Aus dem Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Coffein und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz
beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Simone Kaiser
aus Euskirchen
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2006
Meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 13
II. LITERATURÜBERSICHT 15
1. Doping im Pferdesport 15
1.1 Definition des Dopingbegriffs 15
1.2 Ziele der Dopingbekämpfung 17
1.3 Durchführung von Dopingkontrollen auf nationaler Ebene 17 1.4 Bewertung von Analyseergebnissen unter dem Gesichtspunkt der
Null-Lösung 18
2. Pharmakokinetische Grundprinzipien 20
2.1 Pharmakokinetische Parameter 20
2.1.1 Bioverfügbarkeit 20
2.1.2 Verteilungsvolumen 22
2.1.3 Clearance 24
2.1.4 Halbwertszeit 24
3. Methylxanthine 25
3.1 Natürliche Quellen und historische Daten 25
3.2 Wirkung undWirkungsmechanismus von Methylxanthinen 27
4. Coffein 30
4.1 Chemisch – physikalische Eigenschaften 30
4.2 Pharmakokinetik 30
4.2.1 Resorption 30
4.2.2 Verteilung 31
4.2.3 Elimination 32
4.3 Pharmakodynamik 37
4.4 Einsatz als Arzneimittel 39
5. Theobromin 40
5.1 Chemisch – physikalische Eigenschaften 40
5.2 Pharmakokinetik 41
5.2.1 Resorption 41
5.2.2 Verteilung 41
5.2.3 Elimination 41
5.3 Pharmakodynamik 43
5.4 Einsatz als Arzneimittel 44
6. Einsatz von Coffein und Theobromin zu Dopingzwecken 45
III. MATERIAL UND METHODE 49
1. Versuchstiere und Haltungsbedingungen 49
2. Testsubstanzen 50
3. Vorversuch 51
4. Hauptversuch 51
4.1 Erhebung der Messwerte 52
4.2 Applikation von Coffein und Theobromin 52
4.3 Entnahme, Verarbeitung und Aufbewahrung der Blutproben 54 4.4 Gewinnung, Verarbeitung und Aufbewahrung der Urinproben 55
4.5 Atemfrequenz und Herzfrequenz 55
5. Analytik 56
5.1 Chemikalien 56
5.2 Geräte und Gerätebedingungen 57
5.3 Herstellung der Standardlösungen 58
5.4 Überprüfung der Messmethode 59
5.5 Aufbereitung der Plasmaproben 60
5.5.1 Aufbereitung der Plasmaproben ohne Proteinausfällung und mit Proteinausfällung über Festphasenextraktion 60 5.5.2 Aufbereitung der Plasmaproben nach Proteinausfällung und
direkter Injektion in die HPLC/MS/MS 61
5.5.3 Optimierte Methode zur Bestimmung von Methylxanthinen in
Plasmaproben 61
5.6 Aufbereitung der Urinproben 63 5.6.1 Aufbereitung der Urinproben mit unterschiedlichen
Extraktionsmodellen 63
5.6.2 Aufbereitung der Urinproben unter unterschiedlichen
pH-Bedingungen 64
5.6.3 Optimierte Methode zur Bestimmung von Methylxanthinen in
Urinproben 65
6. Validierung der Analysemethode 66
6.1 Selektivität 66
6.2 Linearität 67
6.3 Nachweisgrenze 68
6.4 Bestimmungsgrenze 69
6.5 Richtigkeit 69
6.6 Präzision 70
6.7 Stabilität 71
6.8 Wiederfindung 72
7. Pharmakokinetische Auswertung 73
IV. ERGEBNISTEIL 74
1. Flüssigkeitschromatographische und massenspektrometrische Bestimmung der zu analysierenden Substanzen und ihrer internen Standards 74
2. Ergebnisse der Validierung 78
2.1 Selektivität 78
2.2 Linearität 80
2.3 Nachweisgrenze (LOD) 83
2.4 Bestimmungsgrenze (LOQ) 84
2.5 Richtigkeit 85
2.6 Präzision 88
2.7 Stabilität 89
2.8 Wiederfindung 92
3. Ergebnisse des Hauptversuchs 93
3.1 Plasma 93
3.1.1 Pharmakokinetik von Coffein und seinen Metaboliten nach
intravenöser Applikation 93
3.1.2 Pharmakokinetik von Coffein und seinen Metaboliten nach
oraler Applikation 96
3.1.3 Pharmakokinetik von Theobromin und seinen Metaboliten nach
oraler Applikation 98
3.2 Pharmakokinetische Berechnungen 100
3.2.1 Pharmakokinetik von Coffein nach intravenöser Applikation 100 3.2.2 Pharmakokinetik von Coffein nach oraler Applikation 101 3.2.3 Pharmakokinetik von Theobromin nach oraler Applikation 103
3.3 Urin 105
. 3.3.1 Pharmakokinetik von Coffein und seinen Metaboliten nach
intravenöser Applikation 105
3.3.2 Pharmakokinetik von Coffein und seinen Metaboliten nach
oraler Applikation 107
3.3.3 Pharmakokinetik von Theobromin und seinen Metaboliten nach
oraler Applikation 110
4. Pharmakodynamische Effekte von Coffein und Theobromin 112
4.1 Atemfrequenz 112
4.2 Herzfrequenz 112
5. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen
von Coffein 113
6. Berechnung der Ausscheidungszeiten von Coffein und Theobromin 115 6.1 Berechnung der Ausscheidungszeiten von Coffein nach intravenöser 115
Applikation
6.2 Berechnung der Ausscheidungszeiten von Coffein nach oraler
Applikation 116
6.3 Berechnung der Ausscheidungszeiten von Theobromin nach
oraler Applikation 117
V. DISKUSSION 118
1. Analysemethode (HPLC-MS/MS) 118
2. Ausscheidungsverhalten von Coffein und Theobromin 120
3. Bewertung der Ergebnisse 130
VI. ZUSAMMENFASSUNG 132
VII. SUMMARY 134
VIII. LITERATURVERZEICHNIS 136
IX. ANHANG 157
DANKSAGUNG
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
Abb. Abbildung
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation AUC area under the curve
bzw. beziehungsweise
C Konzentration
Cl Clearance
D Gesamtdosis
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EHSLC European Horserace Liaison Committee EPC effektive Plasmakonzentration
ESI Electro Spray Ionisation
F Bioverfügbarkeit
F Freiheitsgrad
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft FEI Fédération Équestre International
FN Fédération National
g Gramm
ºC Grad Celsius
h Stunde
HNED Highest No Effect Dose
HPLC High Performance Liquid Chromatography HQC High Quality Control Standard
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen e.V.
HWZ Halbwertszeit
IPC irrelevante Plasmakonzentration
i.v. intravenös
k12 Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment
k21 Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment
ka Resorptionskonstante
ke Eliminationskonstante
kel Geschwindigkeitskonstante der Elimination
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
l Liter
ln natürlicher Logarithmus
LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantification
LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Low Quality Control Standard m/z Masse zu Ladung Verhältnis
mg Milligramm
mmol Millimol
min Minute
ml Milliliter
MQC Midrange Quality Control Standard
MS Massenspektrometrie
ng Nanogramm
n.n. nicht nachweisbar
p.a. post applicationem
PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch QCS Quality Control Standard
Qx Summe der Abweichungsquadrate
R2 Korrelationskoeffizient
SF Sicherheitsfaktor
Rss Verhältnis von Harn- zu Plasmakonzentration im Steady State
t Zeit
t1/2 Halbwertszeit
tA Ausscheidungszeit
Tab. Tabelle
TINV t-Wert der t-Verteilung
U.S. United States
V Verteilungsvolumen
Vdβ Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady State Vss Verteilungsvolumen im Steady State
WADA World Anti-Doping Agency
z.B. zum Beispiel
I. EINLEITUNG
Bereits in den vierziger bis siebziger Jahren wurde Coffein bei Pferden, Hunden und Menschen in sportlichen Wettkämpfen missbräuchlich aufgrund seiner stimulierenden Effekte zur Leistungssteigerung eingesetzt.
Die Dopingbestimmungen der nationalen und internationalen Pferdesportverbände besagen jedoch, dass jedweder Einsatz von leistungsbeeinflussenden Substanzen, welche fast alle Gruppen pharmakolologisch wirksamer Stoffe beinhalten, verboten ist. Aufgrund der hohen Sensitivität der heute eingesetzten Analysemethoden können viele Wirkstoffe bereits in pharmakologisch nicht wirksamen Konzentrationen detektiert werden (TOBIN et al., 1999).
Das bedeutet, dass der Nachweis dopingrelevanter Stoffe, unabhängig von deren pharmakologischen Effekten, zu entsprechenden Sanktionen führt. Ausnahmen in Form von Grenzwertfestlegung gelten hierbei lediglich für einige Substanzen, die endogenen Ursprungs sind (z.B. Cortisol), sowie für Stoffe, die unter anderem im Rahmen von Futtermittelkontaminationen dopingpositive Ergebnisse herbeiführen können. Für Theobromin beispielsweise, bei welchem es sich um eine solche Futtermittelkontaminante handeln kann, ist ein Grenzwert von 2000 ng/ ml Urin festgesetzt worden.
Es erfolgt keine Unterscheidung zwischen vorsätzlichem Doping, mit dem Ziel der Leistungsbeeinflussung, und unbeabsichtigtem Doping. Letzteres kann z.B. in dem Einsatz eines Stoffes unter therapeutischen Aspekten oder aber in unwissentlicher Fütterung dopingrelevanter Substanzen begründet sein.
Pferdebesitzer, Trainer oder auch Tierärzte sehen sich häufig mit der Fragestellung konfrontiert, welche Karenzzeiten nach Einsatz eines Therapeutikums eingehalten werden müssen, um einem dopingpositiven Befund zu entgehen. Die häufigste Ursache unabsichtlichen Dopings beruht auf der Unkenntnis von Ausscheidungszeiten der Substanzen (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Da das Wissen über die Pharmakokinetik vieler in diesem Zusammenhang relevanter Substanzen unzureichend ist, kann oft keine befriedigende Lösung gefunden werden.
In Anbetracht dieser Problematik wurde ein europaweites Projekt des European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) begründet, welches der Gewinnung pharmakokinetischer Daten von Wirkstoffen und der Standardisierung von Analysemethoden dient. Das EHSLC ist eine 1992 gegründete Vereinigung von Pferdesportverbänden, deren
Mitglieder die Staaten Frankreich, Großbritannien, Irland, Italien und Deutschland sind. Die vorliegende Studie leistet einen Beitrag im Sinne des EHSLCs.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine geeignete Analysemethode für Coffein bzw. Theobromin entwickelt und validiert werden, um anhand eines Ausscheidungsversuches das pharmakokinetische Verhalten dieser Stoffe zu ermitteln.
Dabei wurde das Ausscheidungsverhalten von Coffein bei Pferden nach intravenöser bzw.
nach oraler Applikation untersucht. Ziel war die Überprüfung, ob eine Grenzwertfestsetzung in Hinblick auf die pharmakologische Wirkung dieses Stoffes möglich und überhaupt sinnvoll ist.
Des Weiteren erfolgte die Untersuchung des Ausscheidungsverhaltens von Theobromin bei Pferden nach oraler Applikation. Da es sich bei Theobromin auch um einen Metaboliten des Coffeins handeln kann, diente dieser Versuchsteil insbesondere der Überprüfung, ob anhand des Metabolitenmusters eine Unterscheidung zwischen einem missbräuchlichen Einsatz von Coffein und einer unwissentlichen Verabreichung von Theobromin möglich ist.
II. LITERATURÜBERSICHT
1. Doping im Pferdesport
1.1 Definition des Dopingbegriffs
Unter dem Begriff „Doping“ wird die Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel einer Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen Wettkämpfen verstanden (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Unter diesen Begriff fallen ferner die Verabreichung von Mitteln, die den Nachweis solcher Substanzen beeinträchtigen können sowie insbesondere die Anwendung solcher Substanzen, welche eine der in den Dopinglisten aufgeführten pharmakologischen Wirkungen direkt oder indirekt als Nebenwirkung entfalten (KIETZMANN et al., 2006).
Viele internationale und nationale Pferdesportverbände, zu denen auf nationaler Ebene die Deutsche Reiterliche Vereinigung e.V. (FN), das Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e.V. (DVR) sowie der Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V. (HVT) zählen, führen in ihren Bestimmungen Dopinglisten. Dort sind nahezu alle Gruppen pharmakologisch wirksamer Substanzen aufgeführt. So wird in § 67a „Liste der Verbotenen Substanzen“ der Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V. eine Aufteilung in Dopingsubstanzen, verbotene Arzneimittel und Ausnahmen vorgenommen, wie es Tabelle 1 zu entnehmen ist.
Tab. 1: Liste der verbotenen Substanzen (§ 67a LPO, 2004)
Dopingsubstanzen:
→ Stimulantia
→ Sedativa und Narkotika
→ Anabolika
→ Diuretika
→ Peptidhormone und Analoge
Verbotene Arzneimittel:
Substanzen, die auf
→ das Nervensystem
→ das Herz-Kreislaufsystem
→ das Atmungssystem
→ das Verdauungssystem
→ das Harnsystem
→ das Muskel- und Skelett-System
→ die Geschlechtsorgane
→ die Haut
→ gegen Infektionserreger
wirken
Ausnahmen:
→ Impfstoffe
→ Endoparasitika
→ Paraimmunitäts-Inducer
→ externe Desinfektions- und Insektenschutzmittel
Die in dieser Dissertation behandelten Methylxanthine zählen als Stimulantia und Diuretika sowohl zu den Dopingsubstanzen als auch zu den „verbotenen Arzneimitteln“ aufgrund ihrer Wirkung auf Nerven-, Herz-Kreislauf- und Atmungssystem.
1.2 Ziele der Dopingbekämpfung
Als wichtigster Aspekt für das Dopingverbot bei Tieren ist der Tierschutz zu nennen.
Grundlage hierfür ist das Tierschutzgesetz. § 3 Absatz 1b lautet: „Es ist verboten, an einem Tier im Training oder bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Maßnahmen, die mit erheblichen Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sind und die Leistungsfähigkeit von Tieren beeinflussen können, sowie an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Dopingmittel anzuwenden (Tierschutzgesetz, 2001). Nicht nur der Schutz des Tieres begründet das Dopingverbot. Auch andere Wettkampfteilnehmer sollen vor eventuellen Gefährdungen durch gedopte Tiere, die unerwartete Reaktionen zeigen können, geschützt werden. Die Dopingbekämpfung dient ferner im Sinne des sportethischen Grundsatzes vor allem der Gewährleistung eines fairen, sportlichen Wettkampfes, so dass für alle Wettkampfteilnehmer die gleichen Voraussetzungen gelten. Durch den Einsatz von Dopingmitteln kann es unter anderem zu Vortäuschung eines verbesserten Leistungsstandards kommen, welcher wiederum zur falschen Zuchtauslese führen könnte. Auch hier greift die Dopingbekämpfung ein. Der Schutz vor Täuschung des zahlenden und wettenden Publikums ist ebenfalls zu nennen, wobei in diesem Zusammenhang auch auf die strafrechtliche Relevanz im Hinblick auf einen Betrugstatbestand bzw. eines Verstoßes gegen das Arzneimittel- oder Betäubungsmittelgesetzes hinzuweisen ist (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).
1.3 Durchführung von Dopingkontrollen auf nationaler Ebene
Die systematische Durchführung von Dopingkontrollen beim Pferd findet in Deutschland seit Anfang der siebziger Jahre statt und obliegt im Pferdesport den einzelnen Verbänden.
Dabei werden die Pferde, die einer Dopingkontrolle unterzogen werden sollen, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Liegt ein begründeter Verdachtsfall vor, so kann das Pferd ebenfalls zu jeder Zeit auf das Vorhandensein unerlaubter Mittel untersucht werden. Ein Turniertierarzt nimmt in Anwesenheit eines für das Pferd Verantwortlichen sowie im Beisein des Landeskommissionsbeautragten zwei Urinproben (A-Probe und B-Probe). In der Leistungsprüfungsordnung (LPO) der FN ist genau festgelegt, dass mindestens eine halbe Stunde auf spontan abgesetzten Urin zu warten ist. Erfolgt in dieser Zeit kein Harnabsatz, so muss der Turniertierarzt zwei Blutproben entnehmen. Die für die Harn- bzw. Blutproben
erforderlichen Hilfsmittel und Probenflaschen befinden sich in einem so genannten Medi- Kontroll-Kit, welches von der FN zur Verfügung gestellt wird. Nach der Entnahme sind die Probenflaschen zu versiegeln, mit einem kennzeichnenden Code zu versehen und bis zur Sendung an ein von der FN benanntes Untersuchungslabor bei 4 ºC sicher zu lagern.
Das Analyselabor verwendet für die Untersuchung auf unerlaubte Substanzen die A-Probe, während die B-Probe als Kontrollanalyse im Falle eines Dopingbefundes der A-Probe untersucht wird. Zunächst erfolgt in den Laboratorien eine Übersichtsanalyse. Zeigt sich chromatographisch ein Verdachtsfall, so wird die A-Probe einer Bestätigungsanalyse unterzogen. Wird dann bei der A-Probe ein positives Ergebnis festgestellt, wird dem Besitzer die Möglichkeit gegeben, binnen vier Wochen einen Antrag zur Untersuchung der B-Probe zu stellen, die daraufhin in seinem Beisein untersucht wird. Erweist sich auch diese Probe als positiv oder verzichtet die betroffene Person auf deren Untersuchung, gilt das Pferd als gedopt. Sanktionen von der Disqualifizierung des Reiters bis hin zur Behandlung des Falles als einen Straftatbestand nach dem Tierschutzgesetz sind die Folge (UNGEMACH u.
NÜRNBERGER, 1999; LPO, 2004).
1.4 Bewertung von Analyseergebnissen unter dem Gesichtspunkt der „Null- Lösung“
Der Begriff „Null-Lösung“ beschreibt die aktuelle Vorgehensweise im Kampf gegen den Einsatz von Dopingmitteln und wird nicht nur von Trainern und Pferdebesitzern sondern auch von den betreuenden Tierärzten in Zusammenhang mit der immer sensibler werdenden Analytik als kritisch angesehen. Die „Null-Lösung“ gilt für die meisten Substanzen und bedeutet, dass ein Nachweis einer verbotenen Substanz konzentrationsunabhängig und damit auch unabhängig von pharmakologischen Effekten als ein positives Dopingergebnis gewertet wird. Ausgenommen von dieser Regelung sind lediglich endogen oder aber im Futter vorkommende Substanzen, für welche Grenzwerte in den Listen der Pferdesportverbände aufgeführt sind. So ist beispielsweise für Theobromin sowohl in der Liste der FN als auch in der Liste des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen e.V. ein Grenzwert von 2000 ng/ml aufgeführt. Der Grund dafür liegt darin, dass Kontaminationen der Inhaltstoffe von Pferdefutter mit theobrominhaltigen Kakaoschalen in den achtziger Jahren in England und Irland zu einer Reihe theobrominpositiver Dopingbefunde führte. Die Versuche von Futtermittelherstellern, solche Kontaminationen durch veränderte Produktionsprozesse zu
reduzieren, erwiesen sich als unmöglich (HAYWOOD et al., 1990). Die Festsetzung eines Grenzwertes von 2000 ng/ml Urin für Theobromin stellte nach Ansicht der Pferdesportverbände die geeignetste Möglichkeit dar, positive Theobromindopingbefunde aufgrund von Verschleppung in Futtermitteln auszuschließen.
Die Problematik, dass geringste Konzentrationsnachweise unabhängig vom pharmakologischen Effekt sanktioniert werden, veranlasste TOBIN et al. (1999) zu weiterführenden Untersuchungen. Sie schlugen vor, zunächst die Dosis der dopingrelevanten Substanz experimentell festzustellen, die noch einen pharmakologischen Effekt hervorruft.
Daraufhin soll die Dosis getestet werden, die keine pharmakologische Wirkung mehr vorweist und als „highest no effect dose (HNED)“ bezeichnet wird. Durch eine Gegenüberstellung der entsprechenden Plasmakonzentrationen aus diesen Versuchen kann der so genannte „no effect point“ bestimmt werden. Dieser stellt die Plasmakonzentration dar, bei der eine pharmakologische Wirkung ausgeschlossen wird und der als Grenzwert laut TOBIN et al.
(1999) einsetzbar ist.
TOUTAIN und LASSOURD (2002) veröffentlichten ein Modell, mit Hilfe dessen, basierend auf bereits veröffentlichten pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Daten, ineffektive und somit irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen (IPC bzw. IUC) rechnerisch ermittelt werden können. Diese Werte definieren Substanzkonzentrationen im Plasma und Urin, bei denen jegliche relevanten pharmakologischen Wirkungen in den Tieren ausgeschlossen werden können (TOUTAIN u. LASSOURD, 2002).
Nachteilig bei diesem Modell ist, dass es zum einen nur für systemisch verabreichte Substanzen gilt und zum anderen die Applikation mehrerer pharmakologisch verwandter Substanzen sowie die gleichzeitige Gabe von Substanzen in Verbindung mit Diuretika das Ergebnis verfälschen. Außerdem ist die Anwendung dieses Modells nicht bei Stoffen geeignet, die aufgrund von indirekten Mechanismen eine verlängerte pharmakologische Wirkung aufweisen, obwohl sie im Körper nicht mehr nachweisbar sind (z.B. Anabolika und Sedativa) (TOUTAIN u. LASSOURD, 2002). Als weiteren negativen Aspekt in diesem pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Modell ist die mangelnde Berücksichtigung einer Verteilung von Substanzen (z.B. NSAIDs) in tiefe Kompartimente zu sehen.
Die Berücksichtigung des pharmakologischen Effektes bei der Aufstellung von Grenzwerten spiegelt sich in dem Ziel wieder, absolute Nachweisgrenzen (LOD, „Nulltoleranz“) durch empfohlene Nachweisgrenzen (RLOD, recommended limits of detection) zu ersetzen, wozu das TOUTAIN u. LASSOURD (2002)-Modell seinen Beitrag geleistet hat.
Durch das EHSLC (European Horserace Scientific Liaison Committee) wurde die empfohlene Nachweisgrenze (RLOD) mit der Zielsetzung definiert, dass die entsprechenden Analytiklabore die RLOD der allgemein in der Pferdemedizin eingesetzten Arzneimittel im Rahmen ihrer Untersuchungsverfahren erreichen und somit detektieren können (HOUGHTON, 2004).
Dementsprechend soll zukünftig auch eine Berücksichtigung der pharmakologischen Aspekte in die Bewertung von Dopingergebnissen mit einfließen, so dass eine adäquate medikamentelle Behandlung von im Training befindlichen Pferden möglich wird (HOUGHTON, 2004).
2. Pharmakokinetische Grundprinzipien
Als Teilgebiet der Pharmakologie beschäftigt sich die Pharmakokinetik mit der mathematischen Darstellung der Wirkung des Organismus auf eine Substanz. Sie beschreibt den Verbleib eines in den Organismus gelangten Pharmakons sowohl in örtlicher als auch in zeitlicher Hinsicht (DOST, 1968). Der zeitliche Verlauf der Konzentration eines Pharmakons im Organismus wird durch das Zusammenspiel von Resorption, Verteilung und Elimination bestimmt (FORTH et al., 1996).
2.1 Pharmakokinetische Parameter
Zu den wichtigsten Parametern im Hinblick auf die Beschreibung von Resorption, Verteilung und Elimination zählen die Bioverfügbarkeit, das Verteilungsvolumen, die Clearance und die Halbwertszeit.
2.1.1 Bioverfügbarkeit
Unter Bioverfügbarkeit wird der Teil eines Wirkstoffes verstanden, der aus seiner Zubereitung in das Blut gelangt (KOCH u. RITSCHEL, 1986). Definitionsgemäß ist ein Pharmakon nach intravenöser Gabe zu 100 % bioverfügbar, während die Bioverfügbarkeit bei einer extravasalen Applikation, z.B. oraler Anwendung, in der Regel geringer ist. Ein ausgeprägter hepatischer „first pass“-Effekt kann in diesem Zusammenhang eine große Rolle
spielen. Dabei werden Pharmaka von der Leber aufgenommen und umgewandelt, so dass nur ein Teil der oral verabreichten Dosis in den systemischen Kreislauf gelangt. Quantifiziert wird die Bioverfügbarkeit mittels der „Fläche unter der Konzentrationskurve“ (AUC). Dabei gilt (FICHTL, 2001):
CL
AUC = D [ng/ml*h]
D = Dosis des Wirkstoffes CL = totale Clearance
Nach dem „Prinzip der korrespondierenden Flächen“ (DOST, 1968) ist die Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve, unabhängig von der Art der Zufuhr eines Pharmakons, proportional zu der Menge des Arzneistoffes, die ins systemische Blut gelangt. Wird die nach extravasaler Applikation eines Arzneimittels gemessene AUC mit der nach intravenöser Verabreichung gemessenen AUC verglichen, so erhält man die absolute Bioverfügbarkeit (f):
iv ev
AUC
f = AUC [ng/ml*h]
Vergleicht man bei gleicher Applikationsart die gemessenen Flächen unter der Kurve von zwei Arzneimittelzubereitungen, so wird von der relativen Bioverfügbarkeit gesprochen:
b PRÄPARAT
a PRÄPARAT
AUC
f = AUC [ng/ml*h]
Die AUC alleine reicht jedoch nicht aus, um die Bioäquivalenz, also die Gleichwertigkeit zweier Arzneimittel mit dem gleichen Wirkstoff, zu beschreiben. Die maximale Arzneistoffkonzentration (Cmax) und der Zeitpunkt der maximalen Konzentration (tmax) müssen ebenfalls zur Charakterisierung der Bioäquivalenz von Arzneimitteln berücksichtigt werden (FICHTL, 2001).
2.1.2 Verteilungsvolumen
Das Verteilungsvolumen gibt an, welchen Verteilungsraum (in % vom Körpergewicht bzw.
l/kg Körpergewicht) ein Pharmakon im Organismus einnimmt. Es handelt sich dabei um eine fiktive Größe (GLADTKE u. VON HATTINGBERG, 1977). DOST (1968) definiert das Verteilungsvolumen (V) als Proportionalitätsfaktor zwischen der in einem Organismus vorhandenen Dosis (D) eines Pharmakons und seiner Plasmakonzentration (C). Dabei gilt (DOST, 1986):
C
V = D [l/kg],
so dass sich das Verteilungsvolumen über die Plasmakonzentration nach intravenöser Applikation ermitteln lässt.
Im Rahmen eines Zwei-Kompartiment-Modells, welches die Kinetik der meisten Pharmaka am besten beschreibt (BAGGOT, 1978), gilt folgendes:
Invasion Elimination
Abb. 1: Zwei-Kompartiment-Modell ka = Resorptionskonstante
ke = Eliminationskonstante
k12 = Geschwindigkeitskonstante (Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment) k21 = Geschwindigkeitskonstante (Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment) Dabei wird angenommen, dass sich das Pharmakon nach Applikation zunächst homogen in einem zentralen Kompartiment verteilt. Das zentrale Kompartiment beschreibt dabei sowohl das Plasma als auch gut durchblutete Organe wie Leber, Niere, und Lunge. Unmittelbar nach intravenöser Verabreichung einer Substanz ist das Verteilungsvolumen aufgrund der hohen Plasmakonzentration gering. Die Substanz verteilt sich nun aus dem zentralen Kompartiment
zentrales Kompartiment
peripheres Kompartiment k12 k21k21
ka ke
in das periphere Kompartiment, womit schlechter durchblutete Gewebe, wie beispielsweise Muskulatur oder Haut, gemeint sind. Bei Erreichen des Gleichgewichtes zwischen der Konzentration im zentralen Kompartiment und der Konzentration im peripheren Kompartiment spricht man vom Verteilungsvolumen im Steady-State (Vss), welches sich wie folgt berechnen lässt (FREY, 2002):
÷÷ø çç ö
è æ +
=
21
1 12
k
Vss k [l/kg]
Im weiteren Verlauf nimmt die Plasmakonzentration im Rahmen der Elimination weiter ab, so dass ein Konzentrationsgradient zwischen dem zentralen und dem peripheren Kompartiment entsteht (DERENDORF et al., 2002). Dieser bewirkt eine Rückdiffusion des Stoffes aus dem Gewebe in das Plasma und führt zu dem Zustand des so genannten Pseudo-Steady-State. Die Plasmakonzentration fällt ab, was mit der Hybridkonstanten β beschrieben werden kann (DERENDORF et al., 2002). Zur Berechnung des Verteilungsvolumens in der Eliminationsphase (Vdβ) wird nachfolgende Formel angewandt:
b b
Vd = Cl [l/kg]
Über die Kenntnis der Größe von Flüssigkeitsräumen in einem Organismus, in dem sich ein Arzneimittel verteilt, lassen sich Rückschlüsse auf das Verteilungsvolumen einer Substanz ziehen. Geht man dabei von einer vollständigen Verteilung im gesamten Körperwasser aus, würde das Verteilungsvolumen bei einem ausgewachsenen Tier ca. 0,55 bis 0,60 l/kg Körpergewicht bzw. 55-60 % des Körpergewichtes betragen. Erweist sich das Verteilungsvolumen als höher, so spricht das für eine Akkumulation dieser Pharmaka im Gewebe. Arzneimittel mit einem geringeren Verteilungsvolumen unterliegen einer begrenzten Verteilung im Organismus. Aus einem Verteilungsvolumen von 20 % des Körpergewichtes lässt sich beispielsweise auf eine Verteilung nur im Extrazellularraum schließen, da das extrazelluläre Wasser 20 % des Körpergewichtes ausmacht (LÖSCHER et al., 2003).
2.1.3 Clearance
Die Clearance ist ein Maß für die Fähigkeit des Organismus, ein Pharmakon zu eliminieren.
Die totale Clearance (CL) eines Pharmakons setzt sich aus der renalen Clearance (CLR) und der extrarenalen Clearance (CLNR), die alle nichtrenalen Eliminationsvorgänge (beispielsweise die Metabolisierung in der Leber) beschreibt, zusammen.
Wird ein Pharmakon nach einer Kinetik der 1. Ordnung eliminiert, ist die pro Zeiteinheit (t) eliminierte Menge (M) proportional zur jeweiligen Plasmakonzentration (c), wobei die Clearance (CL) den Proportionalitätsfaktor darstellt (FICHTL, 2001):
c t CL M
= × [ml/h/kg]
2.1.4 Halbwertszeit
Die Halbwertszeit (t1/2) ist diejenige Zeit, nach welcher die Konzentration des Pharmakons im Plasma auf die Hälfte des ursprünglichen Wertes abgesunken ist. Sie ist umgekehrt proportional zur Eliminationskonstanten (DERENDORF et al., 2002):
ke
t ln2
2
1 = [h]
ke = Eliminationskonstante
Sie ist sowohl von der Clearance als auch von dem Verteilungsvolumen abhängig. Je größer die Clearance ist, desto schneller nimmt die Konzentration der Substanz im Plasma ab.
Umgekehrt ist die Konzentrationsabnahme eines Pharmakons umso geringer, je größer das Volumen ist, in dem es sich verteilt (FICHTL, 2001). Diese Abhängigkeit wird durch die nachfolgende Gleichung ausgedrückt:
CL
t1/2 =ln2× V [h]
Als wichtiger Beurteilungsparameter für die Wirkungsdauer sowie für die Berechnung von Dosisintervallen, kann mit Hilfe der Halbwertszeit die Karenzzeit von Medikamenten vor sportlichen Wettkämpfen abgeschätzt werden. Laut KAMMERLIN und OWENS (1994) werden im Allgemeinen fünf Halbwertszeiten benötigt, bis die Substanzkonzentration im Körper zu 97 % abgenommen hat. Die Zeit bis zur vollständigen Elimination einer Substanz ist jedoch von der Anzahl der applizierten Moleküle abhängig. Bis auch das letzte Arzneimittelmolekül eliminiert ist, sind laut TOBIN et al. (1982) 66 bis 77 Halbwertszeiten notwendig.
3. Methylxanthine
Bei den in dieser Studie untersuchten und wohl bekanntesten Vertretern der Methylxanthine Coffein, Theobromin, Theophyllin sowie dem Metaboliten Paraxanthin handelt es sich um zwei- bzw. dreifach methylierte Xanthine. Die gemeinsame Grundstruktur dieser Substanzen ist ein Dioxypurin, das Xanthin, welches mit der Harnsäure strukturell verwandt ist (GRAHAM, 1994). Die Addition von Methylgruppen an unterschiedlichen Positionen dieser Ringstruktur ist für die Bildung der zahlreichen Methylxanthine verantwortlich.
Aufgrund ihrer zentralen und peripheren Wirkung auf das Atem- und Herz-Kreislaufsystem werden Coffein und Theophyllin vor allem in der Humanmedizin als Therapeutikum eingesetzt, finden jedoch unter anderem auch als Stimulantien missbräuchlich Anwendung zu Dopingzwecken bei Wettkämpfen im Pferde- und Hundesport.
3.1 Natürliche Quellen und historische Daten
Coffein, Theobromin und Theophyllin sind nahe verwandte Alkaloide, die zu den ältesten Genuss- und Arzneimitteln zählen. Über 100 Pflanzen unterschiedlicher geographischer Herkunft stellen die natürlichen Quellen von Coffein, Theobromin und Theophyllin dar, aus denen schon seit Jahrhunderten eine Reihe von Getränken und andere Nahrungsmittel hergestellt werden. Dazu zählen beispielsweise die ursprünglich aus Südamerika stammenden Getränke Guaraná, welches aus den Samen von Paullinia cupana oder Paullinia sorbilis hergestellt wird, oder aber Yoco, aus der Rinde von Paullinia yoco gebraut. Auch maté, gewonnen aus dem Aufguss von Ilex paraguariensis, einer Stechpalmenspezies, zählt zu diesen traditionellen Getränken (RALL, 1990).
Zu den populärsten methylxanthinhaltigen Nahrungsmitteln zählen Kaffee, Tee, Cola, Kakao und Schokolade.
Als Rohkaffee wird laut Kaffeeverordnung von 1981 der von der Frucht- und Samenschale befreite, ungeröstete Samen von Pflanzen der Gattung Coffea bezeichnet. Zur Kaffeeproduktion wird hauptsächlich Rohkaffee der Arten Coffea arabica, Coffea canephora var. robusta sowie Coffea arabusta, eine Kreuzung beider erstgenannten Arten eingesetzt. Erst im siebzehnten Jahrhundert hielt das Kaffeegetränk Einzug in Europa (VIANI, 1993). Man hatte festgestellt, dass die Kaffeebohne, die von Reisenden im Horn von Afrika zur Vertreibung der Müdigkeit gekaut wurde, im gerösteten Zustand einen aromatischen, starken, etwas bitter und säuerlichen Geschmack hatten (VIANI, 1993). Reines, kristallines Coffein wurde zum ersten Mal 1820 von RUNGE isoliert. Heute ist bekannt, dass neben Coffein (9000 bis 14000 mg/kg Kaffeebohnen) auch Theobromin (36 bis 40 mg/kg Kaffeebohnen), Theophyllin (7 bis 23 mg/kg Kaffeebohnen) und Paraxanthin (3 bis 4 mg/kg Kaffeebohnen) in der Frucht der Kaffeepflanze enthalten sind (GARATTINI, 1993).
Auch Tee wurde in Europa erst im siebzehnten Jahrhundert bekannt und gilt immer noch als das bekannteste Heißgetränk in der Welt. Grüner oder schwarzer Tee wird aus den Blättern der Pflanze „Thea sinensis“ durch den Aufguss heißen Wassers zubereitet (RALL, 1990). Die Pflanze stammt ursprünglich aus Südchina und wird mittlerweile auch in anderen Ländern wie Sri Lanka, Indien, Kenia oder Indonesien kultiviert (WEISS, 1996). Teeblätter enthalten neben Coffein (4 % der Trockenmasse) auch kleine Mengen an Theobromin und Theophyllin (FINGER, 1991).
Sowohl kakaohaltige Getränke als auch Schokolade werden aus den Samen und der Schale der Pflanze Theobroma cacao hergestellt (LOEFFLER, 2000) und enthalten neben dem Hauptalkaloid Theobromin, welches 1842 erstmals von WOSKRESENSKY isoliert wurde auch kleine Mengen an Coffein (ARNOUD, 1984).
Aus Tabelle 2 werden die prozentualen Anteile an Coffein und Theobromin in Kaffeebohnen, Teeblättern und Kakaobohnen bzw. -schalen ersichtlich.
Tab. 2: Prozentualer Anteil der Methylxanthine Coffein und Theobromin in Kaffeebohnen, Teeblättern und Kakaobohnen und -schalen (VIANI, 1993)
Coffein (%) Theobromin (%)
Kaffeebohnen 1 bis 2 in Spuren Teeblättern 3 bis 4 in Spuren Kakaobohnen
Kakaoschalen
in Spuren in Spuren
1,5 bis 3 0,7 bis 1,2
3.2 Wirkung und Wirkungsmechanismus von Methylxanthinen
Zentrale Wirkungen
In therapeutischen Dosen wirken die Methylxanthine stimulierend auf die Großhirnrinde und führen somit zu einem Anstieg der psychischen und motorischen Funktionen (BOOTH, 1977). So führt die Stimulation des Zentralnervensystems zu einer Beseitigung der Müdigkeit und steigert die Aufmerksamkeit (CHOU, 2003). Eine Erhöhung der CO2-Empfindlichkeit des Atemzentrums und eine damit einhergehende Steigerung des Atemminutenvolumens wird diesen zentralen Analeptika ebenfalls zugeschrieben (RALL, 1993).
Periphere Wirkungen
Peripher zeichnen sich die Xanthinderivate zum einen durch eine Relaxation der glatten Muskulatur im Bronchialbereich aus, so dass sie therapeutisch als Antiasthmatika angewandt werden (RALL, 1983). Zum anderen wirken sie auf das Herz-Kreislaufsystem stimulierend ein, indem sie die Herzmuskulatur anregen. Dies führt gemeinsam mit einer hervorgerufenen peripheren Vasodilation zu einer verstärkten Organdurchblutung (RALL, 1980). Im cerebrovaskulären System verursachen diese Alkaloide jedoch eine Vasokonstriktion, so dass es zu einem vermindertem cerebralen Blutfluss und einem geringeren Sauerstoffpartialdruck kommt. Aufgrund dieser Vasokonstriktion wird Coffein häufig als Arzneimittel zur Behandlung von migräneartigen Kopfschmerzen eingesetzt (RALL, 1980). Eine Steigerung der Leistungsbereitschaft quergestreifter Muskulatur wird den Methylxanthinen ebenfalls zugeschrieben. Dies hat durch eine Beeinflussung der Zwerchfellmuskulatur auch einen positiven Effekt auf die Atmung. Theophyllin, aber auch Coffein und Theobromin bewirken an den Nieren eine verstärkte Diurese, was auf einer gesteigerten Organdurchblutung basiert (ARNOUD, 1977). Sie erhöhen ferner speziesabhängig die Sekretion von Magensäure und Pepsin und führen zu einer vermehrten Freisetzung von Hormonen der Nebenschilddrüse.
Eine vermehrte Lipolyse und Glykogenolyse sind unter anderem die Folge (GRAHAM et al., 1994).
Die einzelnen Xanthinderivate weisen Unterschiede in ihrer Wirkungspotenz auf, die der Tabelle 3 zu entnehmen sind.
Tab. 3: Unterschiede der Wirkungspotenz von Coffein, Theophyllin und Theobromin (LÖSCHER, 2003)
Wirkung Coffein Theophyllin Theobromin
zentrale Erregung +++ ++ -
Stimulation des Herzens + +++ ++
Stimulation der Skelettmuskulatur +++ ++ +
Relaxation der glatten Muskulatur ++ +++ +++
Steigerung der Diurese + +++ ++
Diese Wirkungen basieren überwiegend auf drei Hauptmechanismen, zu denen die Kalziummobilisation, die unspezifische Hemmung der Phosphodiesterase sowie insbesondere der Adenosinrezeptor-Antagonismus zu zählen sind (CHOU, 2003).
Kalziummobilisation
Bereits 1961 zeigte BIANCHI anhand von Versuchen am Musculus satorius des Frosches, dass die Applikation von Coffein schnelle und lange andauernde Kontraktionen der quergestreiften Muskulatur verursacht, die auf einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration zurückzuführen sind. Beruhend auf einer vermehrten Freisetzung von Kalzium aus den terminalen Zisternen des sarkoplasmatischen Retikulums sowie auf einer Hemmung der Rückspeicherung (JOHNSON u. INESI, 1969), wird der Schwellenwert für die Exitation erniedrigt und die aktive Periode der Kontraktion ausgedehnt (GRAHAM, 1994).
Laut KATZ et al. (1977) ist zum Erreichen der Kalziummobilisation eine intrazelluläre Coffeinkonzentration von 0,25 mmol/l nötig. DALY (1993) spricht sogar von 1 bis 10 mmol/l.
Hemmung der Phosphodiesterase
Methylxanthine sind schwache und unspezifische Inhibitoren der Phosphodiesterase, einem Enzym, welches für den Abbau des zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) sowie des zyklischen Guanosinmonophosphats (cGMP) zuständig ist (SAWYNOK u. YAKSH, 1993).
Eine solche Inhibition, die eine Coffeinkonzentration von 500 bis 1000 µmol/l erfordert
(DALY, 1983), führt zum Anstieg des cAMP im Zytosol, woraus beispielsweise die Relaxation der glatten Muskulatur resultiert (SAWYNOK u. YAKSH, 1993).
Adenosinrezeptor - Antagonismus
Die beiden erstgenannten Mechanismen finden erst ab höheren Coffeinkonzentrationen im Plasma statt. Die Wirkungen der Methylxanthine können jedoch schon nach dem Genuss einer Tasse Kaffee, der zu einer Coffeinkonzentration von 2 bis 15 µmol/l im Plasma führt, beobachtet werden. Dies spricht dafür, dass die beiden erstgenannten Mechanismen nur einen begrenzten Beitrag zu den Wirkungen der Methylxanthine leisten (FREDHOLM, 1994). Der bis heute einzige bekannte Mechanismus, der bei solch geringen Konzentrationen die typischen Wirkungen der Xanthinderivate hervorruft, ist der Adenosinrezeptor-Antagonismus (DALY et al., 1981).
Adenosin ist ein ubiquitär vorkommendes Nucleosid, welches sich aus einer Ribose und Adenin zusammensetzt (LÖFFLER u. PETRIDES, 1998) und als Bestandteil von Adenosinmonophosphat sowie Adenosintriphosphat an vielen Stoffwechselvorgängen mitwirkt. Unter anderem wirkt Adenosin negativ ino- und chronotrop, peripher vasodilatatorisch, in der Niere jedoch vasokonstriktorisch (FREDHOLM, 1980). Es beeinflusst die Freisetzung von Neurotransmittern, hemmt die Thrombozytenaggregation und die Lipolyse (GRAHAM, 1994).
Insgesamt gibt es vier membrangebundene Adenosinrezeptoren: A1, A2a, A2b, A3, die in nahezu allen Geweben vorkommen (FREDHOLM, 1995). A1 und A2a weisen eine hohe Bindungsaffinität für Adenosin auf und sind Hauptangriffspunkte für die Adenosinantagonisten (DALY et al., 1983). Über eine G-Protein vermittelte Reaktion kommt es zur Beeinflussung der Adenylatcyclase, einem Effektorprotein (LÜLLMANN u. MOHR, 2001). Während die Bindung an einen A1-Rezeptor eine Hemmung der Adenylatcyclase hervorruft, führt die Interaktion mit einem A2a-Rezeptor zur Aktivierung dieses Effektorproteins, welches ATP in cAMP umwandelt (DALY et al., 1983). Das zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) ist seinerseits in der Lage die Aktivität der Proteinkinase A zu erhöhen, welche die Phosphorylierung von Funktionsproteinen katalysiert. Wie bereits erwähnt, wird das cAMP durch die Phosphodiesterase abgebaut und inaktiviert (LÜLLMANN u. MOHR, 2001).
Methylxanthine fungieren dabei als Antagonisten von Adenosin, wobei es zur Blockade der Rezeptoren kommt, so dass die Signalkaskade nicht ausgelöst wird. Während die stimulativen
Effekte von Coffein auf eine A2a-Rezeptorblockade zurückzuführen sind, werden die depressiven Wirkungen in Form von tonisch-klonischen Krämpfen bei höheren Coffeinkonzentrationen durch einen Antagonismus der A1-Rezeptoren ausgelöst (DALY et al., 1983; YACOUBI et al., 2000).
4. Coffein
Wie bereits erwähnt, weist das Genussmittel Kaffee einen hohen Coffeingehalt auf. Dieser ist nicht nur von der Kaffeepflanzenart abhängig. Auch das Brühverfahren führt zu unterschiedlichen Coffeingehalten im Kaffee. So werden pro 150 ml Kaffee 3 mg Coffein in entkoffeiniertem Kaffee, 60 mg Coffein in Instantkaffee und 85 mg Coffein in Filterkaffee angegeben (BURG, 1975).
4.1 Chemisch – physikalische Eigenschaften
Coffein ist ein 1,3,7–Trimethylxanthin mit der Summenformel C8H10N4O2 (MERCK INDEX, 2001). Das Molekulargewicht dieses Purinderivates beträgt 194,19 g/mol und der Schmelzpunkt liegt bei 298 ºC (MERCK INDEX, 2001). Es handelt sich um eine geruchlose, weiße Substanz in kristalliner Form, die mit einem pKb von 14,15 eine schwache Base darstellt. Bei Raumtemperatur löst sich 1 g Coffein in 46 ml Wasser, in 5,5 ml Chloroform, in 530 ml Ether und in 100 ml Benzol. Die Löslichkeit in Wasser wird durch die Komplexbildung mit beispielsweise alkalischen Benzoaten oder aber Citraten und Salicylaten erhöht. So werden für die Lösung des sauren Coffeincitrats 1 Teil Coffeincitrat und 4 Teile Wasser benötigt (MERCK INDEX, 2001). Eine wässerige Coffeinlösung weist im ultravioletten Licht laut ARNAUD (1987) ein Absorptionsmaximum von 272 nm auf.
4.2 Pharmakokinetik
4.2.1 Resorption
Die Resorption von oral appliziertem Coffein aus dem Gastrointestinaltrakt erfolgt beim
eingenommen wird, sei es in Form von Getränken, Schokolade oder Tabletten, scheint keine Rolle zu spielen (SINCLAIR u. GEIGER, 2000). FREDHOLM (1995) berichtete jedoch von einer geringeren Resorptionsrate beim Menschen nach Aufnahme von Coffein in Form von Kaffee. Nach oraler Einnahme von Coffein werden maximale Plasmakonzentrationen nach 15 bis 120 Minuten erreicht (SINCLAIR u. GEIGER, 2000; BONATI et al., 1982).
Bei Hunden zeigt die Aufnahme von Coffein in Form von Kaffee eine gute Bioverfügbarkeit (62 ± 28 %), während die Resorption von Coffein aus Tee mit 26 ± 12 % deutlich geringer ist (LOEFFLER et al., 2000). Nach oraler Applikation von Coffein als Arzneimittelform konnte LOEFFLER (2000) eine 93 % Bioverfügbarkeit bei Beagles feststellen. Auch bei Windhunden konnte eine nahezu vollständige Resorption von Coffein als Arzneimittel aus dem Magen-Darm-Trakt beobachtet werden (CLIFFORD, 1987). Maximale Plasmakonzentrationen treten beim Hund nach durchschnittlich 1,5 Stunden auf (LOEFFLER, 2000).
Bei Ratten zeigt sich sowohl nach oraler als auch nach intraperitonealer Applikation von Coffein eine 100 %ige Resorption (ARNOUD, 1985; WANG, 1998). Maximale Plasmakonzentrationen werden bereits nach 5 Minuten erreicht (WANG, 1998).
Beim Pferd hingegen wird oral verabreichtes Coffein langsamer resorbiert und die Bioverfügbarkeit beträgt lediglich 39 % (GREEN et al., 1983). Maximale Plasmakonzentrationen sind nach 30 bis 120 Minuten zu beobachten (MOSS et al., 1979; TSE u. VALIA, 1981; GREEN et al., 1983; TODI et al., 1999). COLAHAN et al. (2002) berichteten von 10 Minuten bis vier Stunden.
4.2.2 Verteilung
Aufgrund seiner ausreichend hydrophoben Eigenschaften verteilt sich Coffein im gesamten Körper. Daher ist es sowohl beim Menschen als auch beim Tier in allen Körperflüssigkeiten nachweisbar, wobei das Verteilungsvolumen von Coffein mit 0,4 bis 0,6 l/kg für eine nahezu vollständige Verteilung im Körper spricht (RALL, 1991).
Die Proteinbindung von Coffein im Pferdeplasma beträgt je nach Literaturangabe zwischen 2 und 17 % (KELLY u. LAMBERT, 1978; GREEN et al., 1983; CHOU et al., 2001).
Coffein passiert alle biologischen Membranen (ARNOUD, 1993). Untersuchungen der Passage von Coffein durch die Blut-Hirnschranke zeigten ein Verhältnis der Coffeinkonzentrationen zwischen Gehirn und Plasma von 0,8 (McCALL et al., 1982).
STÅHLE et al. (1991) fanden zudem heraus, dass die Penetration von Coffein ins Gehirn im
Vergleich zu Theophyllin wesentlich höher ist. Die Passage der Plazentarschranke aber auch das Vorhandensein von Coffein in der Milch führt bei Föten sowie neugeborenen Kindern im Vergleich zu Adulten zu erhöhten Coffeinspiegeln (KHANNA et al., 1984; IKEDA et al., 1982). Außerdem ist Coffein sowohl in den Gonaden als auch im Samen nachweisbar, wobei sich laut BEACH et al. (1984) gleiche Coffeinspiegel wie im Plasma ergeben. In Speichel und in Schweiß findet ebenfalls eine Coffeinverteilung statt. KOVACS et al. (1998) fanden heraus, dass der Gehalt an Coffein im menschlichen Schweiß sogar die Coffeinkonzentration im Urin nach körperlicher Beanspruchung übersteigt.
Auch die Coffeinmetaboliten Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin werden in den Körperflüssigkeiten detektiert. Während beim Menschen der prozentuale Anteil von Paraxanthin im Verhältnis zu den beiden anderen Metaboliten um das zehnfache höher ist (ARNOUD, 1993), zeigen sich bei den Tierarten unterschiedliche Charakteristika. Während die drei Metaboliten bei Mäusen in ähnlicher Konzentration im Plasma vorzufinden sind (BONATI u. GARATTINI, 1984), zeigt sich beim Affen eine Verschiebung zu Gunsten des Theophyllins (GILBERT et al., 1986). Im Pferdeplasma ist Theophyllin der Hauptmetabolit und weist eine um das zwei bis dreifache höhere Konzentration als Theobromin auf (CHOU et al., 2001; PECK et al., 1997).
4.2.3 Elimination
Metabolismus
Der Metabolismus der Methylxanthine findet hauptsächlich in der Leber statt und ist durch oxidative Stickstoff-Demethylierung, Kohlenstoff-Oxidation und Acetylierung gekennzeichnet. Diese chemischen Umwandlungsprozesse erfolgen alle, bis auf die Oxidation am [C8]-Atom, in den Lebermikrosomen. Dabei ist der Metabolismus der Phase 1-Reaktion Cytochrom P-450 abhängig.
Der Hauptmetabolisierungsweg des Trimethylxanthins ist charakterisiert durch die Abspaltung einer der Methylgruppen vom Xanthinring an Position 1, 3 und 7, so dass Theobromin (3,7-Dimethylxanthin), Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) und Paraxanthin (1,7-Dimethylxanthin) entstehen. Im weiteren Verlauf können diese Dimethylxanthine zu Monomethylxanthinen, Methylharnsäuren und Uracilen metabolisiert werden. In Abbildung 2 sind die einzelnen Metabolisierungsschritte aufgeführt.
Theobromin Theophyllin Paraxanthin
AF1MU
AF3MU
3-Methlyxantin 1-Methlyxantin 7-Methlyxantin
3,7-Dimethylharnsäure 1,3-Dimethylharnsäure 1,7-Dimethylharnsäure
DMA 3-Methylharnsäure 1-Methylharnsäure 7-Methylharnsäure
Abb. 2: Coffeinmetabolismus (nach ALY, 1981)
AF1MU = 6-Amino-5[N-Formylmethyl-Amino]-1-Methyluracil AF3MU = 6-Amino-5[N-Formylmethyl-Amino]-3-Methyluracil DMA = 3,8-(1,6)Dimethylallantoin
Der Hauptmetabolisierungsweg kann vereinfacht in folgende Schritte unterteilt werden:
1. Mittels oxidativer Demethylierung wird eine der Methylgruppen entfernt, wodurch die Dimethylxanthine Theophyllin, Theobromin und Paraxanthin gebildet werden. Eine weitere Demethylierung führt zu den Monomethylxanthinen.
2. Durch die Oxidation entsteht ein Harnsäurederivat.
3. Hydratation und Oxidation mit einer Ringspaltung bilden ein Uracilderivat.
Coffein
Eine Rückumwandlung von Theophyllin zu Coffein, wie es aus der Abbildung ersichtlich ist, wurde erstmals bei neugeborenen Kindern entdeckt, die zur Therapie von Apnoe mit Theophyllin behandelt wurden. Die erhöhte Coffeinkonzentration in diesen Kindern erklärt sich aus der Unreife der mikrosomalen Leberenzyme. In Erwachsenen konnte dieses Phänomen ebenfalls entdeckt werden und macht sogar einen Anteil von 6 % der Theophyllindosis aus (ARNOUD, 1985). TODI et al. (1999) bestätigten diesen Umwandlungsprozess auch beim Pferd, was im Rahmen der Dopingproblematik zur Unterscheidung, ob Coffein oder Theophyllin appliziert wurde, von großem Interesse ist. Eine Entstehung von Coffein aus Theobromin oder Paraxanthin mittels Methylierung ist der Literatur jedoch nicht entnehmbar.
Hauptkatalysator der oxidativen Demethylierung ist eine Isoform des Cytochroms P-450 (CYP1A2), einem Enzym, welches unter anderem für die Aktivierung einer Reihe von Promutagenen und Prokarcinogenen verantwortlich ist (GUENGERICH, 1990) und sowohl in Lebermikrosomen als auch im Gehirn und in der Niere vorkommt (SINCLAIR u. GEIGER, 2000). Neue Studien haben ergeben, dass auch andere Enzyme an der Demethylierung beteiligt sind. So entdeckten GU et al. (1991), dass eine durch Ethanol aktivierbare Isoform des Cytochroms P-450 (CYP2E1) zusätzlich die Biotransformation von Coffein zu Theophyllin und Theobromin beeinflusst. CHUNG und CHA (1997) stellten hingegen fest, dass eine Flavinmonooxygenase für die Bildung von Theophyllin und Theobromin zuständig ist.
Alle Autoren sind sich jedoch dahingehend einig, dass die N3-Demethylierung von Coffein zu Paraxanthin durch P-4501A2 erfolgt. In Abbildung 3 wird die Metabolisierung von Coffein in die drei aktiven Hauptmetaboliten durch die unterschiedlichen Isoformen Cytochrom P- 4501A2 (CYP1A2), Cytochrom P-4502E1 (CYP2E1) und flavinenthaltene Monooxygenase (FMO) veranschaulicht.
Abb. 3: Umwandlung von Coffein in Theophyllin, Theobromin und Paraxanthin unter Beteiligung der Enzyme CYP1A2, CYP2E1 und FMO
Diese Metabolisierung wird zwar bei allen Säugetierarten beobachtet, variiert jedoch in Abhängigkeit von der Effizienz der einzelnen Leberenzyme, die bei den Säugetierarten in unterschiedlichen Ausmaßen aktiv sind. Unterschiede der Pharmakokinetik und des quantitativen Produktprofils sind die Folge (BONATI u. GARATTINI, 1984).
Beim Menschen ist beispielsweise die Demethylierung an N3 durch P-4501A2 vorherrschend, so dass Paraxanthin mit 84 % den größten Anteil der biologisch aktiven Metaboliten im Urin ausmacht. Theobromin kommt zu 11 % vor, gefolgt von Theophyllin mit 4 % (LELO et al., 1986). Beim Hund tritt Theobromin als Hauptmetabolit des Coffeins im Urin auf (LOEFFLER et al., 2001).
Bei Mäusen und Ratten ist die Demethylierung an N3 häufiger, so dass der Paraxanthinanteil im Urin etwas höher ausfällt (BONATI u. GARATTINI, 1984). Die Ratte ist auch das einzige Tier, welches ein Allantoinderivat bildet (ARNOUD, 1985). Beim Schaf ist Theophyllin mit 72 % der Hauptmetabolit im Urin, während es beim Rind Paraxanthin mit 76 % ist. Ein Ausscheidungsversuch von SALVADORI et al. (1994) zeigte, dass beim Pferd nach oraler Applikation von Guaraná-Pulver die Methylharnsäuren (1,3- und 1,7-Dimethylharnsäure sowie 1,3,7-Trimethylharnsäure) mit 30 % den größten Anteil am Metabolitenmuster im Urin ausmachten. Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin folgten mit insgesamt 15 %.
Eine Reihe von Faktoren, zu denen z.B. genetische Aspekte, Alter, häufige Einnahme von Coffein, sportliche Aktivitäten, Ernährung sowie die Anwendung bestimmter anderer Substanzen zählen, beeinflussen den Metabolisierungsprozess.
Die Aktivität der N-Acetyltransferase wird beispielsweise genetisch determiniert und kann zu einem unterschiedlichen Metabolisierungsmuster führen. Juvenile Säugetiere weisen einen
Theophyllin
(1,3-Dimethylxanthin) Theobromin
(3,7-Dimethylxanthin)
Paraxanthin (1,7-Dimethylxanthin) CYP1A2
CYP2E1 FMO
CYP1A2 CYP2E1 FMO
CYP1A2 Coffein
(1,3,7-Trimethylxanthin)
stark verlangsamten Abbau von Coffein auf, der auf die noch nicht vollständig entwickelte Aktivität der Leberenzyme zurückzuführen ist (BLANCHARD et al., 1985). So steigt bei Hunden der Prozentsatz der demethylierten Harnsäuren und der Uracilderivate mit zunehmendem Alter an (WARSZAWSKI et al., 1982). Häufiger Konsum von Coffein führt zu einer Induktion des Coffeinmetabolismus, der aus einer Hochregulation von Cytochrom P- 4501A2 mit steigender Coffeinaffinität resultiert. Auf diese Weise steigert Coffein seine eigene Umwandlung, was zur Coffeintoleranz führen kann. Sportliches Training steigert ebenfalls die Expression von CYP1A2. Der Metabolismus von Coffein wird beim Menschen beispielsweise auch durch Rauchen und die Aufnahme von Kohl und anderen Cruziferengemüsearten angeregt (SINCLAIR u. GEIGER, 2000). Im Gegensatz dazu bewirken orale Contraceptiva beim Menschen eine Reduzierung der CYP1A2 Aktivität, was in einer Verminderung der Coffeinumwandlung resultiert. Viele Substanzen, die ebenfalls hauptsächlich in der Leber abgebaut werden, wie beispielsweise das Antidepressivum Fluvoxamin oder Alkohol, führen zu einer kompetitiven Hemmung des Coffeinmetabolismus (JEPPESEN et al., 1996; LE MARCHAND et al., 1997).
Exkretion
Die Ausscheidung von Coffein erfolgt nach einer Eliminationskinetik 1. Ordnung hauptsächlich renal, wobei der Anteil an reinem Coffein im Urin beim Menschen lediglich 0,5 bis 2 % (ARNOUD, 1993), beim Hund 1 % (CLIFFORD, 1987) und beim Pferd weniger als 4 % beträgt (SALVADORI et al., 1994). Die geringe Coffeinkonzentration im Urin resultiert zum einen aus einer nahezu vollständigen renalen tubulären Reabsorption von Coffein, zum anderen zeigt es, dass der Metabolismus einer der limitierenden Faktoren in der Plasmaclearance ist (ARNOUD, 1993). Auch eine Ausscheidung von Coffein über die Faeces wird beschrieben, wobei diese beim Menschen 2 bis 5 % und bei Ratten 8 bis 10 % beträgt (ARNOUD, 1976).
Die Pharmakokinetik von Coffein wird in der Literatur sowohl beim Menschen als auch bei verschiedenen Tierarten von einer Vielzahl von Autoren beschrieben. Zur besseren Übersicht sind einige dieser pharmakokinetischen Daten mit den entsprechenden Literaturhinweisen in Tabelle 4 aufgeführt.
Tab. 4: Pharmakokinetische Daten von Coffein nach oraler Applikation von Coffein bei verschiedenen Säugetierarten
orale
tmax t1/2
Haupt- Haupt-
Literatur-
Bioverfüg- metabolit metabolit
barkeit im im angaben
[%] [min] [h] Plasma Urin
Mensch
4 mg/kg: PX 1, 2
100 15-120 2,5-4,5 PX (CO: 0,5-2%) 3, 4
Hund
aus Kaffee: 62 insgesamt: aus Kaffee: 4 TB 5
aus Tee: 26 15-90 aus Tee: 2 (CO: 1 %) TB 6
Reinform: 93
Ratte/Maus
< 10 mg/kg: TY, TB, PX: PX etwas 7
100 30-120 0,7-1,2 gleiche höhere 8
Konzentration Konzentration
Pferd
4 mg/kg: Methyl- 9, 10
39 10-240 42 TY harnsäuren 11, 12
(CO: < 4 %) 13, 14, 15
Literaturglossar der Tabelle:
(1): ARNOUD, 1987, (2): ARNOUD, 1993, (3): SINCLAIR u. GEIGER, 2000, (4): BONATI et al., 1982, (5): LOEFFLER, 2000, (6): CLIFFORD, 1987, (7): ARNOUD, 1985, (8): WANG et al., 1998, (9): GREEN et al., 1983, (10): MOSS et al., 1979, (11): TSE u. VALIA, 1981, (12): COLAHAN, 2002, (13): CHOU et al., 2001, (14): PECK et al., 1979, (15): SALVADORI et al., 1994 tmax = Zeit bis Erreichen der maximalen Plasmakonzentration
t1/2 = Plasmahalbwertszeit CO: = Coffein
TB: = Theobromin TY: = Theophyllin PX: = Paraxanthin
4.3 Pharmakodynamik
Psychopharmakologische Effekte
Nach oraler Aufnahme von durchschnittlich 85 bis 250 mg Coffein (ein bis drei Tassen Kaffee) kann beim Menschen neben einer Reduzierung der Müdigkeit die Verbesserung der Konzentrationsfähigkeit beobachtet werden. Zusätzlich zu diesen psychischen Effekten wirkt Coffein auf die motorischen Zentren des zentralen Nervensystems, was sich jedoch trotz der in zahlreichen Studien beschriebenen Leistungsverbesserung in einer negativen Wirkung
äußert. So wird von verminderten Reaktionszeiten und verschlechterter Muskelkoordination berichtet (COSTILL et al., 1983).
Im Verhältnis zu anderen Psychostimulantien, wie z. B. Amphetamine, sind die Effekte von Coffein allerdings eher als moderat einzustufen (BÄTTIG u. WELZL, 1993).
Dennoch kommt es bei höherer Coffeindosierung (über 15 mg/kg Körpergewicht) beim Menschen zu Schlaflosigkeit, vermehrter Nervosität und Angstzuständen. Es können fokale und generalisierte Krampfanfälle bis hin zu Herzversagen mit letalem Ausgang bei einer toxischen Dosis von 200 mg pro kg Körpergewicht auftreten (ARNOUD, 1987; SERAFIN, 1995). Die letale Dosis beim Hund beträgt laut SUTTON (1981) 110 bis 175 mg Coffein pro kg Körpergewicht und bei der Katze 80 bis 150 mg/kg Körpergewicht (FOOR u. STOWE, 1975). Beim Pferd kann die intravenöse Applikation von 10 bis 30 mg Coffein pro kg Körpergewicht bereits unspezifische Vergiftungssymptome wie Unruhe, Erregungserscheinungen bis hin zu Krämpfen, Muskelrigidität und Muskelzittern auslösen (UNGEMACH, 2003). Tachykardie und Tachyarrhythmie sind ebenfalls Effekte, die bei toxischen Dosierungen zum Tod führen können (BÄTTIG u. WELZL, 1993). Diese Wirkungen werden zwar auch durch Effekte in der Peripherie ausgelöst, resultieren aber hauptsächlich aus einer vermehrten Stimulation des Stammhirns, in dem sich die autonomen Zentren für Atmung und Kreislauf befinden (BÄTTIG u. WELZL, 1993). Der Adenosinantagonismus mit einer dopaminergen Reaktion wird für die zentralen Reaktionen verantwortlich gemacht. DALY et al. (1983) fanden heraus, dass die Bindung von Paraxanthin, Theophyllin sowie 1-Methylxanthin an die im Gehirn vorkommenden Adenosinrezeptoren höher ist als bei Coffein. Die potentere zentrale Wirkung des Coffeins im Verhältnis zu Theophyllin erklärt sich jedoch durch eine bessere Penetration von Coffein in den cerebellaren Extrazellularraum (STÅHLE et al., 1991).
Ergometrische Effekte
Beim Menschen führt die Coffeinaufnahme zu einer gesteigerten Ausdauerleistung während eines sportlichen Trainings mit submaximaler Intensität (KUROSAWA et al., 1998). Im Gegensatz dazu kommt es bei kurzen, sehr intensiven Trainingseinheiten nicht zu einer gesteigerten Muskeltätigkeit (GRAHAM u. SPRIET, 1991). GRAHAM et al. (1994) vermuteten, dass eine durch Coffein induzierte Adrenalinfreisetzung aus der Nebenniere die Lipolyse des Fettgewebes anregt, so dass die Konzentration der freien Fettsäuren steigt. Der Muskel nimmt diese als Energiequelle auf. Auf diese Weise wird Glykogen gespart, was zu
einer längeren Ausdauer bis zur Erschöpfung führt (GRAHAM et al., 1994). Die Wirkung wird in Abbildung 4 verdeutlicht.
Abb. 4: Wirkung von Coffein auf die Nebenniere (nach GRAHAM et al., 1994)
KUROSAWA et al. (1998) stellten fest, dass bei Pferden, die extremer sportlicher Anstrengung ausgesetzt sind, intramuskulär appliziertes Coffein eine leistungsfördernde Wirkung ausübt. Durch die Stimulierung des zentralen Nervensystems und der damit in Verbindung zu bringenden Erhöhung von Adrenalin und Noradrenalin kommt es zu einer gesteigerten Herz- und Atemfunktion.
4.4 Einsatz als Arzneimittel
In der Veterinärmedizin findet Coffein als Therapeutikum keine Anwendung mehr. Es ist weder ein für die Veterinärmedizin zugelassenes Handelspräparat auf dem Markt, noch besteht ein Therapienotstand, der den Einsatz eines Humanpräparates für Tiere rechtfertigen würde.
In der Humanmedizin kommt Coffein neben der reinen Anwendung in Tablettenform (Coffeinum 0,2 g Tabletten) oder als Coffeincitratlösung auch als Kombinationspräparat mit Digitalis oder nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs), wie z.B. mit Acetylsalicylsäure, zum Einsatz. Die Anwendung von Coffein als Adjuvans von NSAIDs begründet sich darin, dass Coffein als Adenosinantagonist den Einfluss von Adenosin als Entzündungsmediator in der Entzündungskaskade hemmt. Die peripheren Entzündungssymptome werden somit reduziert (NEHLIG et al., 1992). Weitere durch Coffein induzierte Wirkungen, wie die Vasokonstriktion der cerebralen Gefäße oder die Hemmung der Einwanderung neutrophiler
COFFEIN NEBEN-
NIERE Adrenalin GEWEBE FETT-
freie Fettsäuren
Fette ↓ Glykogen
Energie MUSKEL
Leukozyten werden ebenfalls in diesem Zusammenhang genannt (SAWYNOK u. YAKSH, 1993).
Ferner wird Coffein beim Menschen zur Behandlung der idiopathischen Apnoe bei Neugeborenen mit einer Dosierung von 20 mg pro kg Körpergewicht eingesetzt, da es im Gegensatz zu Theophyllin trotz cerebraler Vasokonstriktion die Blutflussgeschwindigkeit im Gehirn nicht beeinflusst (NEHLIG et al., 1992). Dies ist, wie bereits erwähnt, auch ein Grund für den häufigen Einsatz von Coffein bei der Therapie von migräneartigen Kopfschmerzen.
5. Theobromin
Schokolade, für deren Herstellung sowohl der Samen als auch die Schale der Kakaobohne verwendet werden, zählt zu den Nahrungsmitteln mit dem höchsten Theobromingehalt. Dieser variiert jedoch je nach Schokoladensorte. Dunkle Schokolade mit einem höheren Anteil an Kakao weist einen durchschnittlichen Theobromingehalt von 630 mg pro 100 g auf, während dieser in Milchschokolade bei 180 mg pro 100 g liegt. Kakaobohnen und Kakaoschalen weisen den höchsten Gehalt an Theobromin auf (1,5 bis 3 % bzw. 0,7 bis 1,2 %). Es findet sich in Spuren auch in Teeblättern, Kaffeebohnen, Cola-Nüssen und Mate (EAB, 2006).
5.1 Chemisch – physikalische Eigenschaften
Bei Theobromin handelt es sich um ein 3,7-Dimethylxanthin mit der chemischen Summenformel: C7H8N4O2 (MERCK INDEX, 2001). Das Molekulargewicht dieses Dimethylxanthins beträgt 180,16 g/mol und der Schmelzpunkt liegt bei 357 ºC (MERCK INDEX, 2001). Die geruchlose, kristalline Substanz weist sehr schwach basische Eigenschaften mit einem pKs1 < 1 auf, stellt aber auch eine schwache Säure dar (pKs2 = 10).
Die Löslichkeit von Theobromin ist schlechter als die von Coffein, wobei sich 1 g Theobromin in 2000 ml Wasser und in 2220 ml 95 %igen Alkohol lösen. In Ether, Benzol oder Chloroform löst es sich gar nicht. Bei der Komplexbildung mit Natriumacetat oder aber Natriumsalicylat entsteht ein stark hygroskopisches Pulver, welches CO2 aus der Luft adsorbiert.
