. Die Linearität der Methode für Detomidin wurde im Plasma über einen Konzentrationsbereich von 2,5 bis 50 ng/ml überprüft. Für 3-Hydroxydetomidin lag der Konzentrationsbereich zwischen 10 und 160 ng/ml, für Caboxydetomidin

zwischen 50 und 1600 ng/ml Urin. Für jede Kalibrationskurve konnte ein Regressionskoeffizient von mehr als 0,99 eingehalten werden. Die Kriterien für Richtigkeit und Präzision, eine Abweichung von 15 %, an der unteren Bestimmungs-grenze von 20 %, nicht zu überschreiten, wurden an allen Messtagen, für alle Substanzen erfüllt (EHSLC, 2002). Mit der angewandten Methode liegt die Nachweisgrenze für Detomidin im Plasma bei 1,67 ng/ml, während CHUI et al.

(1991) über eine Nachweisgrenze von 0,5 ng/ml berichten. Die Nachweisgrenze von 3-Hydroxydetomidin im Urin beträgt bei der in der Studie verwendeten Methode 10 ng/ml. Für Carboxydetomidin wurde eine Nachweisgrenze von 50 ng/ml Urin ermittelt. Bisher wurde Carboxydetomidin in keiner Studie quantifiziert, weshalb keine vergleichenden Daten zur Nachweis- und Bestimmunggrenze in der Literatur vorliegen. Die untere Bestimmungs- oder Quantifizierungsgrenze von Detomidin im Plasma liegt bei 2,09 ng/ml. Aufgrund der Ergebnisse von Präzision und Richtigkeit wurde die Bestimmungsgrenze für 3-Hydroxydetomidin im Urin auf 10 ng/ml festgelegt. Die Stabilität von Detomidin und seinen Metaboliten in den jeweiligen Matrices wurde für den Zeitraum der Lagerung der Ausscheidungsproben bei identischen Lagerbedingungen von –20°C überprüft. Der Stabilitätstest der Substanzen im Urin musste über einen längeren Zeitraum erfolgen, da die Aufarbeitung und Messung aller Proben knapp 8 Wochen in Anspruch nahm. Die Plasmaproben wurden innerhalb von 30 Tagen aufgearbeitet, was die Dauer des Stabilitätstestes auf 5 Wochen verkürzte. Es konnte gezeigt werden, dass Detomidin und seine Metaboliten in Plasma und Urin über diese Zeiträume stabil und damit lagerfähig sind.

5.2 Pharmakokinetik von Detomidin im Plasma

Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für Detomidin im Plasma erfolgte bei 10 Pferden. Die maximalen Konzentrationen wurden zwei und fünf Minuten nach der Applikation gemessen, es zeigen sich jedoch interindividuelle Schwankungen in Bezug auf den Zeitpunkt der Höchstkonzentration. Bei fünf Pferden wird die

130 DISKUSSION

individuell gemessene maximale Konzentration bereits nach 2 Minuten, bei den anderen fünf Tieren erst 5 Minuten nach der Applikation erreicht. Zusätzlich variieren die Konzentrationen zum ersten Messzeitpunkt zwischen 12 und 35 ng/ml. Auffällig ist hierbei, dass die niedrigeren Konzentrationen von den Pferden gestellt werden, die erst am zweiten Messzeitpunkt ihre individuelle Höchstkonzentration erreichen.

Zum Zeitpunkt 5 Minuten p. a. werden Konzentrationen zwischen 15 und 30 ng/ml gemessen.

Als Ursache für die Schwankungen der Höchstkonzentration zwischen den ersten beiden Messzeitpunkten könnte eine paravenöse Applikation vermutet werden.

Aufgrund der Verwendung von Venenkathetern, die jeweils kurz vor der Verabreichung des Arzneimittels auf ihren intravasalen Sitz geprüft wurden, wird diese Möglichkeit jedoch als unwahrscheinlich angesehen. Es kann vielmehr der starke negativ chronotrope Einfluss des Detomidins für dieses Phänomen verantwortlich gemacht werden. Am deutlichsten tritt dieser Effekt bei Pferd 7 ein, dessen Herzfrequenz von einer durchschnittlichen Ruhefrequenz von 37 auf 6 Schläge pro Minute innerhalb der ersten 2 Minuten nach der Applikation absank.

Berechnet man den prozentualen Abfall der durchschnittlichen Herzfrequenz für die fünf Pferde mit frühem Konzentrationsmaximum (Ruhewerte im Vergleich der Herzfrequenz zum ersten Probennahmezeitpunkt 2 Minuten p. a.) so sinkt die Schlagfrequenz um 53 %, in Bezug auf den zweiten Probennahmezeitpunkt (5 Minuten p. a.), wird ein Abfall der Herzfrequenz um immernoch 38 % ermittelt. Im Vergleich dazu hatte die Herzfrequenz der Pferde mit Konzentrationsmaximum nach 5 Minuten um 65 % nach 2 Minuten um 43 %, also wesentlich stärker, abgenommen.

Durch die verminderte Schlagfrequenz kann von einer verminderten Herzzeitvolumen (l/min) ausgegangen werden, was zu einem langsameren Transport aller Stoffe im Blut führt. Dies kann bei den fünf Pferden mit spätem Konzentrationsmaximum eine verlangsamte Verteilung des Detomidins im gesamten Blutvolumen zur Folge gehabt haben. Es konnte hingegen keine Auswirkung des unterschiedlichen Absinkens der Herzfrequenz auf die absolute Dauer der Ausscheidung festgestellt werden, da bei allen Pferden innerhalb der ersten halben Stunde nach der Applikation ein deutlicher

Abfall der Plasmakonzentration erfolgte. Auch die Quantifizierungsgrenze war nach 1,5 Stunden von allen Pferden einheitlich unterschritten.

Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten erfolgte nur mit den Werten der höchsten Plasmakonzentration bis einschließlich der Konzentrationen oberhalb der Quantifizierungsgrenze. Obwohl von SALONEN (1986) ein 2-Kompartiment-Modell zur Berechnung pharmakokinetischer Daten für Detomidin herangezogen wurde, war in der vorliegenden Studie aufgrund der Datenlage nur eine Berechnung im 1-Kompartiment-Modell möglich. Als Halbwertszeit wurde eine Zeit von durchschnittlich 18 Minuten errechnet. Damit liegen die Ergebnisse dieser Studie unter den ermittelten Halbwertszeiten von SALONEN (1992) und DYKE (1993), die bei 72 Minuten lagen. Entsprechend ergibt sich eine mittlere Clearance von 26,8 ± 6,7 ml /min. Das Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment beläuft sich im Mittel auf 0,7 ± 0,2 l/kg KM. Dies lässt auf eine gute Verteilung der Substanz im intra- und extrazellulären Raum schließen.